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大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机制的研究

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大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机制的研究大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机制的研究 大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机 制的研究 中国疼痛医学杂志ChineseJoumalofPainMedicine2006,12,(3) 大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制 中作用机制的研究 刘玉红刘文彦刘海青白波'' (泰山医学院神经生物学研究室,泰安271000;济宁医学院生理学教研室) 163? 摘要目的:研究尾核中一氧化氮(NO)在痛觉调制中的作用及其作用机制.方法:以钾离子透入 引起大鼠甩尾的电流强度(mA)作为痛反应指标,尾核内微量注射L一精氨酸(L.Ar...
大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机制的研究
大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机制的研究 大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机 制的研究 中国疼痛医学杂志ChineseJoumalofPainMedicine2006,12,(3) 大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制 中作用机制的研究 刘玉红刘文彦刘海青白波'' (泰山医学院神经生物学研究室,泰安271000;济宁医学院生理学教研室) 163? 摘要目的:研究尾核中一氧化氮(NO)在痛觉调制中的作用及其作用机制.方法:以钾离子透入 引起大鼠甩尾的电流强度(mA)作为痛反应指标,尾核内微量注射L一精氨酸(L.Arg),NG硝基一L一精 氨酸甲酯(L—NAME),亚甲基蓝(MB)等,观察0,30min内大鼠痛阈的变化.放射免疫方法测定 血液和脑组织中cGMP含量的变化,以免疫组织化学结合计算机图像的方法观察给药后6— 72h内nNOS表达的变化.结果:大鼠尾核内微量注射NO前体L—Arg引起明显的痛敏效应,血和 脑中cGMP的含量明显升高,nNOS阳性神经元L—Arg组较正常表达增强;微量注射L.NAME和MB 后大鼠痛阈显着升高,MB组大鼠血和脑中cGMP含量显着降低,L.NAME,MB组nNOS阳性神经元 表达较正常减弱.结论:尾核内NO参与痛觉信息的传递,其作用机制可能是通过NO—cGMP途径 实现的. 关键词一氧化氮;痛觉调制;尾核;L一精氨酸;一氧化氮合酶;cGMP THEINVOLVEMENTOFNITRICOXIDEINPAINMoDULATIoNINRATCAUDATE NU. CLEUS LIUYu—Hong,LIUWen—Yan,LIUHai—Qing,BAIBo (DepartmentofNeurobiology,TaishanMedicalCollege,TaiIan271000) Abstracto4ective:Toinvestigatetheinvolvementofnitricoxide(NO)inpainmodulationinth erat caudatenucleus.Methods:Thepotassiumiontophoresisinducedtail— flickwasusedtomeasuI_etheDain threshold(PT).ThechangesofPTwereobervedaftermicroinjectionofL—arginine(L— Arg).N(ome— ga)一nitro—L—argininemethylester(L— NAME)andmethyleneblue(MB)intocaudatenucleuS.cGMP levelinbloodandbrainwasmeasuredbyradio— immunity.ThechangesofnNOSexpressionwasexamined