华法林的测定新方法及其与血清白蛋白相互作用研究
西北大学
硕士学位
华法林的测定新方法及其与血清白蛋白相互作用研究
姓名:张全彩
申请学位级别:硕士
专业:分析化学
指导教师:阎宏涛
20100601摘要
华法林属双香豆素衍生物,是常用的口服抗凝血药,可预防和治疗血栓栓塞性疾病。
本文建立了测定华法林的新方法;研究了华法林与血清白蛋白的相互作用;研究了环丙
沙星、氧氟沙星对华法林结合牛血清白蛋白的影响,并探讨了环丙沙星、氧氟沙星影响
华法林药效的机理。全文由以下几章组成:
第一章综述
概述了华法林的抗凝机理、影响其药效的因素,近年来国内外测定华法林的方法,
以及华法林与血清白蛋白的相互作用研究现状。并在此基础上提出了本文的
研究内容。
第二章
羟丙基..环糊精对华法林的荧光增强作用及其分析应用
研究了羟丙基..环糊精??对抗凝药物华法林的荧光增强作用,探讨了华法 林与.。的包合特性。并与一环糊精.对华法林的荧光增强作用和包合特性 进行了比较,结果表明?的荧光增强作用强于。基于的荧光增强 作用,研究建立了一种测定华法林的新方法。华法林在.?.浓度范围内与 荧光强度呈良好的线性关系,检出限为.?。此法应用于华法林钠药物的测定, 取得了满意结果。
第三章荧光猝灭法测定华法林
研究了华法林对聚乙二醇辛基苯基醚 .荧光的猝灭机理,并根据华法林 对 一荧光的猝灭作用建立了一种测定华法林的新方法。结果表明:华法林对 .荧光的猝灭为静态猝灭:华法林浓度在‘~巧?.范围内与荧光 猝灭强度呈良好的线性关系,检出限为.一?。该法简便、快速,用于华法林 钠药物的测定,结果满意。
第四章华法林与血清白蛋白相互作用的光谱法研究
采用光谱法进行了华法林与牛血清白蛋白、人血清白蛋的相互作用研 究。探讨了华法林对荧光的猝灭机理,测定了不同温度下华法林与的结合常 数和结合位点数,并根据热力学常数确定了两者的作用力类型。根据非辐射
能
量转移理论求得了华法林与、的结合距离。并用同步荧光光谱法研究了华法 林对、构象的影响。
第五章 荧光光谱法研究环丙沙星和氧氟沙星对华法林结合牛血清白蛋白的
影响
采用荧光光谱法研究了环丙沙星、氧氟沙星与牛血清白蛋白的相互作用,以 及两者对华法林结合的影响。结果表明:环丙沙星、氧氟沙星与结合形成了 复合物;环丙沙星、氧氟沙星的存在,使华法林与的结合能力增强。并讨论了
环
丙沙星、氧氟沙星影响华法林药效的机理。
关键词:华法林,光谱法测定,牛血清白蛋白,人血清白蛋白,环丙沙星,氧氟
沙星
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口
指导教师签名:幽墨毖:
学位论文作者签名:兹拿象
加/口年。乡月仁日 乃年口舌月肛日
西北大学学位论文独创性声明
本人声明:所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的
并表示谢意。 学位论文作者签名:确毪彩
油年 只西北大学硕士学位论文
第一章综述 弟一早 琢 殓
.
引言
华法林是香豆素类口服抗凝药,其化学名为.苯基丙酮.一羟基香豆素 结构式见图,是等量消旋异构体和对映体的混合物【。临床上用于预防和治
疗
血栓栓塞性疾病,如血栓栓塞性静脉炎、肺栓塞、心脏瓣膜置换术以及房颤
导致形成的
血栓等。抗凝过度与不足均能引起严重的并发症。临床上通过监测凝血酶原
时间
,来调整华法
,及国际
化比值
林的用药剂量。
王
图华法林的分子结构
迎.
