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重组球形红细菌5-氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性

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重组球形红细菌5-氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性重组球形红细菌5-氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性 重组球形红细菌5-氨基乙酰丙酸合酶同工 酶hemA和hemT的特性 ISSNl0O7—7626 CN11-3870/Q 中国生物化学与分子生物 ChineseJoumalofBiochemistryandMo— l— ecularBi— o— l 2005年6月 21(3):369,375 重组球形红细菌5_氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性 王俊卿,张肇铭 (山西大学生命科学与技术学院,太原030006) 摘要将编码光...
重组球形红细菌5-氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性
重组球形红细菌5-氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性 重组球形红细菌5-氨基乙酰丙酸合酶同工 酶hemA和hemT的特性 ISSNl0O7—7626 CN11-3870/Q 中国生物化学与分子生物 ChineseJoumalofBiochemistryandMo— l— ecularBi— o— l 2005年6月 21(3):369,375 重组球形红细菌5_氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性 王俊卿,张肇铭 (山西大学生命科学与技术学院,太原030006) 摘要将编码光合细菌Rhodobactersphaeroides5一氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)的同工酶基因hemA, hemT转入E,coli中进行高达,并将高表达的同工酶进行分离,纯化.纯化的hemA是可溶的,并 具有催化活性,而hemT大部分是不溶的,且在体外条件下无活性,与 其它重组ALAS相比,R. sphaeroides的hemA活性表达需PLP作为催化因子,除去PLP或用 硼酸钠破坏与PLP的连接,hemA 活性下降9o%.hemA—PLP的紫外.可见光谱分析表明hemA与PLP 之间形成一个醛亚胺键,而hemT 与PLP之间未形成该键.hemA对修饰组氨酸,精氨酸,胱氨酸残基的 试剂很敏感,对可切割Argl51 和Ser152的类胰蛋白酶也很敏感,PLP也不能阻止该酶的切割作用, 抗血清试验表明,hemA,hemT 的抗血清均可与小鼠的AlAS杂交,并都有一个抗原决定簇. 关键词Rhodobactersphaeroldes,5.氨基乙酰丙酸合酶,hemA,hemT 中图分类号Q78,Q55 CharacteristicsofRecombinedRhodobactersphaeroides 5-AminolevulinicAcidSynthaseIsoenzymeshemAandhemT WANGJun—Qing,ZHANGZhao—Ming (Collegeof蛳 ScienceandTechnology,Shan.xiUniversity,Taiyuan030006,Ch/na) AbstractAsplantgrowthregulator,biogradablenaturalherbicide,andinsecti cideandphotodynamicanti— cancerdrugaswell,5一aminolevulinicacid(ALA)hasavarie哆0f印 plicationandiSsynthesizedby condensationofglycineandsuccinylCoA.isreactioniScatalyzedbyALAsy nthase(ALAS)isoenzymens hemAandhemT.TwogenesofhemAandhemTfromRluntobactersphaeroideswerecloned,respectively.and