byimmunohistochemistryandcomputergraphicanalysis.Results:Thesignificanthyperalg esiceffects wereobservedbymieroinjectionL— Argintocaudatenucleus.ThePTofratswasincreasedsignificandvby L—NAMEandMB.ThecGMPinbloodandbrainwasincreasedsignificantlybyL— Argbutdecreasedsig. nificantlybyMB.TheexpressionofnNOSwasincreasedbyL— ArgbutdecreasedbyL.NAMEandMB. Conclusion:NOinthecaudatenucleuscouldbeinvolvedinthetransmissionofnociceptiveinj ormation. ThemechanismmaybepartiallymediatedbyNO.cGMPpathwav. KeywordsNitricoxide;Painmodulation;Caudatenucleus;L.arginine;Nitricoxidesynthase :cGMP 一 氧化氮(nitricoxide,NO)在中枢神经系统内 发挥着重要作用?.有资料证明,侧脑室,隔核内 微量注射N 觉调制的高 O引起大鼠痛行为的改变.尾核是痛 级中枢之一,富含神经元型一氧化氮合 酶(nNOS)阳性神经元,而NO是否参与尾核的痛觉 调制至今未见报道.本实验通过行为学,放射免疫 方法和免疫组织化学技术观察了尾核内微量注射 L一精氨酸(L—Arg),N..硝基一L.精氨酸甲酯(L一 山东省科技厅资助项目,2001BB1CDA1;山东省中医药管理局资助项目,2001-82 通讯作者 NAME),亚甲基蓝(MB)对大鼠痛阈,血液和脑组织 中cGMP含量的变化及对nNOS表达的影响,旨在探 讨尾核内NO在痛觉调制中的作用及其可能的作用 机制. 材料与方法 1.实验动物及分组健康雄性Wistar大鼠150 只,体重220—260g,由山东大学医学动物中心提 供.随机分为四组(痛阈测量每组8只,动物可反复 使用;cGMP放免测定每时间点6只;nNOS免疫组 化每时间点3只).(1)生理盐水组(Ns组);(2) NO前体组(L—Arg组);(3)NOS阻断剂组(L—NAME 组);(4)鸟苷酸环化酶抑制剂组(MB组). 2.大鼠疼痛模型的制备动物给予充足的饮水 和饲料,适应一周后用于实验.戊巴比妥钠(40mr,/ kg)腹腔注射麻醉,将动物固定在江湾I—c型脑立体 定位仪上,根据L.J.Pellegrine图谱按照坐标A2.0, LR2.5,H5.0埋植直径0.6mm的不锈钢套管,用 502胶和自凝牙托粉固定.术后3—5d进行实验. 3.主要试剂L—Arg,L—NAME和MB均为美国 Sigma公司产品,cGMP放免试剂盒购自上海中医学 院同位素室.nNOS抗体为博士德公司产品,sP免 疫组化试剂盒为迈新公司产品. 4.给药方法微量注射时注射器插入固定导管 内,尖端伸出管外1mill,每次注药0.5l.药物的 浓度分别为:L—Arg和MB均为5mmol/L,L—NAME 为4mmol/L.动物可反复使用,连续两次注药时间 间隔大于3天. 5.痛阈测定将清醒大鼠固定在改良的鼠固定 器中,稳定30min后开始实验.采用WQ-9E型钾离 子透入仪测痛.以引起大鼠甩尾反应的电流强度 (mA)为痛反应阈值.每间隔5min测定痛阈一次. 取给药前3次痛阈的平均值为基础痛阈,给药后计 算痛阈变化的百分数[(药物作用后痛阂一基础痛 阈)/基础痛阈×100%]. 6.cGMP放免测定大鼠注药后分别在5,10, 15,20和30min断头取脑取血.组织样本处理:取 组织50mg加入2ml冰醋酸缓冲液匀浆,置于10ml 试管中静止5min,3500r/min离心15min,取上清 60?烤箱烘干.血浆处理:采血于加有EDTA的试 管中,2000r/min离心10min,取0.1ml血浆加入2 ml无水乙醇,振摇然后静止5min,3000r/rain离心 10min,取上清60?烤箱烘干.按试剂盒说明测定 中国疼痛医学杂志ChineseJournalofPainMedicine2006,12,(3 cGMP的含量. 7.