药物进入人体一般都要通过血浆的贮存和转运,到达作用部位,发生药理作用。血
清白蛋白是血浆中含量最为丰富的蛋白质,它能与许多内源及外源性物质结合,起到存
储与转运的作用。开展药物与血清白蛋白的相互作用研究,不仅对于阐明药物的作用机
制、药代动力学以及指导合理用药具有一定意义,同时对于进行药物分子设计、开发新
药也具有重要的指导意义。因此,药物分子与蛋白质相互作用的研究已成为化学和生命
科学的热门课
之一。
.华法林的抗凝作用
..抗凝作用机制
华法林的化学结构与维生素相似,在体内与维生素相竞争,在形成凝血因子
的过程中阻止维生素返回到它的活性成分,使这些必须依赖维生素才能形成的凝
血因子、?、?、不能及时合成,从而起到抗凝血作用‘。口服华法林经消化道迅
速吸收,通过结合血浆白蛋白在体内循环,在肝脏内蓄积,几乎完全通过肝脏代谢清除。
..影响抗凝疗效的因素
华法林抗凝疗效受多种因素影响:年龄:年龄较大者对该药的清除率降低,较小
剂量即可达到抗凝要求吲。疾病:肝硬化、充血性心力衰竭等疾病,可致肝功能下降,第一章综述
制造凝血因子的功能受损,致使对华法林敏感性增加,抗凝作用增强:高代谢状态,如
发热和甲状腺功能亢进通过消耗凝血因子也增强华法林的抗凝效剽。维生素水
平:摄取维生素和富含维生素的食物可降低华法林的抗凝作用,这与依赖维生素
的凝血因子合成增多有关【。药物相互作用:阿司匹林等血小板抑制剂与华法林有协
同作用;水合氯醛、保泰松、甲磺丁脲等可置换与血清白蛋白结合的华法林,使其血浆
浓度增高,作用增强;巴比妥类诱导肝药酶,增加华法林的代谢,使其作用减弱;口服
避孕药增加凝血可使华法林作用减弱。中草药:许多含有香豆素、水杨酸盐和具有抗
血小板作用的植物,与华法林合用时能增强其抗凝作用,加重出血的危险性或显著增加
血栓栓塞性并发症的发生,如当归【、丹参【、大蒜、银杏‘等。
.华法林的测定方法
目前已报道的测定华法林的方法有很多,主要有荧光光谱法、高效液相色谱法、毛
细管电泳法等。
..荧光光谱法
华法林自身荧光较弱,直接测定灵敏度低。一般采用固相荧光、与环糊精形成主客
体包合物和能量转移敏化荧光的方式来提高其测定灵敏度【。
等【将华法林固定在交联葡萄糖 凝胶 .,直接测定
固相荧光强度。该方法用于水中痕量华法林的测定,检出限为.?,相对标准偏
差为.%,回收率在~%之间。
等四发现华法林与.环糊精形成包合物能显著增强华法林的荧光。基于此,
建立了.环糊精增强荧光法测定华法林的新方法。实验测得华法林与.环糊精的包合常
数为?~,线性范围为.??一,相对标准偏差为.%。该法应用于灌溉水中
华法林的测定,结果满意。
等‘根据一环糊精对华法林和溴敌鼠有不同的荧光增强效应,用二阶导数
同步荧光法测定了混合物中的华法林。
等】建立了一种顺序注射快速测定华法林的.环糊精增强荧光方法。该法利用
电脑控制顺序注射分析系统。将.环糊精和华法林依次分别注射到系统中,系统快速将
两者混合后立即进行
。该法测量时间短仅有,重现性好。浓度为.?‘
的华法林平行测定次,相对标准偏差为.%。华法林浓度在.~.?范围内与荧 光强度成线性,检出限为.?。该法己成功地用于水样品中华法林的测定。 西北大学硕士学位论文
掣】基于.甲基烟酰胺氯能与含有毗邻羰基的活性亚甲基的化合物反应, 生成强荧光物质,建立了测定华法林的新方法。应用于药片和血浆样品中华
法林的测定,
平均回收率分别为.%和.%。该法简单、经济、灵敏度高,适用于质量控制、 药物浓度监测以及药物生物利用度研究等。
等‘利用.元络合物体系,建立了测定华法林的能量转
移荧光敏化法。该法的灵敏度是直接测定华法林荧光法的倍。 ..高效液相色谱法
等【用液相色谱紫外检测法测定了血清中的华法林对映体。血清样品经乙酸
乙
酯萃取,氮气吹干,乙腈复溶后测定。色谱柱:一环糊精柱.,,流动相: 乙腈.冰醋酸.三乙酸铵//.,/咖,内标物:氧苯酮,紫外检测波长:。 .华法林、.华法林和氧苯酮的保留时间分别为.、.和.,华法林对映体的 线性范围为.?~。对含有.华法林和.华法林量均分别为、和 ?。的血浆样品进行定量分析,.华法林的相对标准偏差分别为.、.和 .%,.华法林的相对标准偏差为分别为.、.和.%。
黄英等四利用反相液相色谱紫外检测法测定了血浆中华法林浓度。血浆样品
经二氯
甲烷.正己烷/,/萃取、浓集等预处理后,于国产柱上,以甲醇.醋酸铵缓
冲液/,、,/为流动相分离,于波长处检测。华法林检出限为?一,线 .%.%,日间
性范围~?一,回收率.%.%,日内
.%.%。
等【 】采用液相色谱法测定了血浆中的华法林。色谱系统包括: 梯 度泵, 光电二极管阵列检测器, 自动进样器,和,
柱.
..,。流动相:甲醇/腈/水//,//一.%冰
醋酸/,/,流速:?,紫外检测波长:。华法林对映体的线性范围 均为.~岭?,一华法林的检出限为?,.华法林的检出限为?~。 等【采用液相色谱.电火花离子化质谱联用技术测定了血清中的华法林和杀
鼠
醚。血清样品经乙酸乙酯萃取后,在.柱 .,岬上进行分离测定。 流动相为醋酸铵缓冲溶液.甲醇/,~,流速为.?。华法林的检测离子 为/ ,杀鼠醚的检测离子为/
,线性范围均为..?~,检出限均为
.?~,华法林的回收率为.?.%,杀鼠醚的回收率为..%,日内和日间第一章综述 的相对标准偏差均小于.%。
等【】采用柱切换高效液相色谱法同时测定了人血清中华法林对映体及其代
谢
物一.羟基华法林对映体的浓度。用乙酸乙酯.氯仿/,/萃取血清中的上述物
质,
萃取物经预柱
.柱,,.清洗,在连有保护柱
.柱,.的分析柱 .柱,.分离测定。
.、磷酸缓冲溶液.
