反相高效液相色谱法测定夏枯草中两种三萜酸的含量

反相高效液相色谱法测定夏枯草中两种三萜酸的含量 ------精品文档!值得拥有～------ 反相高效液相色谱法测定夏枯草中两种三萜酸的含量 STRONG【关键词】/STRONG夏枯草;,,乌索酸;,,齐墩果酸;,,反相高效 液相色谱法 摘要:目的建立同时测定夏枯草中乌索酸及齐墩果酸含量的方法。方 法采用反相高效液相色谱法。色谱柱为NucleodurC18柱(4.6mm×250mm， 5μm)，流动相为甲醇:水(86?14)，流速为0.8ml/min，检测波长为210nm， 柱温25?。结果乌索酸进样量在0.4252,3.8268μg，齐墩果酸进样量在 0.1272,1.1448μg范围内，线性关系良好，乌索酸、齐墩果酸的加样平 均回收率分别为98.0%和98.7%，RSD分别为1.0%和1.4%。结论方法简单 准确，重现性好，适用于夏枯草药材的质量控制。 关键词:夏枯草;乌索酸;齐墩果酸;反相高效液相色谱法 DeterminationofTwoTriterpeneAcidsinPrunellavulgarisL.byRP-HPLC Abstract: ObjectiveTodevelopanewmethodforsimultaneousdeterminationofursol icacidandoleanolicacidinPrunellavulgarisL(MethodsThehighperformanceliquidchromatographywasused(ThecolumnwasNucleodurC18(4.6mm ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ ×250mm，5μm)column， themobilephaseconsistedofmethanol-water(86? 14),theflowratewas0.8ml/minandthedetectionwavelengthwassetat210nm.ResultsThelinearrangewithgoodlinearityofursolicacidwasbetween0.4252,3.8268μgandwiththeoleanolicacidwasbetween0.1272, 1.1448μ g(Theaveragerecoveryofursolicacidwas98.0%withrelativestandarddeviation(RSD)of1.0%andtheoleanolicacidwas98.7%withRSDof1.4%.ConclusionThemethodissimple,accurate,reliableandcanbeusedforqualitycontrolofPrunellavulgarisL( Keywords: HPLC PrunellavulgarisL;Ursolicacid;Oleanolicacid;RP- 夏枯草PrunellavulgarisL.是唇形科夏枯草属植物，为中医临床常用 中药，始载于《神农本草经》，主产于河南、安徽、江苏、浙江等地，以 干燥果穗或全草入药，味辛苦、性寒，具有清肝、明目、散结、消肿、止 痛之功效，用于目赤肿痛、羞明流泪、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛 等,1,。dangdai现代临床多用于Medicine治疗甲状腺肿大、淋巴结核、 乳腺增生、高血压病、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病。夏枯草中 含有三萜及其苷类、苯丙素类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素类、有机 酸类、挥发油等多种活性化学成分,2~4,，其中乌索酸和齐墩果酸为夏枯 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 草的主要活性成分,5~6,。目前夏枯草中两种三萜酸含量的测定，文献报道主要采用薄层色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法和毛细管胶束电动色谱法,7~10,。本实验建立高效液相色谱法同时测定了夏枯草中乌索酸和齐墩果酸的含量，旨在为控制夏枯草内在质量提供依据。 STRONG 1仪器与材料/STRONG 1.1仪器Waters515高效液相色谱仪，2296光电二极管矩阵检测器，7725I进样阀，Empower中文色谱工作站;KS-1500超声清洗器(宁波科声仪器厂)，CP225D准微量天平(德国Sartorius公司)，UPWS-I-10T纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)，FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。 1.2试剂与材料甲醇为色谱纯(上海陆忠试剂厂)，水为高纯水，乙醇为纯(95%，江西同盟试剂厂)，乌索酸、齐墩果酸对照品(中国药品 200314，11)，生物制品检定所提供，批号分别为:110742- 夏枯草(市售)。 STRONG 2方法与结果/STRONG 2.1色谱条件和系统适应性色谱柱为NucleodurC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，带保护柱，流动相为甲醇-水(86:14)，流速为0.8ml/min，检测 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 波长210nm，柱温25?，外标法定量分析，乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于10000。对照品及夏枯草样品的HPLC色谱见图1。 a对照品b夏枯草样品1.齐墩果酸2.乌索酸 图1对照品和夏枯草样品的HPLC色谱图(略) 2.2溶液的配制 2.2.1对照品储备液精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品21.26mg，齐墩果酸对照品6.36mg，置于10ml容量瓶中，加入适量甲醇溶解，定容，摇匀，作为乌索酸和齐墩果酸对照品储备液，备用。 