[精]第八章 糖类药物制备原理

[精]第八章 糖类药物制备原理 第八章 糖类药物制备原理 第一节 概 述 糖类广布于生物体中，可分为单糖、低聚糖和多糖，已发现不少糖类物质及其衍生物具有很高药用价值，有些已在临床广泛应用。 多糖类药物近来很引人注目，尤其在抗凝、降血脂、提高机体免疫和抗肿瘤、抗辐射方面都具有显著药理作用与疗效。 如PS-K多糖和香菇多糖对小鼠S180瘤株有明显抑制作用，已作为免疫型抗肿瘤药物，猪苓多糖能促进抗体的形成，是一种良好免疫调节剂，还有茯苓多糖、云芝多糖、银耳多糖、胎盘脂多糖等都已在临床上应用。肝素是天然抗凝剂，用于防治血栓、周围血管病、心绞痛、充血性心力衰竭与肿瘤的辅助治疗。硫酸软骨素有利尿、解毒、镇痛作用。右旋糖酐可以代替血浆蛋白以维持血液渗透压，中分子量右旋糖酐用于增加血容量，维持血压，以抗休克为主;低分子量右旋糖酐主要用于改善微循环，降低血液粘度;小分子量右旋糖酐是一种安全有效的血浆扩充剂。海藻酸钠能增加血容量，使血压恢复正常。 多糖是非细胞毒物质，在细胞内的存在方式有游离型与结合型两种。结合型多糖有与蛋白质结合在一起的糖蛋白和与脂类结合在一起的脂多糖。前者如黄芪多糖、人参多糖和刺五加多糖，后者如胎盘脂多糖和细菌脂多糖。糖基在糖蛋白分子中的作用有的与生理活性有关，有的与抗原性有关，还有的与细胞“识别”功能有关。 一、单糖及其衍生物的制备 游离单糖及小分子寡糖易溶于冷水及温乙醇，如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、双糖类如蔗糖、麦芽糖，三糖类如棉籽糖、龙胆糖，四糖类如来苏糖，以及多元醇类，如卫矛醇、甘露醇等。 可以用水或在中性条件下以50%乙醇为提取溶剂，也可以用82%乙醇，在70~78?下回流提取。溶剂用量一般为材料的20倍，需多次提取。植物材料磨碎经乙醚或石油醚脱脂，拌加碳酸钙，以50%乙醇温浸，浸液合并，于40~45?减压浓缩至适当体积，用中性醋酸铅去杂蛋白及其他杂质，铅离子可用HS除去，2再浓缩至粘稠状。以甲醇或乙醇温浸，去除不溶物如无机盐或残留蛋白质等。醇液经活性炭脱色、浓缩、冷却、滴加乙醚，或置于硫酸干燥器中旋转，析出结晶。单糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附层析法或离子交换法进行纯化。 二、多糖的分离与纯化 多糖可来自动物、植物和微生物。来源不同，提取分离方法也不同。植物体内含有水解多糖衍生物的酶，必须抑制或破坏酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。供提取多糖的材料必须新鲜或及时干燥保存，不宜久受高温，以免破坏其原有形式，或因温度升高，使多糖受到内原酶的作用。速冻冷藏是保存提取多糖材料的有效方法。 提取方法依照不同种类的多糖的溶解性质而定。如昆布多糖、果聚糖、糖原易溶于水;壳多糖与纤维素溶于浓酸;直链淀粉易溶于稀碱;酸性粘多糖常含有氨基已糖、已糖醛酸以及硫酸基等多种结构成分，且常与蛋白质结合在一起，提取分离时，通常先用蛋白酶或浓碱、浓中性盐解离蛋白质与糖的结合键后，用水提取，再将水提取液减压浓缩，以乙醇或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀酸性多糖，最后用离子交换色谱进一步纯化。 (一)多糖的提取 提取多糖时，一般先需进行脱脂，以便多糖释放。方法是将材料粉碎，用甲醇或1:1乙醇乙醚混合液，加热搅拌1~3h，也可用石油醚脱脂。动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理。 多糖的提取方法主要有以下几种。 1.难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者 这一类多糖主要是不溶性胶类，如木聚糖、半乳聚糖等。用冷水浸润材料后用0.5mol/L NaOH提取，提取液用盐酸中和、浓缩后，加乙醇沉淀得多糖。如在稀碱中仍不易溶出者，可加入硼砂，对甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸络合物的多糖，此法可得相当纯的物质。 2.易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者 材料用冷水浸过，用热水提取，必要时可加热至80~90?搅拌提取，提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白(或用三氯乙酸除杂蛋白)，离心除去杂蛋白后的清液，透析后用乙醇沉淀得多糖。 3.粘多糖 有些粘多糖可用水或盐溶液直接提取，但因大部分粘多糖与蛋白质结合于细胞中，因此需用酶解法或碱解法使糖—蛋白质问的结合键断裂，促使多糖释放。碱解法可以防止粘多糖分子中硫酸基的水解破坏，也可以同时用酶解法处理组织。提取液中的残留蛋白可以用蛋白质沉淀剂或吸附剂如硫酸铝、藻土等除去。 一般组织中存在多种粘多糖。纯化时，需要对粘多糖进行分离纯化。可利用各种粘多糖在乙醇中溶解度的不同，以乙醇分级沉淀法进行纯化分离;或利用粘多糖聚阴离子电荷密度的不同，用季胺盐络合物法，阴离子交换层析法和电泳法进行分离，纯化。 (1)碱解法 多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。碱处理时，可将组织在40?以下，用0.5mol/L NaOH溶液提取，提取液以酸中和，透析后，以高岭土、硅酸铝或其他吸附剂除去杂蛋白，再用酒精沉淀多糖。