清洗和分离所用流动相分别为磷酸缓冲溶液.乙腈/,/, .,内标为双氯芬酸钠,紫外检测波长。华法林对映体的
乙腈/,/,
线性范围为~?,一华法林的日内和日间的相对标准偏差分别小于.%和 .%,.华法林的日内和日间的相对标准偏差分别小于.%和.%;.羟基华法林对 映体的线性范围为?~,.羟基华法林的日内和日间的相对标准偏差分别 小于.%和.%,..羟基华法林的日内和日间的相对标准偏差分别小于.%和 .%;华法林对映体和.羟基华法林对映体的检出限均为?~。该法适于华法林用 药过程中的监测。
..毛细管电泳法
等四考察了几种环糊精分离华法林对映体的效果,发现甲基..环糊精的分离 效果最佳,在此基础上,建立了分离测定华法林的毛细管区带电泳法。讨论了
值,甲
基..环糊精浓度,离子强度以及电压对分离效果的影响。在优化的实验条件
下,华法林
对映体内达到基线分离,检出限为.?.。此法已应用于人血浆中华法林对映 体的分离测定。
梁统等五用毛细管胶束电动色谱分析方法测定了血清中华法林的浓度。用二
氯甲烷
提取血清中华法林,.乙基一..甲苯基巴比妥酸为内标,操作电压,检测波长
,电泳缓冲液由硼酸盐、十二烷基硫酸钠和氯化钠组成。华法林检出限为
.?,线性范围?肛?~,日勾.%.%,日间.%.%。
梁统等【】用毛细管电泳法分离测定了血清中华法林对映体。电泳缓冲液由磷酸盐缓
冲液和甲基.环糊精组成,工作电压,检测波长。华法林的检出限为
..?一,线性范围为~?~。
等【冽用胶束电动毛细管色谱法.质谱联用技术测定了人血浆中华法林对映体。
,.为手性分离试剂,氯杀鼠灵为内标物。在最佳的实验条件下,华法林对
映体内达到基线分离,线性范围为.?.??一。实验还进行了质谱检测和紫
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外检测的选择性和灵敏度比较,结果表明前者优于后者。该法已成功的用于接受华法林
治疗的患者血浆中华法林对映体的测定。
除了上述几种方法外,亦有报道用超临界流体.串联质谱法【】、紫外光谱法【.、
极谱法【】、磷光法【’等测定华法林。
.药物与血清白蛋白相互作用的荧光光谱法研究
血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质,含量约为.?~,占血浆总蛋白的
%,提供了大约%的血渗透压【】。它能与许多内源及外源性物质结合,起到重
要
的存储与运输的作用,并且,与其它蛋白质相比,血清白蛋白具有分子量小、水溶性好、
稳定性高、易提纯制备等优点,所以在临床药物研究中一直将其作为模型蛋白。最常用
的血清白蛋白是人血清白蛋白 ,和牛血清白蛋白
,。
是由个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,分子量约为。是由
个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,分子量约为。和的三维晶体
结构均有三个类似的结构域【】:,,。每个结构域又含有、两个亚域结构,以
槽口相对的方式形成圆筒状结构,几乎所有疏水性氨基酸都包含在圆筒腔内部,通过疏
水作用聚集在一起构成疏水性腔。的氨基酸序列与的氨基酸序列有%的
相似性【,不同的是:分子中有个色氨酸残基,在氨基酸序列中分别位于
位和位,位色氨酸处于亚结构域,靠近分子表面,位色氨酸处于亚
结构域,靠近分子的内部;而只有个色氨酸残基,在氨基酸序列中位于位,
处于亚结构域。相比较而言,的位色氨酸所处微环境与的位色
氨酸所处的微环境非常类似四。
荧光光谱法是研究药物与蛋白质相互作用的一种有效方法。药物与蛋白质相互作用
后会引起药物自身荧光光谱或蛋白质自身荧光内源荧光光谱以及同步荧光
光谱的变
化。综合利用蛋白质和药物的荧光猝灭、荧光敏化、能量转移和实验条件的影响等方面
的信息,结合有关理论计算,则可提供作用机理、结合部位、结合常数和结合位点数、
作用力类型等药物与蛋白质相互作用的信息,推断蛋白质分子在各种环境下的构象变
化,从而阐明药物与蛋白质相互作用的结构与功能之间的关系。
..荧光猝灭机理
药物分子对蛋白质荧光的猝灭过程可分为动态猝灭和静态猝灭【。静态猝灭是药物第一章综述
和蛋白质在基态时生成不发荧光的复合物,从而导致蛋白质荧光强度降低的过程;动态
猝灭是药物和蛋白质的激发态分子之间的相互作用而导致的荧光猝灭过程。
动态猝灭过程遵循.方程:
它詈【“】
式中:、分别为存在和不存在猝灭剂时蛋白质的荧光强度;】为猝灭剂浓度;
为动态猝灭常数;&为双分子动态猝灭速率常数;;为无猝灭剂时荧光分子的平均
寿命,一般取‘。
通过总结发现,区分动态猝灭与静态猝灭可以通过以下方面来确定【。】:
改变温度实验动态猝灭依赖于扩散,升高温度导致扩散加快,故猝灭常数将
随
着温度的升高而增大;而温度升高可能引起复合物的稳定性下降,从而减小静态猝灭的
程度。根据方程作图,如果高温的斜率大于低温的斜率,则为动态猝灭;
反之,则为静态猝灭。
测量吸收光谱 由于动态猝灭只影响到荧光分子的激发态,因而荧光物质的吸收
光谱不发生改变;相反,基态复合物的生成往往会导致荧光物质吸收光谱的改变。
测量荧光寿命静态猝灭中,猝灭剂的存在不改变荧光分子激发态的寿命,即以
为猝灭剂存在时的荧光寿命;而动态猝灭中,猝灭剂的存在使荧光寿命缩短,砒
/。
比较值利用如求得,各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态
猝灭速率常数为...一,若求得的值远大于.?~,则此猝灭
过程为静态猝灭;反之,则为动态猝灭。
..结合常数和结合位点数
对于静态猝灭过程而言,假设蛋白质上存在个等同的独立的结合位点,可以用式
.计算其结合常数和结合位点数【加】:
口霄
.