尾核神经元nNOS表达的测定大鼠注药后 分别在6,12,24,48和72h断头取脑,10%的甲醛固 定,额状切取厚约3mm(含尾核)的脑组织.脱水, 透明,浸蜡,包埋,切片(4m),脱蜡至水及抗原修 复,然后按试剂盒的说明进行.阴性对照用pH7.4 的0.01mmol/LPBS代替一抗,其余操作相同.在 20×10倍镜下观察,每个时间点4个标本,每张切 片随机选择5个不重叠的视野共20个数据.用Im— age—proplus(IPP)图像分析软件测其光密度值 (OD). 8.统计学处理各组数据均以均数?差 (X?S):表示.应用SPSS12.0统计学软件包,采用 单因素方差分析系统进行统计学处理,P<0.05为 差异有显着性. 结果 1.大鼠痛阈的变化测定大鼠的基础痛阈后, 分别向尾核内注射L—Arg,L—NAME,MB和生理盐水 (Ns).实验组微量注射L—Arg后5—20rain内大鼠 痛阈与注射Ns相比显着降低(P<0.05),以后大 鼠痛阈逐渐回升.注射L—NAME后5—30min内大 鼠痛阈较注射Ns都有显着升高(P<0.05).注射 MB后5—25min内大鼠痛阈较注射Ns升高明显 (P<0.05),以后大鼠痛阈逐渐恢复正常(见图1). 60 辞 40 怒 ', 舌20 n a 栖基'一 啬一20 - 40 05l0l5202530 时间(分钟) Time(min) 图1大鼠尾核内微量注射L-Arg,L?NAME和MB对痛阈的影响 Fig.1EffectsofmicroinjectingL-Arg,L—NAMEandMBintoratcaudate nucleusOnpainthreshold , 一 :与对照组相比,P<0.05,P<0.O1,comparedwithgroupNS 2.大鼠尾核和血浆cGMP含量的变化分别向 医学杂志Chinese—JournalofP—ainMedicine2006,12,(3 双侧尾核内注射NS,L-Arg和MB.与NS对照组相 比.注射L-Arg5min后大鼠尾核和血浆cGMP含量 开始升高,l0,15min升至最高(P<0.01),之后开 始回降,直至20min仍有统计学意义(P<0.05,见 图2,3),此后尾核和血浆cGMP含量逐渐降低.与 NS对照组相比,注射MB5min后大鼠尾核和血中 cGMP含量开始降低,l0—15min明显降低(P<0. 01).之后逐渐回升,至第20min仍有统计学意义(P <0.05,见图2,3). O 时间}钟)..o Time(rain) 图2大鼠尾核组织cGMP的变化(X?s) Fig.2ChangesofcGMPinratcaudatenucleus,一:与对照组相比, P<0.05.P<0.01.comparedwithgroupNS 时间钟)..0 Time(min) 图3大鼠血浆cGMP的变化 Fig.3ChangesofcGMPinratplasma , 一 :与对照组相比,P<0.05,P<0.01,comparedwithgroupNS 3.大鼠尾核神经元nNOS表达的变化分别向 双侧尾核内注射NS,L—Arg,L—NAME和MB,结果显 示,nNOS神经元散在表达,阳性部位主要在胞浆,神 经纤维也有表达.L-Arg组nNOS神经元较正常表 达增强(P<0.05),且随着时间的延长而增强,48h 达最高点,之后开始回降.MB和L-NAME组nNOS 神经元表达较正常减弱(P<0.05),随时间延长继 续减弱,48h达最低点,之后开始回降(见图4). 讨论 一 氧化氮是近年来生命科学与医学界均密切关 注的一个无机分子,它在体内的作用十分广泛,在痛 觉调制中的作用已引起广泛关注,是一个极具应用 价值的崭新领域. 612244872 时间(小时) Time(h) 图4尾核nNOS阳性神经元光密度值的变化 Fig.4ChangesofopticaldensityofnNOSincaudatenucleus , 一 :与对照组相比,P<0.05,P<0.01,comparedwithgroupNS NO可能参与脊髓致敏作用的调节.大鼠鞘内 给予NOS抑制剂L—NAME可防止脊髓的痛觉过敏 或周围神经损伤后的疼痛J.在福尔马林大鼠模型 中鞘内给药,L.Arg组第二期(缩腿舔爪时间)显着 延长,提示NO前体对福尔马林模型的第二期有易 化作用;L—NAME组的第二期(缩腿舔爪时间)显着 缩短,提示NOS抑制剂对福尔马林模型的第二阶段 有抑制作用J.NO还参与脊髓水平伤害性信息传 递.鞘内给予NOS抑制剂L—NAME可产生镇痛作 用,而给予L.Arg则引起痛觉过敏. 