allowedthemhighexpressionginE.coli.eover.expressedisoenzymeswereisolatedandpurified.Isolated hemAWassolubleandcatalyticallyactivewhereashemTWasinsolubleandfailedtoshowanyactivityexvivo. IncommonwithotherALAS,therecombinedR.sphaeroideshemArequirespyrldoxal一5一phosphate(PLP)asa cofactorforcatalysis.RemovalofthiscofactororreductionthePLP.hemAcomplexwithsodiumborohydride resultedin90%reductionactivityoftheenzyme.Ultraviolet—visibleabsorp tionspectnunwithhemAsuggested thepresenceofaldiIlliBelinkagebetweentheenzymeandPLPthatWasnotobservedwhenhemTincubated ththecofactor.HemAWasfoundtobesensitivetoreagentsthatmodifyhistidine,arginine.cysteineamino acidresiduesandtheenzymeWasalsosensitivetotrypticcleavagebetweenArgl51andSer152inthepresence andabsenceofPLP.Antiseratestingindicatedthatalloftheenzymeshaveconservedepitopes. KeywordsRhodobactersphaeroides,5一 aminolevulinicacidsynthase,hemA,hemT 5一氨基乙酰丙酸(ALA)是四吡咯生物合成的起 始分子.在真核细胞和光合细菌的紫非硫细菌中, ALA是在ALA合酶(ALAS)催化下合成的.对酶机制 及合成ALA所需的甘氨酸,琥珀酰CoA,磷酸吡哆 醛(PLP)浓度文献都有详细报道,静息状态下,ALAS 通过内在醛亚胺键在活化位点与PLP结合,然后 PLP与甘氨酸结合成外在醛亚胺键….在许多关于 酶催化反应机制中,有关于立体化学特性的报道.结 合甘氨酸是Pro-R位点的首次去质子化,然后在脱 收稿日期:2004-06.21,接受日期:2(104-09.16 国家科技部攻关项目(No.2001BA54OC) 联系人Tel:(0351)7011409,E-mail:wangjq@s)【LI.edu.ell Received:June21,2004-;Accepted:September16,2O04 SupportedbyNationalResearchFoundationofMinistryofScienceand TechnologyofChina(No.2001BA54OC) c0frespIIldingauthorTel:(0351)7011409,E-marl:wan~q@sxu.edu.~I1 370中国生物化学与分子生物2l卷 羧酶催化下与琥珀酸缩合,脱下的C再与反应起始 脱去的氢发生质子化?2].哺乳动物体内ALAS有2 个同工酶,分别由2个基因编码,其中之一是红细胞 特有的,另一个存在于许多组织中,是一种普遍形式 酶.在哺乳动物体内,ALAS作为合成反应的第一个 酶,受许多机制的调控.例如,有报道认为血红素会 抑制ALAS基因的转录,是肝脏酶的反馈抑制剂,而 红细胞mRNA基因的上游铁应答因子则对红细胞血 红素有调节作用. 与哺乳动物不同,原核生物除球形红细菌 (Rhodobactersphaeroides)外,ALAS只有一种酶形式. Rhodobactersphaeroides的ALAS有2个同工酶,分别 由hemA和hemT基因编码.在ALAS催化合成的 产物的基础上合成4种四吡咯衍生物:叶绿素,血红 素,类胡萝卜素,钴铵素.有趣的是这2个编码的基 因位于不同的染色体上:hemA位于3O46kb染色体 上,负责大部分组织的四吡咯合成,hemT位于914 kb染色体上,主要在红细胞对血红素需求增加时发 挥作用[s1. 