等
式中:、分别为存在和不存在猝灭剂时蛋白质的荧光强度;【为猝灭剂浓度。以
./对作图,由直线斜率和截距可求得结合常数及结合位点数。
..结合部位
如前所述,血清白蛋白有个类似的结构域。用荧光法确定药物分子在血清白蛋白
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上的结合部位常用以下方法:
用具有己知特定结合部位的探针来确定部位
某些荧光探针与蛋白质不同区域有特异性的结合,根据药物加入后对荧光探针的影
响可以确定药物的结合部位。已知
的探针有:华法林、保泰松
等。
等。 的探针有:布洛芬、氯灭酸
的探针有洋地黄毒甙、一色氨酸?等。
通过非辐射能量转移理论求药物与蛋白质色氨酸残基之间的距离
蛋白质的内源荧光主要是色氨酸发出的。利用非辐射能量转移理论,可以
求出和蛋白质作用的药物与色氨酸残基之间的距离,由此推测药物与蛋白质结合的空间
部位【。根据非辐射能量转移理论,发生能量转移必须满足以下条件:一是给体
必须发荧光,二是给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱必须有一定的重叠,三是给体
与受体之间的距离不超过。非辐射能量转移效率,给体与受体之间的结合距离及
临界能量转移距离‰,给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的重叠积分之间有如
下关系:
. 、 ’
:具:一导
:
醚.×必一劬 .
.、
翟梨
?九从
其中:为未加入受体时给体的荧光强度;为给体与受体物质的量之比为:时,给
体的荧光强度;凡是能量转移效率为%时的临界距离;为介质折射常数;是偶
极空间取向因子;西为给体的荧光量子产率;九是给体在波长九处的荧光强度; 的
是受体在波长九处的摩尔吸光系数。对于,/、.、?.;对于,
/、.、?.。由式.采用矩形分割法可以求出两光谱重叠区域 的积分值,即可求出和。
..作用力类型
药物分子和蛋白质之间的作用力主要有疏水作用力、氢键、范德华力和静电
引力等。
等根据大量的实验结果,总结出判断蛋白质与药物主要作用力类型的热力学
规
律:、为疏水作用力;、为氢键和范德华力;、
第一章综述
为静电引力。在温度变化不大时,反应的焓变/可以看作一个常数,由结合常
数可
以求出反应的自由能变?:
?
.
然后根据式.和.分别求出?和:
. 、 。
百
‘ ’。
詈【亡一
?仉蝎
.
..药物分子对血清白蛋白构象的影响
药物分子与血清白蛋白作用时,常伴随蛋白质构象的变化。同步荧光光谱因具有简
化光谱、窄化谱带和减小光谱重叠等优点而常用来探讨蛋白质构象的变化。对于蛋白质
的同步荧光光谱,当激发波长和发射波长的间隔为执时只显示酪氨酸残基的荧
光,而执时仅表现出色氨酸残基的荧光‘‘。因氨基酸残基的最大发射波长与
其所处环境的极性有关,所以由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。若发射波长
红移,表明氨基酸残基所处环境的极性增强,发射波长蓝移则表明氨基酸残基所处环境
的疏水性增强。
..影响结合反应的因素
一些能与血清白蛋白结合的共存物质会影响药物与蛋白的结刽巧。如金属离子与
药物竞争,减小了血清白蛋白与药物的结合常数,一般减小/.%。但有些共存物
质的存在会提高某些药物与血清白蛋白的结合常数。此外,实验条件浓度、酸度、离
子强度和溶剂等也会不同程度地影响药物与蛋白质的结合。
.华法林与血清白蛋白相互作用的研究现状
对于华法林与血清白蛋白相互作用的研究国外已有很多报道,而国内鲜有报
道。
,等四用平衡透析法研究了华法林与的相互作用,测定了不同温度下
的结合常数、结合位点数和热力学常数。结果表明,华法林与的结合位点数为,
结合常数随着温度的升高而减小;作用过程是一个自发的放热过程;作用力为静电引力。
并根据华法林与之间存在强相互作用对华法林的一些药效特征作了解释。
等酬发现华法林可以猝灭色氨酸残基的荧光,同时自身的荧光敏化增强,
并且荧光峰发生了蓝移。研究表明两者发生了非辐射能量转移,华法林结合位点在
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的疏水部位。华法林与色氨酸残基之间的距离为.。
等四发现:当华法林与浓度比值较小时,.华法林在上的结合
能力比一华法林强;保泰松、布洛芬、非诺洛芬、甲苯酰吡啶乙酸和阿司匹林能将华
法林从其结合位点上置换下来;华法林与型的结合情况不同于型,但其
与这两种构象蛋白的结合都受氯离子的影响。
等【】用荧光光谱法研究了华法林与作用的平衡和动力学情况。紫外光谱
研究表明华法林的结合位点在的疏水区域,?和时的平衡常数分别为
.~、×一;华法林与的作用过程是微放热、强熵驱动过程,用停留
技术测出和。时的两者结合速率常数分别为..~、.~;利用
华法林与保泰松的竞争结合实验,测出。和?时华法林与的离解速率常数分
别为.~、。一。
等【利用停留动力学实验获得华法林与作用过程的动力学信息。实验发
现华法林与的相互作用分两步:第一步,扩散控制过程,此过程依赖于反应物的
净电荷;第二步,结合过程,包括活性华法林一中闯体的形成以及终态华法林.