尾核是痛觉调制过程中的较高级中枢,张香桐 曾提出,大脑皮层对于痛觉的调制有可能通过尾核 下达丘脑J.本实验采用双侧尾核内微量注射NO 前体L.Arg和NOS抑制剂L.NAME等观察大鼠痛阈 的变化.微量注射L—Arg后,大鼠痛阈显着降低,而 L.NAME与L.Arg的作用则相反,大鼠痛阈显着升 高,且持续30min以上.提示高位中枢内NO水平 555555 420864 222111 ?0zco?c?_【uQ0 迥辩霉枣翌?宝c —r1\'【0宣c一?'【0c时0c'【?》?'【=00 _【Ea一删如0u噬 一一\_【0目II一宣?_【II-【>_【=0u ^1/IIIo薯uJr喜妞t王0u墨目 的升高可以显着诱发大鼠的痛觉过敏,而NOS抑制 剂则表现明显的镇痛效应,这与NO在脊髓的作用 一 致. 生理条件下,NO在神经元间迅速扩散,与细胞 内可溶性鸟苷酸环化酶(guanglylcyclase,GC)结 合,形成NO-Heme-GC复合物,催化三磷酸鸟苷酸生 成cGMP,后者刺激cGMP依赖性蛋白激酶,呈现出 各种不同的作用,表现为生理功能的兴奋或抑制]. MB是GC抑制剂,尾核内微量注射MB大鼠痛阈迅 速升高,且持续25rain左右.并且放免测定结果也 显示注射L-Arg后脑和血中cGMP的含量明显升高, 而注射MB后脑和血中cGMP的含量明显降低.该 结果提示尾核内NO对大鼠痛阈的影响至少部分是 通过NO-cGMP途径实现的. 鞘内注射NO前体能加强福尔马林大鼠致痛模 型脊髓背角NOS的表达;而注射NOS抑制剂L— NAME则抑制福尔马林大鼠致痛模型脊髓背角NOS 的表达J.本文应用免疫组织化学技术,检测尾核 内微量注射L.Arg,L-NAME和MB等对尾核神经元 nNOS表达变化的影响.L.Arg组尾核神经元nNOS 表达较正常明显增强,MB和L-NAME组nNOS表达 较正常明显减弱.提示一方面NO作为逆行信 使弥散到突触前,增加突触前谷氨酸的释放,促 进离子通道的开放,易化突触传递;另一方面,NO 弥散至周围细胞,激活胞内可溶性GC,胞内 cGMP水平升高,激活胞内蛋白激酶,兴奋神经 元.从组织学角度提示了尾核内NO可能参与痛 觉调制. 本实验通过行为学,放射免疫测定和免疫组织 化学等方法证明大鼠尾核内NO起着致痛作用,并 且其作用机制可能与NO-cGMP代谢途径有关.而 尾核内NO参与痛觉调制的分子机制及其与其它痛 5PellegrinoLJ,PellegrinoAS,CushmanAJ.Aster. eotaxicatlasoftheratbrain.NewYork:plenum press.1979.33—38. 6赵晶,李瑶,徐贵丽,等.一氧化氮及一氧化氮合 酶抑制剂与吗啡依赖和耐受关系的研究进展. 解放军药学,2001,17:148—153. 7刘晓丽,霍展祥,周颖虹,等.地尔硫卓抑制小鼠 吗啡戒断反应及血浆和脑匀浆一氧化氮的含量. ChineseJournalofPainMedicine2006.12.f3 觉调制:分子的相互关系有待进一步探讨. 参考文献 1CianiE,GuidiS,BartesaghiR,eta1.Nitricoxide regulatescGMP--dependentcAMP--responsiveele-- mentbindingproteinphosphorylationandBcl--2ex-- pressionincerebellarneurons:implicationfora survivalroleofnitricoxide.JNeurochem,2002, 82:1282—1289. 2白波,刘文彦,宋朝佑.中枢神经系统一氧化氮 对大鼠痛阈的影响.中国神经科学杂志,2000, 16:52—55. 3HaleyJE.Gasesasneurotransmitters.EssaysBio- chen1.1998.33:79—91. 4林雪梅,王泉云,朱琳等.福尔马林致痛对大鼠 行为学及脊髓NO,fos的影响.四川大学 (医学版),2003,34:523—526. 5CizkovaD,LukacovaN,MarsalaM,eta1.Neuro- pathicpainisassociatedwithalterationsofnitric oxidesynthaseimmunoreaetivityandcatalyticactiv- ityindorsalrootgangliaandspinaldorsalhorn. 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