从衍生型R.sphaeroides中分离得到少量的 ALAs,有人也曾对纯化后的ALAS同工酶色谱峰进 行分析,所有结果都预示这两个基因分别编码一个 功能性酶J.最近还有关于hemA和hemT的基因平 衡性的报道,以R.spheroides2.4.1基因衍生物杂交 探针进行R.sphaeroides检测,未发现hemT基因,另 有2个hemA和hemT基因均未检测到,这些矛盾 性结果使我们无法将过去的研究结果与现在的 ALAS基因研究统一起来. 本实验主要就R.sphaeroidesALAS同工酶 hemA,hemT高表达进行了研究,并在重组hemA, hemT纯化的基础上,对重组hemA和hemT的生理特 性进行了分析. 1材料与方法 1.1质粒与菌种 菌种Rhodobactersphaeroides,质粒扩增载体E. coliTB1,表达载体JM101.均以Luria—Bertmli培养基 (加入以下抗生素:四环素1t~g/mJ,链霉素50g/mJ, 奇霉素50t~g/mJ,卡那霉素25t~g/mJ)培养. 1.2质粒pAl9.pT18的构建ALAS的两个同工 酶hemA和hemT的PCR扩增以pUC19,pUC18为载 体,据NCB1GenBankR.Capulatus,B.japonicum, R.pa~ustris,G.gallusAIAs氨基酸序列同源性分 析,设计引物序列.hemA引物5’-GGAATTCTCA GGCAGACGAACATGGAC.3和5GAGGTCGGCGAGCT CGGCCTCG-3.hemT5’-GGAATTCAGGAGCCCGCC TCGA.3和5一GGATCCATGGAGTYCTCTAG-3(购自 Promega公司,斜体部分表示酶切位点).扩增的 hemA,hemT产物分别用EcoRI,SacI和BamHI 酶切并分别连接到质粒pUC19,pUC18,得到重组质 粒pA19和18. 1.3hemA.GST,hemT-GST融合多肽的质粒构建 将pUI10141224bp的片段(编码170 407氨基酸残基)转入pGEX-3X的BarnH工位点,得 到pUI1996A,从而得到hemA.GST融合蛋白.将 pUI20736766bp的NaeI片段(编码79—304氨基 酸残基)转入pGEx一3x的BamHI位点,得到 pUI2073A,将hemT与GST融合,表达,并通过抗 GST—IgC和抗hemT血清免疫印迹分析检验. 1.4ALAS的纯化和高表达 1.4.1带有质粒pA19和pT18的JM101在Luria- Bertani培养基(含60tcCmL氨苄青霉素)上4~C过 夜,离心,收集细胞,悬浮于20mmd/L磷酸钠缓冲 液(pH7.0)(0.5mmd/LPLP,2mmol/LEDTA,10%甘 油,5mmol/L2一巯基乙醇),再加入100tmaol/L苯甲 基磺酰氟,超声波破碎,15000g离心,收集上清液. 将上述可溶性提取物硫酸铵处理(W/V:30%),加入 裂解缓冲液,透析12h(透析液用缓冲液预平衡后用 SephacrylS-200过滤),再通过DEAE离子交换柱,用 500mmol/LNaC1缓冲液洗脱,重悬浮于20%甘油缓 冲液一20~C保存备用. 1.4.2无RNA蛋白提取液制备在LB上培养一 定时间,至A60D为0.8,1.2,收集,离心,悬浮于含10 mmol/LKC1,50mmd/LHEPES,10mmol/LE叽,5 mmol/LDrIT,20%甘油混合液中,超声波破碎, 100000gN心90min,取上清液经DEAE一纤维素过 滤柱(100mg蛋白每m1)过滤,之后用含500mmol/L KC1缓冲液反复冲洗,通过透析法分离蛋白和RNA, 所用缓冲液:10mmol/LKC1,20mmol/LHEPES,10 mmol/LMgCh,3mmol/LIYlT,10%甘油.SDS.PAGE蛋 白测定依据l_aemmli法,用SephacrylS-200测定. 1.5重组ALAS活性分析 1.5.1取透析得到的蛋白提取液200ml于10 mmol/L乙酰丙酸(pH7.0),10mmol/LPLP,2mmol/L 琥珀酰CoA,0.3ci[Hc].甘氨酸(3.4mmol/L)混合 液,30~C培养60min,HPLC测定相应的吡咯和AL 含量. 1.5.2取透析得到的蛋白提取液200ml,于10 旃3峨l传卿等:碹琳形红封?萤5-铽基乙酞J髓舟酶【.