HPLC维生素E尿囊素乳膏1

HPLC维生素E尿囊素乳膏1 HPLC法测定维生素E尿囊素乳膏中维生素E与尿囊素含量 11122刘丽仙，梁晓美，赵洁，周海燕，陈桂云 (1(浙江省丽水市人民医院，323000;2(浙江省丽水市药品检验所，323000) 摘 要 目的:采用高效液相色谱法测定维生素E尿囊素乳膏中维生素E与尿囊素的含量。 方法:高效液相色谱法。维生素E用C柱, 以甲醇为流动相，流速1.5ml/min，检测波长18 284nm;尿囊素用ZORBAX NH3柱, 以甲醇:水=80:20为流动相，流速1.0ml/min，检测波长 为224nm。结果:维生素E线性范围29.32µg/ml-175.92µg/ml， r=0.99999，平均回收率为 98.89%，RSD= 1.54%(n=9);尿囊素线性范围187.68μg/ml-938.40μg/ml，r=0.99995， 平均回收率为99.90%，RSD=1.92%(n=9)。结论:本品制备简单，含量测定用高效液相色谱 法，测定方法专属性强，结果准确可靠，并能很好的控制制剂质量。 关键词 维生素E 尿囊素 高效液相色谱法 The Determination of Vitamin E Allantoin Cream By HPLC ，Liu lixian (The Peapoles Hospital of Lishui City，Lishui 323000) Abstract Objective:To establish a method for content determination of vitamiE allantoin cream by HPLC. Method:The content of vitamiE and allantoin are determined by HPLC. Vitami: C-column was used with methanol as a mobile phase，flow rate 18 was 1.5ml/min，a detecting wavelength was at 284nm. Allantoin: ZORBAX-NH3column was used with methanol:water=80:20 as a mobile phase，flow rate was 1.0ml/min，a detecting wavelength was at 224nm. Result: The linear rang of vitamiE was from 29.32μg/ml to 175.92μg/ml，r=0.99999，the average recovery was 98.89，RSD= 1.54%(n=9). The linear rang of Allantion was from 0.1803mg/ml to 0.9980mg/ml，r =0.99932，the average recovery was 99.25，RSD= 0.82%(n=9). Conclusion:This method is simple ， special，and accurate for the determination of vitamiE and allantion by HPLC. It can be used in the quality control of this cream very well. Key Words:VitaminE Allantoin Cream;vitamiE;allantion;HPLC 维生素E尿囊素乳膏是我院自行配制的主要用于滋养皮肤的外用药。处方 组成:维生素E 5g 尿囊素 20g 羟苯乙酯 1g O/W基质加至 1000g。外 用维生素E具有延缓衰老，滋养皮肤的作用;而尿囊素具有增加皮肤角质层水 合作用，故其对皮肤干燥、皲裂疗效满意，且此药副作用较轻微，可长期应用， 但仍有局部红斑等副作用，停药后自行消退。尚无其他重大副作用的报道。本文的目的是我院为申报浙江省医院制剂批准文号而研究的含量测定的方法，为了更有效控制该制剂的质量，本文建立了高效液相色谱法测定维生素E和尿囊素含量，空白基质无干扰，结果准确。 1. 仪器与试药 色谱柱(4.6×250mm)，高效液相色谱仪(Agilent 1100)，Agilent Extend-C18 ZORBAX -NH柱(4.6×250mm)。 维生素E对照品(中国药品生物制品检定所)，3 尿囊素对照品(中国药品生物制品检定所)，乙醇为纯，甲醇为色谱纯。维生素E尿囊素乳膏(丽水市人民医院制剂室，批号:20041222，20041227，20050205，20050118)。 