大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机制的研究
大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制中作用机
制的研究
中国疼痛医学杂志ChineseJoumalofPainMedicine2006,12,(3)
大鼠尾核内一氧化氮在痛觉调制
中作用机制的研究
刘玉红刘文彦刘海青白波''
(泰山医学院神经生物学研究室,泰安271000;济宁医学院生理学教研室) 163?
摘要目的:研究尾核中一氧化氮(NO)在痛觉调制中的作用及其作用机制.方法:以钾离子透入
引起大鼠甩尾的电流强度(mA)作为痛反应指标,尾核内微量注射L一精氨酸(L.Arg),NG硝基一L一精
氨酸甲酯(L—NAME),亚甲基蓝(MB)等,观察0,30min内大鼠痛阈的变化.放射免疫方法测定
血液和脑组织中cGMP含量的变化,以免疫组织化学结合计算机图像
的方法观察给药后6—
72h内nNOS表达的变化.结果:大鼠尾核内微量注射NO前体L—Arg引起明显的痛敏效应,血和
脑中cGMP的含量明显升高,nNOS阳性神经元L—Arg组较正常表达增强;微量注射L.NAME和MB
后大鼠痛阈显着升高,MB组大鼠血和脑中cGMP含量显着降低,L.NAME,MB组nNOS阳性神经元
表达较正常减弱.结论:尾核内NO参与痛觉信息的传递,其作用机制可能是通过NO—cGMP途径
实现的.
关键词一氧化氮;痛觉调制;尾核;L一精氨酸;一氧化氮合酶;cGMP THEINVOLVEMENTOFNITRICOXIDEINPAINMoDULATIoNINRATCAUDATE
NU.
CLEUS
LIUYu—Hong,LIUWen—Yan,LIUHai—Qing,BAIBo
(DepartmentofNeurobiology,TaishanMedicalCollege,TaiIan271000) Abstracto4ective:Toinvestigatetheinvolvementofnitricoxide(NO)inpainmodulationinth
erat
caudatenucleus.Methods:Thepotassiumiontophoresisinducedtail—
flickwasusedtomeasuI_etheDain
threshold(PT).ThechangesofPTwereobervedaftermicroinjectionofL—arginine(L—
Arg).N(ome—
ga)一nitro—L—argininemethylester(L—
NAME)andmethyleneblue(MB)intocaudatenucleuS.cGMP levelinbloodandbrainwasmeasuredbyradio—
immunity.ThechangesofnNOSexpressionwasexamined
byimmunohistochemistryandcomputergraphicanalysis.Results:Thesignificanthyperalg
esiceffects
wereobservedbymieroinjectionL—
Argintocaudatenucleus.ThePTofratswasincreasedsignificandvby L—NAMEandMB.ThecGMPinbloodandbrainwasincreasedsignificantlybyL—
Argbutdecreasedsig.
nificantlybyMB.TheexpressionofnNOSwasincreasedbyL—
ArgbutdecreasedbyL.NAMEandMB.
Conclusion:NOinthecaudatenucleuscouldbeinvolvedinthetransmissionofnociceptiveinj
ormation.
ThemechanismmaybepartiallymediatedbyNO.cGMPpathwav. KeywordsNitricoxide;Painmodulation;Caudatenucleus;L.arginine;Nitricoxidesynthase
:cGMP
一
氧化氮(nitricoxide,NO)在中枢神经系统内
发挥着重要作用?.有资料证明,侧脑室,隔核内 微量注射N
觉调制的高
O引起大鼠痛行为的改变.尾核是痛
级中枢之一,富含神经元型一氧化氮合
酶(nNOS)阳性神经元,而NO是否参与尾核的痛觉 调制至今未见报道.本实验通过行为学,放射免疫 方法和免疫组织化学技术观察了尾核内微量注射 L一精氨酸(L—Arg),N..硝基一L.精氨酸甲酯(L一 山东省科技厅资助项目,2001BB1CDA1;山东省中医药管理局资助项目,2001-82
通讯作者
NAME),亚甲基蓝(MB)对大鼠痛阈,血液和脑组织 中cGMP含量的变化及对nNOS表达的影响,旨在探 讨尾核内NO在痛觉调制中的作用及其可能的作用 机制.