静h,’mAflihurr-T的特性 Illlt)[JJ/L乙酰眙l1H7(】)10mmol/__PLP3rlm~)l/I NADPI-I,2lIl『l_--I/1A_rI):0LIPlNa.dn,O.5ci[(::一十{‘氨 陵f34『lll…Ill)混合被.30”Ii培养60i/lin,之后加人J I『1I10%(W/V)SDS翻l200.1llIrnltml/1拧檬酸,停止 反应,加热沸腾5hi[it.111l』删定州Mdri tlemT的细胞浸提液束植州到A1 . PA(:[纯化后.发现餐『L【1溶.主要与膜碎片结 舟在一起.将碎片溶于6mol/t尿素,|I_陈盘变眭刹 . henfl术沉淀.对可溶]lert([的活性分析鹾叫. 酶恢复了催化能力.放至少存伴外条件下测小到酶 活性.住怵l,由于pTl8可与E.mlihei菌株 sAll{互补.救有活代.1IJ.通上=』=抗IliT抗m清对 可溶性酶逊{1测定兑明.其功能酶含量很低,除 提高蛋白’量.大约从1LE”,liJM’?8?可/卉 离剐l0tllgh?1fr.b;D5一P4(纯化后,吖为44k【】. 由于henri纯化后重折叠失啵,故试采取菌 372中国生物化学与分子生物21卷 株低温培养,伴随蛋白的表达及厌氧生长等来提高 ALAS活性,但各种方法效果均不显着. 2.3hemA的活性分析 2.3.1E.coliJMA19纯化得到的hemA最终活性为 13U/rag,M为110000?10000与其它有关四吡咯合 成中酶活性的报道一致_3].但其活性低于曾报道的 R.sphaeroides(130U/rag)和重组小鼠的ALAS活性 (145U/rag)E3,101.与R.sphaeroide的差异可能是菌株 的区别,或是由于从野生型分离的酶带有激动剂. 2.3.2PIP对hemA表达的影响PIP的存在对 hemA活性维持是必需的.如果水解除去PLP或 NaBI-t,断开PLP与酶之间的希夫碱链,hemA的活性 下降95%,Fig.2A表示PLP的存在对hemA紫外.可 见吸收光谱的影响.菌株的紫外一可见吸收光谱的影 响.纯的脱辅基hemA(游离PLP)吸收峰在280nlTl, 而当培养基中加入100p.mol/LPLP时,完整hemA在 430.5nln处出现第二吸收峰,这是辅助因子的醛基 与蛋白质的氨基酸残基之间形成了醛亚胺键的典型 吸收峰模式,此外在320,330nln之间有一个吸收 峰波动,这是溶液中醛亚胺水合形成的.游离PIP溶 液峰值在326—380i’lln,是PLP的醛基的特点?. 完整hemA加入1mmmol/L甘氨酸培养使吸收 峰后移到422i’lln,这是由于末端PIP与甘氨酸形成 醛亚胺键.重组大鼠红细胞AIAS也有相似的表现. 吸收峰波动出现在可见光之前的320nrfl处,并随甘 氨酸浓度由0.1mmol/L增大到1.0mmol/L而消失. 加人0.5mmol/L琥珀酰CoA不会引起峰值的移动. 2.4hemT的光谱分析 hemT(0.5mg/m1)加人100p.mol/LPLP培养, 279,320,388nln处有吸收峰,如Fig.2B未看到醛亚 胺键引起的吸收峰波动,其中320,388nln处的吸收 峰是PLP在pH7.2溶液中的特性.突变的大鼠红细 胞ALAS(K313H/G/A)也缺乏与PLP形成醛亚胺键 的能力,因而也不能催化ALA合成_l引.其吸收光谱 与本实验hemT相似.hemT无表达活性是由于不能 与PLP结合,可能是由于它不能重叠成四级空间构 型的缘故. 2.5hemA的生理特性分析 2.5.1胰蛋白酶降解特性分析同源脱辅基hemA 加人类胰蛋白酶培养2min(酶/hemA为1/100), SDS.PAGE测定,hemA主要片段为29kD,其氨 基酸残基在胰蛋白酶溶液中不会进一步降解,且对 ALA合成无催化活性,即使通过与PIP或其它底物 缩合也不能改变胰蛋白酶的酶切位点.二级结构显 (A) (B) 0.4 4o0 /nm 400 /am 飚.2Ultraviolet—visibleabsorbaneespectraofhemAandhemT (A)Theultraviolet—visibleabsoiptionspectraofapo-hemA(solid line)andholo-hemA(hemA+0.1mmol/LPLP,dashline)were eompa~over250,500rim; (B)Theultraviolet-visiblespectrumofhemT(dashline)n日目Jred inthepresenceof0.1mmol/LPliscomparedwithasolutionof Pl(solidline) 示酶切位点是取决于溶剂的,似乎是随机的.hemA N末端序列分析结果表明,其N端氨基酸序列为 SGTEKHIKK(为原始结构152,160的氨基酸残基序 列),表明ArglS1为此段从Ser152到C端的酶切位 点.