2(方法学的考察 2.1色谱条件与系统适用性试验 维生素E用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂;甲醇为流动相;检测波长为 [1]284nm;流速1.5ml/min;柱温20?;进样量20μl。理论板数按维生素E计算，不低于3000。 尿囊素用氨基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:水=80:20为流动相;检测波长为224nm;流速1.0ml/min;柱温30?;进样量20μl。理论板数按尿囊素计算，不低于2500。 2(2线性关系 2.2.1 维生素E的线性关系 精密称取维生素E对照品73.3mg置50ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，依次量取上液各1.0，2.0，3.0，5.0，10.0ml，分别置50ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀后，分别精密吸取20ul，注入液相色谱仪中，色谱图，并以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归，A=3.72356 C+0.367478，r=0.99999，可见维生素E在29.32μg/ml-175.92μg/ml范围内线性关系良好。 2.2.2尿囊素的线性关系 精密称取尿囊素对照品469.2mg置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，依次量取上液各1.0，2.0，3.0，5.0，10.0ml，分置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀后，分别精密吸取20ul，注入液相色谱仪中，记录色谱图，并以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归，A=8.21104C+19.63444，r=0.99995，可见尿囊素在187.68μg/ml-938.40μg/ml范围内线性关系良好。 2.3 回收率试验 2.3.1维生素E的回收率 以绝对回收率表示，测定高、中、低三个浓度样品。精密称取维生素E对照品适量，加入缺维生素E的空白样品中，搅匀，使维生素E与空白基质混匀，置50ml量瓶中，加无水乙醇约40ml，密塞，于70?水浴中振摇，使维生素E充分溶解，放冷至室温，加无水乙醇至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2小时，取出，迅速用微孔滤膜(0.45μm)滤过，放至室温，取续滤液，备用，精密吸取上液20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，代入上述线性方程，计算样品中维生素E的含量。高浓度样品回收率100.26%，RSD=0.14%，中浓度样品回收率为97.05%，RSD=0.12%，低浓度样品回收率为99.37%，RSD=0.08%。平均回收率为98.89%，RSD 1.54%(n=9)。 结果见表1。 2.3.2尿囊素的回收率 以绝对回收率表示，测定高、中、低三个浓度样品。精密称取尿囊素对照品适量，加入缺尿囊素的空白样品中，置50ml量瓶中，加水10ml，加热使尿囊素 充分溶解，加甲醇适量，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2小时以上，取出，迅速用微孔滤膜(0.45μm)滤过，放至室温，取续滤液，备用。精密吸取上液20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，代入上述线性方程，计算样 HNO)的含量。平均回收率为99.90%，RSD=1.92%(n=9)。品中尿囊素(C4643 结果见表2。 表1 维生素E的回收率试验结果 加入量 测得量 回收率 平均回收率 RSD μg/ml μg/ml % % % 90 89.42 99.36 90 89.37 99.30 90 89.51 99.46 114 110.79 97.18 114 110.70 96.85 98.89 1.54 114 110.41 97.11 142 142.45 100.32 142 142.14 100.10 142 142.51 100.36 表2 尿囊素的回收率试验 加入量 测得量 回收率 平均回收率 RSD μg/ml μg/ml % % % 327.36 330.05 100.82 327.36 329.96 100.79 327.36 336.92 102.92 409.20 415.05 101.43 409.20 410.48 100.31 99.9 1.92 409.20 409.05 99.96 491.04 478.06 97.36 491.04 478.16 97.38 491.04 481.67 98.09 2.4稳定性考察 2.4.1维生素E 考察8小时内含量测定的结果。