人脐带血多能干细胞的体外分离培养及其生物学特性

人脐带血多能干细胞的体外分离培养及其生物学特性 人脐带血多能干细胞的体外分离培养及其 生物学特性 中国初级卫生保健20t0年3月第24卷第3期(总第291期) 人脐带血多能干细胞的体外分离培养及其生物学特性 史军?,陈锦阳?,李洁?,曹利红?,张潇月?,马小秀?,陶毅? 关键词:间充质干细胞;人脐带血;原代培养;生物学特性 [中图分类号】R575.2[文献标识码]B[文章编号】1001—568X(2010)03—0101—02 间充质干细胞fmesenchymalstemcells,MSCs)是一群来 源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞. 广泛分布于各种不同的组织中,如骨髓,外周血,脐血,脂 .MSCs的自我更新,多向分化的 肪,胎肺和胎肾等组织ll_2】 潜能以及它们所具有的低免疫原性和免疫抑制的作用.为临 床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论依据,同时大大 扩展了其临床适应症的选择范围,即不仅可用来进行各种推 行性和衰竭性疑难病症的替代治疗,也可以用来进行辅助的 免疫治疗13]. MSCs主要取白骨髓,由于骨髓源性MSCs存在高度病 ?浙江萧山医院杭州311202 毒污染或其他污染的可能,且随着年龄的不断增长使其细胞 数量和扩增,分化能力出现明显下降趋势,因此.寻找一种 能替代骨髓MSCs,可弥补其缺陷的问充质干细胞来源,已 .近年来,从脐带血中提取 越来越受到各国学者的关注 MSCs逐渐成为热点H,脐血作为医疗废弃物来源丰富.收 集方法简单易行,对供体无损伤,微生物和肿瘤细胞污染的 可能性小,不涉及社会,伦理及法律方面的更多争论,因 此,脐血间充质干细胞(UCBMSCs)有望成为细胞治疗和 组织工程的焦点.本研究中我们成功从脐带血中分离培养了 UCBMSCs,并进行了生物学特性鉴定,得到的UCBMSCs将 用于后续研究. 表l两组患者一般情况比较 轻微,两组不良反应发生率分别为8.5%和9.2%,差异没有 统计学意义(P>0.05). 3讨论 变态反应性皮肤病是由变态反应引起的一组炎症性皮肤 病,又称过敏性皮肤病,在各种变态反应性疾病中,过敏性 皮肤病约占44.0%.变应原可通过食入,注射,吸入与皮 肤黏膜的直接接触等途径而引起机体过敏.导致炎症反应的 发生.变态反应参与大多数皮肤病的发病,其发病机制至今 尚不完全明确,有时危害性很大.虽然在一些变态反应性疾 病中可以查出致敏源,如食物中的动物蛋白(鱼,虾,蟹, 肉,蛋),吸人物中的花粉,动物皮屑,真菌孢子和某些气 体,以及日常生活和工作中接触到的13光照射,干燥,化妆 品,肥皂和洗衣粉,甚至紧张疲劳等,但尚有很大一部分疾 病查不到病因,使得疾病反复发作.过敏性或变应性皮肤病 属Gell和Coommbs分型的各型变态反应,常见的有荨麻疹, 血管性水肿,特应性皮炎,接触过敏性皮炎,药物性皮炎, 湿疹,多形性红斑,自身敏感性皮炎,变应性皮肤血管炎,虫 咬皮炎,麻风反应,系统性红斑狼疮,皮肌炎和硬皮病等131. 常见的临床表现,首先出现皮肤瘙痒,随即出现风团,风团 大小和形状不一,可持续数分钟到数小时,有的患者有皮 炎,湿疹样表现主要为皮肤红肿.剧烈瘙痒,丘疹和水疱 等,一些病史比较长的患者有皮肤变厚,表面粗糙及色素沉 着等表现. 门冬氨酸钙在人体内分布迅速,可快速发 挥作用,3h后即排泄.钙离子能增加毛细血 管的致密度,降低其通透性.减少渗出,钙在 形成抗体的显微结构中具有重要意义.能减轻 炎症和非特异性抗过敏作用.观察组使用门冬 氨酸钙注射液有效率为87.5%:对照组口服息 斯敏片进行治疗,有效率为71.4%,两组有效 率差异有统计学意义(P=O.012),观察组高于对照组,说明 门冬氨酸钙对变态反应性皮肤病疗效显着.