曾有报道在大鼠ALAsN端存在一个PIP的结 合位点,可以推测在C端也存在一个类似序列. 2.5.2氨基酸修饰剂对hemA的修饰作用DEPC 在pH7.2时对组氨酸有特异的修饰作用.纯酶在 pH7.2时加入1mmol/LDEPC活性会下降50%,在 pH8.0时,0.5mmol/LDEPC也可使活性下降50%, 还不能确定在pH为多大时DEPC会修饰赖氨酸和 精氨酸.Fig.3A是DEPC修饰使hemA失活的时间曲 线图.DEPC失活的hemA通过加入羟胺而恢复 (Table2).这说明DEPC介导的hemA失活是由于对 组氨酸残基的咪唑基修饰的结果. DEPC处理前先用甘氨酸或PLP预处理,hemA 仍然失活(Table2),说明甘氨酸和PLP对hemA的失 活没有保护作用,它们的变形作用使DEPC的修饰 ou暮eosq《 如O O u芒墨J0苎《 第3期王俊卿等:重组球形红细菌5.氨基乙酰丙酸合酶同工酶hemA和hemT的特性 02.55.07512520.0 f/h 02.55.07.5125200 ,/h .3Effectofdifferentconcentrationofaminoacidmodifying reagentsonhemAapo-hemAwereincubatedwithdifferentreagents for20minandtheenzyll~were~ured. (A):DEPC(0,3mmol/L)mmol/L;?_0.5 mmol/L;—1.r_lmmol/L;卜2mml/L;—一3mmol/L. (B):Butanedione(O,10mmol/L)mmol/L;?_0.25 mmol/L;---Ak-1mmol/L;—o,3mmol/L;_*_lOmmol/L. (C):NEM(O,0.1mmol/L)?_0mmol/L;_?_0.Olmmol/L; —?_o.O25mmol/L;—(卜_0.05mmol/L;—1o.1mmol/L 作用更活化,相反,用100t_tmol/L琥珀酰CoA可保护 DEPC对hemA的失活作用.R.sphaeroides的ALAS 原初序列中有3个组氨酸位点:142,217,379,其中 任一位点都可能和琥珀酰CoA结合.也有报道认 为,组氨酸残基与底物作用对酶催化活性很重要,大 多数琥珀酰CoA合成酶作用位点都有一个胱氨酸 残基”]. 丁二醇对精氨酸残基特异性修饰形成一个环状 衍生物.Fig.3B是丁二醇对hemA的失活时间曲线, 琥珀酰CoA和甘氨酸都不能对丁二醇失活起到保 护作用.PLP(100t_tmol/L)可提高hemA对丁二醇的 敏感性,可能是PLP对hemA的转化增大了试剂与 精氨酸结合的可能性,在ALAS的原初序列中有7 个不同的精氨酸位点,精氨酸也可与其它PLP依赖 Table2Effectofaminoacidmodifyingreagentsontheactivityof AI.AS ~qlilloacidmodifyingreagents Enzymeactivity IemaiIliI(%) Control 3.0mmol/LDEPc 30mmol/LDEPC4-05mmol/Lglycine 3.0mmol/LDEPC+0.1mmol/LsuccinylCoA 3.0nmaol/LDEPc4-0.1mmol/LPIJP 3.0mmol/LDEPC+0.8mmol/Lhydrosylamine 1.0mmol/Lbutanedione 1.0mmol/Lbutanedione+0.5mmol/Lglycine 1.0mmol/Lbutanedione+0.1mmol/LsuccinylCoA 1.0mmol/Lbutanedione4-0.1mmol/LPLP O.O25mmol/LN—ethy]maleimide(NEM) O.O25mol/LNEM+O.5mmol/Lglycine O.O25mmol/LNEM+0.1mmol/LsuccinylCoA O.025mmol/LNEM+O.1mmol/LPIJP 1.5mmol/Liodoacetamide(IA) 1.5mmol/LIA+O.5mmol/Lglycine 1.5mmol/LIA+0.1mol/LsuccinylCoA 1.5mmol/LIA+O.1mmol/L.PIJP 性酶的PLP的磷酸基团及羟基基团作用. 