取本院制剂室制备的，批号为20050118的维生素E尿囊素乳膏，精密称取该乳膏0.9763g，置50ml量瓶中，加无水乙醇约40ml，密塞，于70?水浴中振摇，使维生素E充分溶解，放冷至室温，加无水乙醇至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2小时，取出，迅速用微孔滤膜(0.45μm)滤过，放至室温，取续滤液，备用。精密吸取上液20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，代入上述线性方程，计算样品中维生素E的含量。结果维生素E的含量在8小时内较稳定，RSD=0.54%(n=10)。 2.4.2尿囊素 在4h内考察样品稳定性。精密称取本院制剂室制备的,批号为20041207的维生素E尿囊素乳膏1.0073g，置50ml量瓶中，加水10ml，加热使尿囊素充分溶解，加甲醇适量，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2小时以 上，取出，迅速用微孔滤膜(0.45μm)滤过，放至室温，取续滤液，备用。精密吸取上液20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，代入上述线性方程，计算样品中 HNO)的含量。RSD=1.06%(n=8)。 尿囊素(C4643 2.5.重复性试验 2.5.1维生素E 精密称取维生素E尿囊素乳膏样品1.0073g，置50ml量瓶中，加无水乙醇约40ml，加热使溶解，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，置冰浴中冷却两小时以上，以微孔滤膜滤过，取续滤液放至室温，重复进样9次，测定峰面积，RSD=0.15%(n=9)。结果见表3 表3 维生素E的重复性试验结果 序号 峰面积 RSD (%) 1 355.90 2 355.47 3 355.32 4 355.22 5 354.42 0.15 6 355.23 7 356.08 8 356.12 9 355.48 2.5.2尿囊素 精密称取尿囊素对照品23.46mg，置50ml量瓶中，加水10ml，加热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，重复进样9次，测定峰面积，RSD=0.52%(n=9)。结果见表4: 表4 尿囊素的重复性试验结果 序号 峰面积 RSD (%) 1 3809.21 2 3799.28 3 3822.9 4 3936.39 5 3834.29 0.52 6 3830.18 7 3850.17 8 3855.68 9 3856.19 3.样品含量测定 3.1维生素E (1)对照品溶液制备:精密称取维生素E对照品，加甲醇制成浓度为100μg/ml的溶液。(2)精密称取维生素E尿囊素乳膏约1g，置50ml量瓶中，加无水乙醇约40ml，密塞，于70?水浴中振摇，使维生素E充分溶解，放冷至室温，加无水乙醇至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2小时，取出，迅速用微孔滤膜(0.45μm)滤过，放至室温，取续滤液作为供试品溶液。(3)测定法:精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以外标法计 算样品中维生素E的含量。3批样品的测定结果见表5。 3.2 尿囊素 (1)对照品溶液制备:精密称取尿囊素对照品，加流动相制成浓度为400μg/ml的溶液。(2)供试品溶液的制备:精密称取维生素E尿囊素乳膏1g，置50ml量瓶中,加水10ml，加热使尿囊素充分溶解，加甲醇适量，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2小时以上，取出，迅速用微孔滤膜(0.45μm)滤过，放至室温，取续滤液作为供试品溶液。(3)测定法:精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以外标法计算样品中尿 HNO)的含量。3批样品的测定结果见表6。 