不良反应有轻度 胃部不适,恶心,呕吐,腹泻,困倦感,口干和心律不齐 等,但症状均比较轻微,不良反应发生率为8.5%,与对照 组相比差异没有统计学意义.如果发生心脏严重不适,应立 即停止.必要时可用门冬氨酸钾镁10,2Oml溶于5%葡萄糖 液500ml,缓慢静脉推注141. 综上所述,变态反应性皮肤病是一种常见病,多发病, 发病机制尚不完全明确,没有哪一种药物对所有变态反应性 皮肤病的作用都显着.使用门冬氨酸钙治疗湿疹,荨麻疹和 药疹等变态反应性皮肤病,临床效果良好,不良反应轻,值 得临床中推广. 参考文献 [1]曾碧冰,李俊杰,张静,等.1120例变态反应性皮肤病患者血清 特异性IgE检测【J】.中华全科医学,2008,6(12):1301—1303. 【2]潘建国,韩娜.变态反应性皮肤病的三级预防IJ].中华临床新医学, 2006,6(7):642. 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DMEM培养基,胎牛血清,青霉素和链霉素购自Gibco公 司:荧光标记的PE—CD34,PE—CD29,FITC—CD44,FITC— CD45,FITC—CD105和FITC—HLA—DR抗体购自BD Pharmimgen公司:Ficol1分离液和胰蛋白酶购自Sigma公 司;其余试剂均为分析醇;水为双蒸水.低温离心机 (Beckman,Germany),流式细胞仪fFACACalibur.USA) 和倒置显微镜(CarlZeiss.Germany). 1-2UCBMSCs分离和培养 根据参考文献的方法并稍加改进:无菌条件下取新鲜 脐带血50mL.加入Hank's液按1:l比例稀释后混匀.在 Falcon离心管中,取上述液体按等体积量叠加Ficoll液之上 500g,离心15min后,离心管中液体分为明显的4个区 域.轻轻吸取血清界面层的白色雾状单个核细胞层,加入 Hank's液500g离心5rain,按此操作重复2次.用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基重悬细胞,并调整浓度为 1xl0个/ml,接种到FBS包被过的12孑L板中,置于CO孵 箱中培养,48h后换液,并弃去未贴壁细胞,每隔213换 液1次,待细胞完全融合后,加入0.25%胰蛋白酶消化细 胞,进行接种培养. 1.3UCBMSCs生长曲线的测定 根据上述1.2项操作,将3次传代后的细胞用0.25%胰 酶消化后.按2x10细胞l-fL接种在24孔板内,从第2天 起,每天随机消化其中3个孔细胞,用O.1%台盼兰染色法, 计数活细胞总数,绘制生长曲线. 1.4UCBMSCs生物学特性的测定 根据上述l_2项操作,将3次传代后的细胞用0.25%胰酶 消化后,收集细胞,用等渗PBS洗涤2,3次后,分别加入荧 光标记的抗体PE—CD34,PE—CD29,FITC—CD44,PE—CD45, FITC—CD105和FITC—HIA—DR,对照组以同型IgG作为阴性 对照,37?孵育30min,尔后用等渗PBS洗涤3次以除去末 结合的抗体,用流式细胞仪检测上述抗原的表达. 2结果 2.1UCBMSCs的分离和培养 通过使用梯度离心法,从人脐带血分离出来的单个核细 胞接种到细胞培养基后,约24h后即可见部分细胞贴壁, 培养48h后即可见大部分细胞贴壁,一部分细胞呈梭形, 另一部分呈多角形,体积小,折光性强.原代细胞5,7天 左右开始出现细胞群落,形态上类似骨髓MSCs.消化传代 后,从第2代开始稳定生长,到第3代后便可获得较为均一 的UCBMSCs细胞折光性强,形态均一长梭形细胞,表现出 较强传代能力. 