还原性胱氨酸残基对R.sphaeroides的AIAS有 活化作用,但要求硫化物分子量很小.Fig.3C是嗜硫 的NEM和认失活的重组hemA的失活时间曲线.说 明酶对碱敏感,且酶对NEM比认敏感,NEM在很低 的浓度下就可使hemA完全失活,这是其它试剂都 不可能的.PLP,甘氨酸预处理对NEM或IA的失活 无保护作用,但100pxnol/L琥珀酰CoA则具有完全 的保护作用.原初ALAS序列中有两个不同的胱氨 酸位点:52,201,其中至少有一个对琥珀酰CoA有结 合和催化作用. 2.6hemA,hemT的抗血清试验 为了确定hemA,hemT的体内表达水平,需确定 各自的抗体蛋白.可得到hemT的抗血清,但纯hemA 的合适抗血清还没有,为了克服这个困难,将hemA 与GST融合纯化后,融合蛋白可作为抗原来产生合 适的hemA抗体. Fig.4A是抗hemA血清和GST-hemT融合蛋白, hemA抗血清可与未用GST-融合的hemT进行杂源性,R.sphaeroides 与小鼠ALAs的同源性 为:hemA48%,hemT49%.抗血清的杂交试验结果 说明它们不适于特异调控R.sphaeroides的同工酶 体内表达,可以肯定每种血清都与它们的抗原有很 高的同源性.利用血清对hemA,hemT高表达产物的 溶解性进行试验,发现hemA高表达产物的粗提液 可分为可溶,不溶两部分,hemA的绝大部分是可溶 的,部分是不可溶的,hemT粗提液的大部分是不可 溶的,部分是可溶的. 飚.4Crossreactivityofanti—hemAandanti-hemTantiseraby Westernblotting (A)1:PurifiedhemA; 2:WholecellsofaninducedpUI2073A(overexpresstheGST-hemT polypeptidefusion);primaryantibody,anti-GST-hemAantisera; secondaryantibody,goatanti-(rabbitLsG)conjugatedwithalkaline phosphate; (B)1:WholecellsofallinducedcultureofpUI2073A(over expresstheGST-hemTpolypepfidefusion); 2:PurifiedhemA;pmaryantibody,sec0antibody,goatanti- (rabbittsG)conjugatedwithalkalinephosphate; (C)1:Anti—C6”T-hemAantiseraWaSusedasthep,imaryantisera, withgoatanti-(rabbitLsG)conjugatedwithalkalinephosphateused asthesecondaryantibodyagain或O.5,ttgpurifiednlouseAIAS; 2:Marker; (D)1:Anti—GST-hemTantiserawasusedasthe叫maryantisera, withgoatanti一(rabbitIsG)coougatedwithalkalineph~,,hateused asthesec0nantibodyagaiO.5,ttgpurifiednlouseALAS. 2:Marker 3讨论 以E.coli为R.sphaeroidesALAS同工酶宿主载 体进行高表达和纯化为进一步的生化分析提供了足 够的蛋白.但相对大量的蛋白产物阻碍了酶的晶体 色谱分析的可能.本实验的hemA,hemT的生理学特 性分析结果与有些报道很相似,hemT在体外条件下 无表达活性,这似乎是纯化或折叠的方法问题,而并 非缺乏生化因子.重组hemA具表达活性,且纯化后 由于除去抑制剂而使活性提高,但hemA生理活性 是PLP依赖性的,与其它ALAS同功酶的报道一致, 水解或破坏PLP与酶的连接,酶活性显着下降.胰蛋 白酶降解反应,氨基酸修饰反应和保守序列分析表 明,ALAsN端和C端都有可能存在PLP的的结合位 点,这些位点是催化,结合位点,对修饰组氨酸,精氨 酸,胱氨酸残基的碱性试剂很敏感.氨基酸修饰反应 和保守序列分析表明有一个代表性位点是催化及底 物结合位点.hemA,hemT抗血清都不能与对方的同 功酶的抗原杂交,但都能与小鼠ALAS抗原杂交,这 说明ALAs存在一个保守的抗原决定簇立体结构. 