囊素(C4643 表5 3批样品中维生素E的含量测定结果 批号 取样量(g) 峰面积 测得量(μg/ml) 含量(%) 362.86 97.35 0.485 20041222 1.0028 362.89 97.36 0.485 370.52 99.41 0.486 20041227 1.0232 370.38 99.37 0.486 402.07 107.88 0.495 20050205 1.0894 402.28 107.93 0.495 表6 3批样品中尿囊素测定结果 批号 取样量(g) 峰面积 测得量(μg/ml) 含量(%) 4333.80 409.74 2.03 20041222 1.0110 4332.21 409.60 2.03 4305.27 406.99 2.02 20041227 1.0073 4321.02 408.51 2.03 3351.09 405.73 1.97 20050205 1.0313 3349.28 404.22 1.96 4. 讨论 4.1 文献调研与目的 维生素E尿囊素乳膏中维生素E的HPLC检测方法已有报[1-4][5]道, 还有二阶导数光谱法测定维生素E乳膏含量，一阶导数光谱法测定维生 [6][7]素E乳膏含量，气相色谱法测定维生素E微乳中维生素E的含量，紫外测定[8-9][10]法;山药中尿囊素的HPLC含量测定方法也有报道，也报道尿囊素的紫外 [11]测定方法。。 [1-4]4.2溶剂的选择 根据文献的方法，用甲醇作提取溶媒，本文作者做了大量的实验，结果维生素E提取率很低，回收率只有70%左右，实验失败，甲醇作溶媒不能采用。考虑到维生素E的脂溶性太强了，增加溶媒的非极性是否可取， [4]并查阅了中国药典，掌握维生素E的溶解性能，在无水乙醇中易溶，故用无水乙醇提取乳膏中维生素E，结果使作者大为惊喜，回收率满意，最后确定采用无水乙醇作为溶媒。本为作者为考虑成本问，曾使用乙醇作为溶媒，结果回收率达到97%-98%，因本文是为申报批准文号而研究的方法，故力求更加完美，舍弃乙醇不用。尿囊素为水溶性化合物，用甲醇作为溶媒，效果满意。 4.3分离柱和流动相选择 根据文献提示，测定维生素E用甲醇作为流动相，测定尿囊素用甲醇:水=80:20为流动相，实验结果分离效果较好，且出峰时间也好。本文作者曾根据文献报道，用0.03mol/L磷酸二氢钾(pH=6.0):甲醇=60:40 柱(4.6×250mm)分离该制剂的尿囊素，结果尿囊素作为流动相，用ODS-C18 在2min时间出峰，可以说SOD-C柱对尿囊素基本不保留，且与甲醇溶剂峰同18 时出峰，干扰很大，方法不予采用。对尿囊素分子结构进行分析，其结构中有 [2]-NH，试着采用氨基柱，又查阅了关于尿囊素的检测文献，最后锁定文献为北2 京化工学院研究的山药中尿囊素的方法作为，结果取得较满意的分离效果。 4.4检测波长的选择 维生素E的无水乙醇溶液和尿囊素的甲醇溶液分别在紫外-可见分光光度计上，在200nm-400nm波长处进行扫描，结果维生素E在284nm、尿囊素在224nm波长处具有最大吸收，故选择284nm、224nm作为检测维生素E和尿囊素的波长。 4.5 样品的提取 维生素E的测定关键在于样品的提取,本文作者曾采用超声提取法和甲醇加热提取维生素E,均因回收率过低而失败.本文现采用无水乙醇热提取，可使维生素E提取完全，在通过冰浴冷却除去霜剂中的基质，减少对色谱柱的污染。 笔者采用高效液相色谱法测定维生素E尿囊素乳膏，经过方法学，证明此法稳定，准确，可靠，可用于本制剂的含量控制方法。 参 考 文 献 [1] 王燕萍，马潇，张虹.HPLC法测定维生素E霜中维生素E的含量〔J〕.中国药事，2003，17(4):230 [2] 陈亮，何凤慈，宁桂琴.高效液相色谱法测定维生素E霜中维生素E的含量.中国药业，2001，10(9):42 [3] 熊全美，张焱，陈庆华.HPLC法检测维生素E(微囊)制剂的含量及稳定性.中国医药工业杂志，1994，25(9):401 [4] 中国药典.2000.二部:798 [5] 陈雅，陈钧，何凤慈.二阶导数光谱法测定维生素E乳膏含量.中国医院药学杂志，2003，23(1):49 [6] 庄志铨，陈志良，李国锋.维生素E霜的含量测定.中国医院药学杂志，1996，16(9):415 [7] 王倩，范宏茜，哈国坚.气相色谱法测定维生素E微乳中维生素E的含量.广东药学院报，1997，13(1):14-17 [8] 冯端浩，倪福英，张冀.维生素E的配制与质量控制. 中国医院药学杂志，1997，32(2):119 [9] 冯琳，张红梅，王景祥.维生素E微囊的制备及稳定性研究. 中国医院药学杂志，1997，17(1):3 [10] 周心如，曹京宜.山药中尿囊素的高效液相色谱分析方法研究.CHINESE JOURNAL CHROMATOGRAPHY,1996,14(2) [11] 姜玲，施明德，谢东梅.紫外分光光度法测定复方尿囊素乳膏中尿囊素的含量.安徽医科大学学报，2000 Dec;35(6)