材料与方法
1.实验动物及分组健康雄性Wistar大鼠150 只,体重220—260g,由山东大学医学动物中心提 供.随机分为四组(痛阈测量每组8只,动物可反复 使用;cGMP放免测定每时间点6只;nNOS免疫组 化每时间点3只).(1)生理盐水组(Ns组);(2) NO前体组(L—Arg组);(3)NOS阻断剂组(L—NAME 组);(4)鸟苷酸环化酶抑制剂组(MB组). 2.大鼠疼痛模型的制备动物给予充足的饮水 和饲料,适应一周后用于实验.戊巴比妥钠(40mr,/ kg)腹腔注射麻醉,将动物固定在江湾I—c型脑立体 定位仪上,根据L.J.Pellegrine图谱按照坐标A2.0, LR2.5,H5.0埋植直径0.6mm的不锈钢套管,用
502胶和自凝牙托粉固定.术后3—5d进行实验. 3.主要试剂L—Arg,L—NAME和MB均为美国 Sigma公司产品,cGMP放免试剂盒购自上海中医学 院同位素室.nNOS抗体为博士德公司产品,sP免 疫组化试剂盒为迈新公司产品.
4.给药方法微量注射时注射器插入固定导管 内,尖端伸出管外1mill,每次注药0.5l.药物的 浓度分别为:L—Arg和MB均为5mmol/L,L—NAME 为4mmol/L.动物可反复使用,连续两次注药时间 间隔大于3天.
5.痛阈测定将清醒大鼠固定在改良的鼠固定 器中,稳定30min后开始实验.采用WQ-9E型钾离 子透入仪测痛.以引起大鼠甩尾反应的电流强度 (mA)为痛反应阈值.每间隔5min测定痛阈一次. 取给药前3次痛阈的平均值为基础痛阈,给药后计 算痛阈变化的百分数[(药物作用后痛阂一基础痛 阈)/基础痛阈×100%].
6.cGMP放免测定大鼠注药后分别在5,10, 15,20和30min断头取脑取血.组织样本处理:取 组织50mg加入2ml冰醋酸缓冲液匀浆,置于10ml 试管中静止5min,3500r/min离心15min,取上清 60?烤箱烘干.血浆处理:采血于加有EDTA的试 管中,2000r/min离心10min,取0.1ml血浆加入2 ml无水乙醇,振摇然后静止5min,3000r/rain离心 10min,取上清60?烤箱烘干.按试剂盒说明测定 中国疼痛医学杂志ChineseJournalofPainMedicine2006,12,(3
cGMP的含量.
7.尾核神经元nNOS表达的测定大鼠注药后 分别在6,12,24,48和72h断头取脑,10%的甲醛固
定,额状切取厚约3mm(含尾核)的脑组织.脱水, 透明,浸蜡,包埋,切片(4m),脱蜡至水及抗原修 复,然后按试剂盒的说明进行.阴性对照用pH7.4 的0.01mmol/LPBS代替一抗,其余操作相同.在 20×10倍镜下观察,每个时间点4个标本,每张切 片随机选择5个不重叠的视野共20个数据.用Im— age—proplus(IPP)图像分析软件测其光密度值 (OD).
8.统计学处理各组数据均以均数?
差 (X?S):表示.应用SPSS12.0统计学软件包,采用 单因素方差分析系统进行统计学处理,P<0.05为 差异有显着性.
结果
1.大鼠痛阈的变化测定大鼠的基础痛阈后, 分别向尾核内注射L—Arg,L—NAME,MB和生理盐水 (Ns).实验组微量注射L—Arg后5—20rain内大鼠 痛阈与注射Ns相比显着降低(P<0.05),以后大 鼠痛阈逐渐回升.注射L—NAME后5—30min内大 鼠痛阈较注射Ns都有显着升高(P<0.05).注射 MB后5—25min内大鼠痛阈较注射Ns升高明显 (P<0.05),以后大鼠痛阈逐渐恢复正常(见图1). 60
辞
40
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时间(分钟)
Time(min)
图1大鼠尾核内微量注射L-Arg,L?NAME和MB对痛阈的影响 Fig.1EffectsofmicroinjectingL-Arg,L—NAMEandMBintoratcaudate
nucleusOnpainthreshold ,
一
:与对照组相比,P<0.05,P<0.O1,comparedwithgroupNS
2.大鼠尾核和血浆cGMP含量的变化分别向
医学杂志Chinese—JournalofP—ainMedicine2006,12,(3
双侧尾核内注射NS,L-Arg和MB.与NS对照组相 比.注射L-Arg5min后大鼠尾核和血浆cGMP含量 开始升高,l0,15min升至最高(P<0.01),之后开 始回降,直至20min仍有统计学意义(P<0.05,见 图2,3),此后尾核和血浆cGMP含量逐渐降低.与 NS对照组相比,注射MB5min后大鼠尾核和血中 cGMP含量开始降低,l0—15min明显降低(P<0. 01).之后逐渐回升,至第20min仍有统计学意义(P <0.05,见图2,3).