复合物的形成。华法林与的结合要比与片段结合的慢,作者认为这是由
的空间位阻所致,并据此推测的结构不是扁椭球型而是型,且各域紧密接触。
活性华法林一中间体的形成受构象状态的影响,像.型转换。作者还讨论
了血清白蛋白.型转换对药物通过血清自蛋白介导运输通过细胞壁过程的作用。
等【】用迎头色谱法研究了华法林对映体在涂渍有的固定相上的热力学过
程。一华法林和一华法林结合在的同一区域,但.华法林的结合能力强,两
者的结合位点数随着温度升高都轻微增大。。时,两者的自由能变相似,但.华法
林的自由能变中熵的贡献多,表明.华法林的结合位点主要在内部,而.华法
林的主要在外部。这种结合模式,通过考察在不同、离子强度和有机改性剂条
件下华法林对映体在柱上的保留情况,得到验证。
等例用晶体学方法研究了华法林对映体与的相互作用。实验发现只有
一个华法林分子.华法林或.华法林结合在的亚域 内,两对映体
以相同的构像、相似的结合能力与作用。华法林与的作用力主要为氢键和静
电作用力。
等删研究了华法林与作用的立体选择性动力学。文中利用停留技术,记
录结合到上的华法林的荧光变化,进行结合动力学研究。不同的动力学特征表明:
第一章综述
.华法林.和.华法林一复合物的平衡构象是通过不同的机理形成的,且在
不同的缓冲、缓冲组成条件下均是这种现象。平衡结合测量结果表明结合状态的对
映体的微环境有差异。
位点,结合常数为
等们】发现只有一个华法林分子结合在的
.
一,并详述了华法林各组成部分所作用的氨基酸残基。根据等温热滴定实验结
果得出,华法林的酚基团所靠近的部位氨基酸残基,在华法林与结合
过程中从溶液中结合了质子,两者之间的离子对作用使得华法林的结合稳定。
生命体内固有的一些小分子和离子以及其它外源性物质对于华法林结合蛋白的影
响也有研究报道。等【】发现油酸能将华法林从其结合位点上取代下来。
等【研究了脂肪酸和十二烷基磺酸钠对华法林结合的影响。掣删用动力
学分析方法研究了磺胺类药物对华法林结合的影响。等【】研究和
存在时华法林结合的情况。等【删利用平衡透析法和荧光法研究了生理 条件下,乙醇对华法林结合的影响。等【】研究了乙醇、.丙醇和.丙醇对华 法林对映体结合的影响。
另外,华法林还被用作 探针来确定药物等在血清白蛋白上的结合部位。 等【以华法林和.色氨酸为探针确定了地高辛和醋酸地高辛在上的结合部位
不是
和
。亭】以布洛芬和华法林为探针确定了刚果红在上的结合位点为 。等【】以华法林、保泰松、.色氨酸为探针确定了头孢菌素类药物在上 的结合位点为
。等以布洛芬和华法林为探针确定了酮洛芬在上的结合
位点为
。亭以华法林和布洛芬为探针确定了孔雀绿在上的结合位点为 。
。等【】以华法林和布洛芬为探针确定了黄连素在的结合位点为 .选题依据和研究内容
由于作为华法林抗凝监测指标的和也存在缺点和不足【,因此,研究建 立简便、快速测定华法林的方法具有重要的实际意义。
当药物分子进入生物体后,通过血浆的贮存和运输,到达受体部位,进而发生
药理
作用。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白,因此研究血清白蛋白与
药物的相互
结合作用具有十分重要的理论和现实意义。
华法林的抗凝疗效受多种因素影响,如年龄、饮食、现有疾病和合用药物等,
这些
因素可致抗凝作用减弱或致严重出血。其中,药物相互作用是相当重要但常
被忽视的问
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题‘。研究华法林的药物相互作用,将会预防和减少许多不良反应的发生,
维护人们的
健康和生命,具有重要的现实和长远意义。
据上所述,本文开展了以下几个方面的研究:
研究比较了一环糊精一和羟丙基一一环糊精一.对华法林的荧光增强 作用,探讨了华法林与、.一的包合特性。在此基础上,建立了..增 强荧光法测定华法林的新方法,并应用于样品测定。
研究了华法林对聚乙二醇辛基苯基醚 .的荧光猝灭作用,并探讨了 荧光猝灭机理。在此基础上,建立了 .荧光猝灭法测定华法林的新方法,并 应用于样品测定。
用光谱法研究了华法林与牛血清白蛋圭和人血清白蛋白的相互作 用。探讨了华法林对荧光的猝灭机理,测定了华法林与的结合常数和结合位 点数,确定了两者的作用力类型。根据非辐射能量转移理论求得了华法林与、 的结合距离,并用同步荧光光谱法研究了华法林对、构象的影响。 采用荧光光谱法研究了环丙沙星、氧氟沙星与的相互作用,以及两者对华 法林结合的影响。同时探讨了环丙沙星、氧氟沙星影响华法林药效的机理。
第一章综述
参考文献
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第一章综述
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海南
大学学报自然科学版,,:.