2.2.2夏枯草样品溶液将药材夏枯草在80?下恒温干燥12h，取适量夏枯草于高速万能粉碎机中粉碎，备用。精密称取夏枯草粉末约2g，置具塞三角烧瓶中，加入95%乙醇溶液30ml，超声提取120min，放冷，滤过，滤渣再加入少量乙醇，超声洗涤2次，合并滤液至50ml容量瓶中，乙醇定容，摇匀，得样品溶液。 2.3曲线的绘制精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品储备液1ml至10ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀，制成含乌索酸0.2126mg/ml，齐墩果酸0.0636mg/ml的对照品混合溶液。分别吸取2，6，10，14，18μl，按2.1 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 色谱条件进样测定峰面积，以峰面积(μV・s)为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，进行线性拟合，得乌索酸回归方程为Y=5.18×105X-1.35×103，r=0.99984;齐墩果酸回归方程为Y=3.28×105X-1.90×103，r=0.99960，表明当乌索酸进样量在0.4252,3.8268μg，齐墩果酸进样量在0.1272,1.1448μg范围内，线性关系良好。 2.4精密度实验精密吸取乌索酸和齐墩果酸的对照混合溶液20μl进样，乌索酸峰面积相对标准偏差(RSD)为0.6%(n=5)，齐墩果酸的峰面积RSD0.9%(n=5)。结果表明仪器系统精密度良好。 2.5重现性实验精密称取同一批夏枯草样品5份，每份约2g，按样品溶液配制方法制备溶液，精密吸取20μl进样分析，乌索酸峰面积RSD为1.1%(n=5)，齐墩果酸峰面积RSD为1.2%(n=5)。 2.6加样回收率实验精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量的夏枯草样品5份，每份约1g，分别加入乌索酸和齐墩果酸对照品储备液1.0ml，制备样品溶液。精密吸取20μl进样分析，得乌索酸的平均加样回收率为98.0%，RSD为1.0%，齐墩果酸的平均加样回收率为98.7%，RSD为1.4%。 2.7样品分析结果精密吸取样品溶液20μl进样，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定样品中乌索酸和齐墩果酸的峰面积，平行3次，pc计算样品中乌索酸和齐墩果酸的平均含量。结果见表1。 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 表1夏枯草样品中乌索酸和齐墩果酸的测定结果(略) STRONG 3讨论/STRONG 3.1样品提取方法的选择夏枯草中乌索酸和齐墩果酸的提取多采用乙醇回流法,11,和乙醚索氏提取法，操作时间长，提取工艺复杂，提取率低，而采用超声波提取夏枯草中的两种有效成分，操作简单，提取时间短，提取率高，有利于样品中有效成分的快速富集，具有快速、环保、节省溶剂等优点，提取液中杂质较少，样品经0.45μm滤膜过滤后可直接进样，对色谱柱无污染。 3.2样品提取时间的选择考察了不同提取时间对样品中乌索酸提取率的影响。当夏枯草样品超声提取120min后，继续延长提取时间，提取率无明显变化，确定样品的提取时间为120min。 3.3检测波长的选择采用光电二极管矩阵检测器，在190~500nm波长范围进行光谱扫描，乌索酸和齐墩果酸在流动相中的最大吸收波长均为202.2nm(见图2)，但短波长处流动相有较强的末端吸收，为避免流动相对检测结果的干扰，提高信噪比，保证系统的灵敏度，选取210nm为检测波长。 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 1.齐墩果酸2.乌索酸 图2乌索酸和齐墩果酸对照品的紫外光谱图(略) 3.4流动相和色谱柱的选择乌索酸和齐墩果酸均属三萜类化合物，为同分异构体，两者极性几乎无差别，分离较困难，传统检测方法在测定夏枯草中乌索酸含量时，未能将齐墩果酸和乌索酸分离，测得的乌索酸含量实际为两者的总和。经多次实验，以甲醇-水(86?14)体系为流动相，选用NucleodurC18柱实现了乌索酸和齐墩果酸的良好分离。 STRONG 参考文献:/STRONG ,1,郑汉臣,蔡少青.药用植物学与生药学,M,.北京:人民卫生出版社,2004:389. ,2,孟正木,何立文.夏枯草的化学成分研究,J,.中国药科大学学报,1995,26(6):329. ,3,刘悦,宋少江,徐绥绪.夏枯草的化学成分及生物活性研究进展,J,.沈阳药科大学学报,2003,20(1):55. ,4,刘敬顺.夏枯草药理作用实验研究简况,J,.山西中 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 医,2002,18(2):52. ,5,LiJ,guoWJ,YangQY.Effectsofursolicacidandoleanolicacidonhumancol oncarcinomacelllineHCT15,J,.WorldJGadtroenterol,2002,8(3):493. ,6,李晓蒙,廖华卫.夏枯草中熊果酸的含量测定,J,.广东药学院学报,2003,18(1):31. ,7,毛海兴,杨更亮,赵敬相.毛细管胶束电动色谱法测定夏枯草中两有效成分,J,.分析化学,2000,28:1275. 朱丹妮.衍生化气相色谱法测定夏枯草中齐墩果 ,8,闫花丽,赵陆华, 酸和熊果酸的含量,J,.中国中药杂志,1999,24(12):744. ,9,王海波,乔智胜,张芝玉,等.三种夏枯草的薄层层析和紫外光谱研究,J,.时珍国药研究,1995,7(2):100. ,10,刘淑娟,罗明标,林海禄,等.夏枯草中熊果酸的提取及表征,J,.化学世界,2005,10:617. ,11,吴垠,吴志南.夏枯草浸膏含量测定方法的研究,J,.广东药 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 学,2002,12(2):27. ------珍贵文档!值得收藏～-----