2.2UCBMSCs的生长曲线绘制 按2xlO细胞14L接种在24孔板内后,细胞从第3天开 始进入对数生长期,细胞数开始快速增殖.约第9,10天达 到生长高峰,尔后速度减缓,进人生长平台期.细胞倍增时 间约为28小时. 2.3UCBMSCs的免疫袁型鉴定 通过流式细胞仪检测后,UCBMSCs能稳定均一的表达 CD29,CD44和CD105,分别为94.15?6.53%,92.86+8.74% 和86_37?6.84%:而几乎不能表达CD34(1.60?O.21%), CD45(3.27+0.33%)和HLA—DR(2.76?0.28%). 3讨论 目前常用的MSCs的分离方法大体上有密度梯度离心 法,贴壁筛选法和流式细胞仪分选法等等f-1.贴壁筛选法由 于标本中含有大量的红细胞,导致所得细胞的产率很低,纯 度不高,较少单独使用,常与其他方法结合使用.本实验 中,我们开始使用的是流式细胞仪分选法,但是得到的细胞 并不十分理想,虽然纯度较高,但是获得的细胞量太小.而 且使用成本较高,因而我们最后还是选择了密度梯度离心法 作为获得UCBMSCs方法,主要是由于该方法简单有效,成 本低廉和细胞纯度较高等优点.胎牛血清是间充质干细胞生 长所需的重要物质,它可以提供一些细胞生长所需的细胞因 子或生长因子[21.本实验中,我们使用10%胎牛血清的 DMEM培养基,让细胞贴壁时间早,缩短了原代培养时间. 目前仍缺乏MSCs表面特异性抗原,但多数研究者认 为,UCBMSCs表面抗原与骨髓间充质干细胞是相似的. MSCs不表达造血细胞标志f如CD34,CD45和CD14),不 表达内皮细胞标志f如CD34,CD31和vWF).但表达一些 黏附分子f如CD44,CO90和CD106),一些基质细胞标志 (如:SH2,SH3和SH4)和一些细胞因子受体f如IL—lR和 TNF一仅R1.另外.MSCs分泌大量细胞外基质.这将为其黏 附特性和与其他细胞间的相互作用,以及其可塑性的研究提 供了理论依据[81.本实验的结果与所报道的结果是一致的, 说明我们成功分离培养了UCBMSCs,这将为我们后续的研 究奠定基础. 由于脐带血的个体差异.在MSCs分离和培养中,各步 骤缺乏公认的操作流程,UCBMSCs的培养效率较低,限制 了其临床应用.而本实验中,我们在了许多UCBMSCs 分离培养方法的基础上加以改进,使得该方法简单,易行, 且成本低廉,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论 依据. 参考文献 …苏雏祥,杨静爱,麦秋萍,等.人脐带血间充质干细胞的分离培 养研究与展望[J].四川解剖学杂志,2007,15(2):29—31. [2]PittengerMF,MackayAM,BeckSC,eta1.Multilineagepotentialof adulthumanmesenchymalstemcells[J1.Science,1999,284(5411): 143一l47. [3]廖联明,韩钦,赵春华.间充质干细胞在免疫治疗中的应用[J1. 中国实验血液学杂志,2005,13(1):158—163. f41程文广,罗高兴,黄正根,等.人脐带血间充质干细胞体外分离 培养及生物学特性研究[J1.现代生物医学进展,2008,8(3): 424-426. [51洪小杨,王斌,杜江人,等.脐带血间充质干细胞体外分离培养 研究.中国误诊学杂志,2005,5(17):3218—3220. 【6]刘岱,赵玉明,晏晓青,等.人脐带血间充质干细胞分离培养 体系的优化筛选?.中国组织工程研究与临床康复,2009,13 (10):1839—1843. 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