第一章综述
【】周能,梁逸曾,王平.二氢氯噻与牛血清白蛋白的相互作用特征.分析试验
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】周秀清,程建华,孙磊,等.用光谱法研究异鼠李素与牛血清白蛋白的相互作
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几种金属离子对反应的影响.吉林大学学报理学版,,:. .,? ., ., . :
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【刘雪锋,李磊,方云.牛血清白蛋白.结合过程中盐酸小檗碱的变构效应】.
化
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第一章综述
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【】杨清波,焦丽萍.华法林抗凝应注意的问题】.临床荟萃,,:
西北大学硕士学位论文
第二章羟丙基..环糊精对抗凝药物华法林的
荧光增强作用及其分析应用
.
引言
华法林属.羟基香豆素类抗凝血药物,临床上用于预防和治疗静脉血栓、
肺栓塞、心脏瓣膜置换术以及房颤导致形成的血栓等【。华法林的抗凝疗效与其用药浓
度密切相关,因此,研究建立用于临床抗凝药物华法林及个体化用药快速测定方法具
有重要的实际意义。已报道的华法林浓度测定方法有二阶导数紫外光谱法【、胶束电动
色谱一质谱法【、高效液相色谱法【期、毛细管电泳法【等。.环糊精及其衍生物与药物分
子相互作用形成包合物,能极大的增强药物分子光谱测定灵敏度】。等四和 裴若会【分别报道采用.环糊精增强荧光光谱法测定了不同样品中的华法林,
但利用羟
丙基..环糊精增强荧光法测定华法林尚未见文献报道。
本文研究比较了.环糊精?和羟丙基..环糊精?.对华法林的荧光增强 作用,探讨了华法林与.、..的包合特性。在此基础上,首次建立了肿 增强荧光光谱法测定抗凝药物华法林的新方法,并应用于市售华法林药物的
测定,取得
满意结果。
.实验部分
..仪器与试剂
.型荧光分光光度计日本岛津公司;.型酸度计上海理达仪器厂; .集热式恒温加热磁力搅拌器郑州长城科工贸有限公司。华法林标准品美国 公司;天津市巴斯夫化工有限公司;?.西安敬业生物药物科技 有限公司;市售华法林钠上海信谊九福药业有限公司;芬兰奥立安集团。 .?以溶液
华法林储备液:准确称取.华法林标准品,溶解于
后,水定容至,配制成.?。的储备液,存放于冰箱中备用。使用时用 水稀释为.?。的标准溶液。
?和?溶液:准确称取一定量的和.?,分别配制成
.一?’的溶液。
.
.缓冲溶液。实验所用试剂均为分析纯,水为石英亚沸水。
第二章羟丙基..环糊精对抗凝药物华法林的荧光增强作用及其分析应用
.. 实验方法
准确移取一定量的华法林标准溶液于容量瓶中,分别依次加入. ..
溶液,. .磷酸盐缓冲溶液,用水稀释至刻度。静置后,室温条件下用
和 处测定其荧光强
的石英池,入射和出射狭缝均为,于
度。
.结果与讨论
..环糊精荧光增强效应
华法林在碱性介质中能激发荧光,其激发和发射波长分别为和。实验
分别测定了.、..存在下华法林的荧光光谱,结果如图所示。华法林的荧光
强度有不同程度的增强,但其荧光发射波长基本不变,说明华法林与环糊精形成了包合
物。两种包合物中,..的荧光增强作用更明显。在环糊精存在下,由于其包合作
用,使进入空腔内的华法林分子的运动自由度以及分子的弛豫效应大大降低,阻止了碰
撞失活,减少了非辐射跃迁的几率,并且环糊精空腔所提供的非极性微环境,使华法林
分子的荧光单重态得到保护和屏蔽,减少了氧等猝灭剂的荧光猝灭【,故华法林的荧光
强度显著增强。
图华法林在环糊精介质中的荧光光谱
.华法林荧光光谱.存在时华法林荧光光谱?存在时华法林荧光光谱 疵.?’;吣,.×一?.