近年来有许多关于ALA作为高效,环保的光动 力除草剂,杀虫剂和癌症,肿瘤的光动力治疗剂的报 道l1?j.ALAs是ALA合成的限速酶,从本试验可以 看出,RhodobactersphaeroidesALS的2个同工酶中, hemA经重组后,高表达产物是可溶的,提示我们通 过将hemA导入E.coli进行高表达,构建高产基因 工程菌(避免光合细菌培养所要求的严格的光照条 件)是ALA生物合成很有前景的一条途径,因而基 因重组菌表达活性,生理活性的调控将是进一步研 究的重点. 参考文献(References) IJordanPM.Thebiosynthesisof5-aminoIevulinicacidandits transformationintouroporph~nogenIl1.In:JordanPMed. B/osymhes/sofTetrapyrro/e.Elsevier,Arasterdam.1991:1, 66 2FerreiraGC,VajaoeyU,HafezO,HunterGA,BarberMJ. Aminolevulinatesynthase:lysine313isnotessentialforbindingthe pyridoxalphosphatecofactorbutisessentialforcatalysis.Prote/nSc/, 2001.10:1001,1006 3Ia曲aiA,JordanPM.Anexchangereactioncatalysedbydelta- aminolaevulinatesynthasefromRhodopseudomonasst,ho~.Biochem SocTruns,2001,29:299,300 4SuwantoA,KaplanS.PhysicalandgeneticmappingoftheRhodobacter sphaeroid~2.4.1genome:presenceoftwouniquecircular chromosomes.JBacter/o/.1989.171:5850,5859 5TaiTN,MooreMD,KaplanS.Cl帆iIlgandcharacterizationofthe5一 aminolevulinatesynthasegene(S)fromRhodobactersphaeroides.Gene, 1988.70:139,151 6TuboiS,KimHJ,KikuchlG.Occurrenceandpropertiesoftwotypes ofdelta-aminohvulinates趣.生殖性克隆意味着遗传性地创造出相同的生物体,治疗性克隆则旨在生长出 胚胎干细胞以进入与病人遗传标记相匹配的组织.科学家已建议干细胞作为手段来治疗许多疾病,包括帕金 森病以及糖尿病.2003年2月,韩国一个研究组利用一个新技术装置生长出克隆人胚胎,并达到囊胚泡阶 段.为了了解用类似的技术是否能得到非人灵长类克隆,从而开辟医学研究的可能性,美国研究组与韩国研 究组合作克隆了恒河猴.在韩国开展这方面的研究之后,美国该研究组开始用不成熟的卵进行研究,虽然大 多数研究者都是用成熟卵开始研究的.下一步,研究者用韩国研究者所开创的”压扁”(Squish)法将该卵的核 移出.正为”压扁”法的名称之意,研究者将每个卵细胞的核轻柔地挤压出来,而大多数研究者一般用真空针 将卵的核抽吸出来.然后,将从另一个恒河猴分离而得的供体核插入到每个卵中去.供体核或是来自卵巢中 围绕着卵的丘细胞,或是来自遍及全身的结缔组织制造的囊胚泡细胞.电休克或化学刺激促使该重组细胞起 始分裂出多细胞胚胎.这种克隆胚胎中有相当大的百分比可存活4天,此时克隆胚胎中形成干细胞.研究者 说,该克隆胚胎提供生殖性克隆的可能性极小.将135个这种克隆母猴胚胎移植到25个替代母亲中去,无一 产生成功的妊娠.该研究组将研究结果递呈至2004年12月6日的美国华盛顿哥伦比亚特区美国细胞生物 学会大会上去;并在2004年12月11日DevelopmentalBiology上发表.研究者说,他与大多数其他研究者是断 然反对人的生殖性克隆的,但克隆恒河猴的其他灵长类对研究人的治疗性克隆可能是有价值的系统,而且不 应该认为灵长类模型便是人的反映.研究者告诫,显然人与非人灵长类是密切相关的,而且以该系统可以获 得新知,但应该反对将动物实验产生的数据用于人. (李潇摘译自C.Brownlee:ScienceNews,Dec.11,2004,Vo1.166,P.371)
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