O
时间}钟)..o
Time(rain)
图2大鼠尾核组织cGMP的变化(X?s)
Fig.2ChangesofcGMPinratcaudatenucleus,一:与对照组相比, P<0.05.P<0.01.comparedwithgroupNS
时间钟)..0
Time(min)
图3大鼠血浆cGMP的变化
Fig.3ChangesofcGMPinratplasma ,
一
:与对照组相比,P<0.05,P<0.01,comparedwithgroupNS
3.大鼠尾核神经元nNOS表达的变化分别向
双侧尾核内注射NS,L—Arg,L—NAME和MB,结果显 示,nNOS神经元散在表达,阳性部位主要在胞浆,神 经纤维也有表达.L-Arg组nNOS神经元较正常表 达增强(P<0.05),且随着时间的延长而增强,48h 达最高点,之后开始回降.MB和L-NAME组nNOS 神经元表达较正常减弱(P<0.05),随时间延长继 续减弱,48h达最低点,之后开始回降(见图4). 讨论
一
氧化氮是近年来生命科学与医学界均密切关
注的一个无机分子,它在体内的作用十分广泛,在痛 觉调制中的作用已引起广泛关注,是一个极具应用 价值的崭新领域.
612244872
时间(小时)
Time(h)
图4尾核nNOS阳性神经元光密度值的变化
Fig.4ChangesofopticaldensityofnNOSincaudatenucleus
,
一
:与对照组相比,P<0.05,P<0.01,comparedwithgroupNS
NO可能参与脊髓致敏作用的调节.大鼠鞘内 给予NOS抑制剂L—NAME可防止脊髓的痛觉过敏 或周围神经损伤后的疼痛J.在福尔马林大鼠模型 中鞘内给药,L.Arg组第二期(缩腿舔爪时间)显着 延长,提示NO前体对福尔马林模型的第二期有易 化作用;L—NAME组的第二期(缩腿舔爪时间)显着 缩短,提示NOS抑制剂对福尔马林模型的第二阶段 有抑制作用J.NO还参与脊髓水平伤害性信息传 递.鞘内给予NOS抑制剂L—NAME可产生镇痛作 用,而给予L.Arg则引起痛觉过敏.
尾核是痛觉调制过程中的较高级中枢,张香桐 曾提出,大脑皮层对于痛觉的调制有可能通过尾核 下达丘脑J.本实验采用双侧尾核内微量注射NO 前体L.Arg和NOS抑制剂L.NAME等观察大鼠痛阈 的变化.微量注射L—Arg后,大鼠痛阈显着降低,而 L.NAME与L.Arg的作用则相反,大鼠痛阈显着升 高,且持续30min以上.提示高位中枢内NO水平 555555
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的升高可以显着诱发大鼠的痛觉过敏,而NOS抑制 剂则表现明显的镇痛效应,这与NO在脊髓的作用 一
致.
生理条件下,NO在神经元间迅速扩散,与细胞 内可溶性鸟苷酸环化酶(guanglylcyclase,GC)结 合,形成NO-Heme-GC复合物,催化三磷酸鸟苷酸生 成cGMP,后者刺激cGMP依赖性蛋白激酶,呈现出 各种不同的作用,表现为生理功能的兴奋或抑制]. MB是GC抑制剂,尾核内微量注射MB大鼠痛阈迅 速升高,且持续25rain左右.并且放免测定结果也 显示注射L-Arg后脑和血中cGMP的含量明显升高, 而注射MB后脑和血中cGMP的含量明显降低.该 结果提示尾核内NO对大鼠痛阈的影响至少部分是 通过NO-cGMP途径实现的.
鞘内注射NO前体能加强福尔马林大鼠致痛模 型脊髓背角NOS的表达;而注射NOS抑制剂L— NAME则抑制福尔马林大鼠致痛模型脊髓背角NOS 的表达J.本文应用免疫组织化学技术,检测尾核 内微量注射L.Arg,L-NAME和MB等对尾核神经元 nNOS表达变化的影响.L.Arg组尾核神经元nNOS 表达较正常明显增强,MB和L-NAME组nNOS表达 较正常明显减弱.提示一方面NO作为逆行信 使弥散到突触前,增加突触前谷氨酸的释放,促 进离子通道的开放,易化突触传递;另一方面,NO 弥散至周围细胞,激活胞内可溶性GC,胞内 cGMP水平升高,激活胞内蛋白激酶,兴奋神经 元.从组织学角度提示了尾核内NO可能参与痛 觉调制.
本实验通过行为学,放射免疫测定和免疫组织
化学等方法证明大鼠尾核内NO起着致痛作用,并
且其作用机制可能与NO-cGMP代谢途径有关.而
尾核内NO参与痛觉调制的分子机制及其与其它痛
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ChineseJournalofPainMedicine2006.12.f3 觉调制:分子的相互关系有待进一步探讨.
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