西北大学硕士学位论文
..包合特性探讨
假定环糊精分子和华法林分子形成:包合物,采用直接荧光法改进的 ?方程【】,可以分别求得华法林与和..的包合常数。
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式中,、分别表示有无?或.存在时华法林的荧光强度;为华法林的 起始浓度;【为或?.的浓度;和分别为仪器常数和包合物的荧光量子 产率;为包合常数。
以/对/作图,得一直线,结果如图所示。华法林和.、.. 包合体系的线性回归方程分别为/?弓/?‘..;
/?一/?.厂.。由直线的截距与斜率求得包合常
数分别为?。和?~。图良好的线性关系证明了华法林与.和一 形成了:包合物。
图华法林.环糊精的双倒数曲线
.
.?和?比较而言,前者较后者分子在腔口有羟丙基的存在,这对客体的包 合发生两种作用:一方面,因腔口所接的基团遮盖了腔口,增加了腔内的疏水
性,从而
使得进入空腔的客体受到更好的保护。另一方面,修饰基团的空间位阻效应
又阻碍较大
客体被包合,但一般可提高测定的选择性【
。本实验中,尽管..的包合常数小于
,但是..的荧光增强因子/大于。的/..,环糊精浓度为
.一?。时,即..对华法林的荧光增强作用强于.,这表明空腔更强 第二章羟丙基.环糊精对抗凝药物华法林的荧光增强作用及其分析应用 。
的疏水作用是..的荧光增强效应的主要作用【
考虑到..更好的荧光增强效应,较低的粘度和较大的溶解度【】,因此选用 ..为测定华法林的荧光增强剂。
..体系荧光强度的影响因素
...
一.浓度的影响
实验考察了加入..浓度的影响。结果表明在.?.范围内,随 着..浓度的增加,华法林的荧光强度随之增强,但当..浓度大于 .一?。后,华法林的荧光强度增强缓慢如图所示,实验选用加入. .×一?.的..溶液。
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图
?浓度对荧光强度的影响....酸度的影响
如图所示,当.时,华法林的荧光强度达到最大且基本保持恒定。实验选用
.
.的一缓冲溶液,以控制测定溶液酸度。
西北大学硕士学位论文
图
对荧光强度的影响.
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蝴.昭?;
...温度的影响
实验考察了在测定条件下,温度变化对华法林荧光强度的影响。结果表明
随着温度的降低,华法林的荧光强度随之增强见图。选择低温条件下,进行荧光测
定有利于提高分析的灵敏度。但由于在低温下测定,实验操作条件苛刻,因此本实验选
择在室温下进行测定。
图温度对荧光强度的影响
.州蜘.嵋?;肌邸.×~?第二章羟丙基。.环糊精对抗凝药物华法林的荧光增强作用及其分析应用
...试剂加入顺序及体系稳定性
实验结果表明,试剂加入顺序对荧光强度没有影响。华法林和环糊精在室温条件下
内反应完全,即达到最大荧光强度值,并且至少稳定,所以实验选择放置
后测定。
.样品分析
..
线性范围、检出限及精密度
准确配制一系列华法林标准溶液,在优化的实验条件下按照上述实验方法进行测
定,并绘制工作曲线见图。结果,华法林浓度在.~.?。范围内与荧光强
度呈良好的线性关系,回归方程为..“?。,相关系数.。
按/得方法检出限为.?~。对同一浓度的华法林连续测定次,其相对标准偏
差为.%。
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图标准曲线.
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..常用片剂赋形剂的干扰
片剂赋形剂对华法林测定有一定的影响,但采用氯仿萃取.氢氧化钠反萃取的处理
方法【对标准华法林和淀粉、蔗糖、硬脂酸的混合溶液赋形剂与有效成分的比例与
实际药物中基本一致进行处理后,按照上述实验方法测定溶液中华法林的含量,与标
准值相比较,相对误差%。西北大学硕士学位论文
..华法林钠片剂测定和回收率实验
取市售不同厂家华法林钠片剂各片上海信谊九福药业有限公司:芬兰奥立安集
团,研磨后,分别按照下述方法进行处理【】。准确称取一定量华法林钠样品,用
.?。氢氧化钠溶液溶解,移至容量瓶,水稀释至刻度。过滤后,准确移取续
滤液置分液漏斗中,加稀盐酸.,然后分别以氯仿和 .?。氢氧
化钠溶液提取并过滤,再用.?.氢氧化钠溶液定容至 容量瓶。按照上述实验
方法进行测定,同时进行加标回收试验,结果如表所示。表所示测定结果,与华法林
钠药物标示量基本一致,回收率为.~.%,表明所建立的测定方法具有好的准确
度和精密度。
表片剂中的华法林钠测定结果
.结论
本章研究了..对华法林的荧光增强作用及包合特性,并与.进行了比较,
结果表明?.的荧光增强作用强于.,华法林与.?形成了:包合物。研究
建立了一种以..为荧光增强剂测定抗凝药物华法林的新方法,华法林在
..?浓度范围内与荧光强度呈良好的线性关系,检出限为. ?一,应用于
市售华法林药物的测定,回收率在.~.%,结果满意。该方法操作简单、快捷、
灵敏度高,可望用于制药过程、心脏术后服用抗凝药物华法林浓度的监测以及合理用药
的选择和研究等。第二章 羟丙基一吕环糊精对抗凝药物华法林的荧光增强
作用及其分析应用
参考文献
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第三章荧光猝灭法测定华法林
第三章荧光猝灭法测定华法林
.
引言
聚乙二醇辛基苯基醚 .是一种应用广泛的非离子型表面活性剂,它具有
洗涤、乳化、润湿、增溶的作用,同时还具有良好的荧光增敏效应【】。实验发现,
.本身具有很好的荧光特性,当抗凝药物华法林存在时会对其荧光产生很强的猝灭
作用。本章研究了华法林对 一荧光的猝灭机理,并根据华法林对 .
荧光的猝灭作用建立了一种测定华法林的新方法。本法简便、快速,用于华法林钠药物
的测定,结果满意。
.
实验部分
..仪器与试剂
一型荧光分光光度计日本岛津公司;.型酸度计上海理达仪器厂; 一集热式恒温加热磁力搅拌器郑州长城科工贸有限公司。 华法林美国公司,准确称取.华法林,用.?。的溶
液配成 一?.的储备液,使用时水稀释至所需浓度; .北京化学试剂 .
厂,化学纯,用水配成?。的溶液。 柠檬酸缓冲溶液。除已标明 者外,试剂均为分析纯;水为石英亚沸水。
..实验方法
于容量瓶中分别依次加入. .溶液,一定量的华法林溶液, .
. 后,室温条件下
.柠檬酸缓冲溶液,用水稀释至刻度。静置
用的石英池,入射和出射狭缝均为,于 和吧 处测定溶液 荧光强度和试剂空白荧光强度,计算荧光强度猝灭值?.。 结果与讨论
..荧光光谱
.
图为不同浓度华法林存在时 .的荧光光谱图。由图可知 有很强的荧光,最大激发和发射波长分别为和。随着华法林浓度的增加
其荧光强度逐渐降低,表明华法林对 .的荧光有猝灭作用。西北大学硕士学位论文
懈
姒
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姗
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图华法林存在时 的荧光光谱.
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叩.??。;曲血,.,.,.,,. ~?.;
..荧光猝灭机理
荧光猝灭过程因猝灭机理不同可分为动态猝灭和静态猝灭等。动态猝灭是猝灭剂和
激发态荧光物质分子之间的相互碰撞而导致的荧光猝灭,其猝灭常数随着温度的升高而
增大;静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发荧光的复合物,从而导致荧
光物质荧光强度降低的过程,其猝灭常数随着温度的升高而减小。
华法林对 .荧光猝灭若是动态猝灭,则该猝灭应遵循.方程
【】
【】 .
式中,、分别为未加入和加入一定浓度的猝灭剂时荧光物质的荧光强度;【 为猝灭剂浓度;。为动态猝灭常数。实验测定了?和?时华法林对 .的 荧光猝灭情况,由实验数据作出体系的.曲线结果见图和表。由图直 线斜率可求,分别为.
.。?和. 。?,可见?随温度
升高而减小,因此判断华法林对 .荧光的猝灭为静态猝灭过程。第三章荧光
猝灭法测定华法林
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图华法林对 荧光猝灭的曲线
. .;竹的表线性方程和相关系数
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华法林与 的结合常数和结合位点数
对于静态猝灭过程而言,假设荧光物质分子上存在个等同的独立的结合位点,
可
以用公式.计算其结合常数和结合位点数【】:
.
.
等】
利用实验数据,以一/对作图可得一直线见图,由直线斜率和截 距求出了华法林与
.的结合常数及结合位点数如表所示。由所得的
结合常数及结合位点数可以看出,华法林与有较强 .的相互作用,且形成:
复合物。
西北大学硕士学位论文
】
图
【伊/】~关系曲线
. / .
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表华法林与 相互作用的结合常数和结合位点数 ,
..实验条件的优化
... .浓度的影响
.浓度的增
实验考察了加入 一浓度的影响。结果表明,随着 .。
大,值增大,值也随之增大如图所示。实验选用?。的第三章荧光猝灭法测定
华法林
蚋.》,,’‘,
图 浓度对?的影响?
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...酸度的影响
酸度对?的影响见图。当等于时,?达到最大值,因此实验选用. .的.柠檬酸缓冲溶液,以控制测定溶液酸度。
‘‘图酸度对的影响
.
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...温度的影响
实验测定了不同温度下体系荧光强度的猝灭值?。结果表明,时?达到最 西北大学硕士学位论文
大值如图所示,实验选择室温条件下测定。
图温度对?的影响
.
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...试剂加入顺序及体系稳定性
实验结果表明,试剂加入顺序对荧光强度没有影响。 一和华法林在室温 条件下迅速反应完全,即达到最大?,并且至少稳定,实验选择静置后测定。 .样品分析
..
线性范围、检出限及精密度
准确配制一系列华法林标准溶液,在优化的实验条件下按照上述实验方法进
行测
定,并绘制工作曲线见图。华法林浓度在’‘.范围内与荧光猝灭 强度猝灭值呈良好的线性关系,回归方程为.。.,相关系 数.。按/得方法检出限为.一?.。对同一浓度的华法林连续测定 次,其相对标准偏差为.%。