粘多糖分子上的硫酸基一般对碱较稳定，但若硫酸基与邻羟基处于反式结构或硫酸基在C-3或C-6，此时易发生脱硫作用。如肝素、硫酸乙酰肝素的氨基葡萄糖C-6上有硫酸基，C-3上可为游离羟基或硫酸基。另外，肝素或硫酸皮肤素分子上的艾杜糖醛酸C-2上有时含硫酸基，而C-3上有羟基与之成反式结构，因此对这类多糖不宜用碱解法提取。 (2)酶解法 蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的最常用方法。理想的工具酶是专一性低的、具有广泛水解作用的蛋白酶。鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，因此成品中会保留较长的肽段。为除去长肽段，常可与碱解法合用。酶解时要防止细菌生长，可加甲苯、氯仿、酚或叠氮化钠作抑菌剂，常用的酶制剂有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶。酶解液中的杂蛋白可用三氯醋酸法，磷钼酸—磷钨酸沉淀法，高岭土吸附法、三氟三氯乙烷法，等电点法去除，再经透析后，用乙醇沉淀即可制得粗晶粘多糖。 (二)多糖的纯化 多糖的纯化方法很多，但必须根据目的物的性质及条件选择合适的纯化方法。而且往往用一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。 1.乙醇沉淀法 乙醇沉淀法是制备粘多糖的最常用后段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。供乙醇沉淀的多糖溶液，其含多糖的浓度以1~2%为佳。如使用充分过量的乙醇，粘多糖浓度少于0.1%也可以沉淀完全。向溶液中加入一定浓度的盐，如醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵或氯化钠有助于使粘多糖从溶液中析出，盐的最终浓度5%即足够。使用醋酸盐的优点是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙醇过量时，也不会发生这类盐的共沉淀。一般只要粘多糖浓度不太低，并有足够的盐存在，加人4~5倍乙醇后，粘多糖可完全沉淀。可以使用多次乙醇沉淀法使多糖脱盐，也可以用超滤法或分子筛法(Sephadex G-10或G-15)进行多糖脱盐。加完酒精，搅拌数小时，以保证多糖完全沉淀。沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥，即可得疏松粉末状产品。 2.分级沉淀法 不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的粘多糖。在Ca2+、Zn2+等二价金属离子的存在下，采用乙醇分级分离粘多糖可以获得最佳效果。 3.季胺盐络合法 粘多糖与一些阳离子面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十六烷基氯化吡啶(CPC)等能形成季胺盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以解离，溶解，释放。使其溶解度发生明显改变时的无机盐浓度(临界盐浓度)主要取决于聚阴离子的电荷密度。粘多糖的硫酸化程度影响其电荷密度，根据其临界盐浓度的差异可以将粘多糖分为若干组(表8-1)。 降低pH可抑制羧基的电离，有利于增强硫酸粘多糖的选择性沉淀。季胺盐的沉淀能力受其烷基链中的“-CH-”基数的影响，还可以用不同种季胺盐的混2 合物作为酸性粘多糖的分离沉淀剂如Cetavlon和Arguad l6等(季胺盐混合物的商品名)。 应用季胺盐沉淀多糖是分级分离复杂粘多糖与从稀溶液中回收粘多糖的最有用方法之一。 4.离子交换层析法 粘多糖由于具有酸性基团如糖醛酸和各种硫酸基，在溶液中以聚阴离子形式存在，因而可用阴离子交换剂进行交换吸附。常用的阴离子交换剂有D254，Dowex-X2，ECTEOIA-纤维素，DEAE-C，DEAE-Sephadex A-25和Deacidite FF。吸附时可以使用低盐浓度样液，洗脱时可以逐步提高盐浓度如梯度洗脱或分步阶梯洗脱。以Dowex?进行分离时，分别有0.5，1.25，1.5，2.0和3.0mol/L NaCl洗脱，可以分离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝素和硫酸角质素。以DEAE-sephadex A-25层析时，分别用0.5，1.25，1.5和2.0mol/L NaCl洗脱，可以依次分离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素与硫酸角质素和肝素。 此外，区带电泳法、超滤法及金属络合法等在多糖的分离纯化中也常采用。如应用区带电泳法可分离透明质酸、硫酸软骨素与肝素等。 三、糖类药物的作用 (一)糖类药物的种类及来源 1.单糖如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。 2.低聚糖如蔗糖、麦芽糖乳糖、乳果糖(Lactulose)等。 3.多糖如右旋糖酐、甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖等。 4.糖的衍生物如6-磷酸葡萄糖，1，6-二磷酸果糖，磷酸肌醇等。 糖类药物研究最多的是多糖类药物，已发现具有一定生理活性的多糖有来源于植物的黄芪多糖、人参多糖、刺五加多糖、麦麸多糖、黄精多糖、昆布多糖、菊糖、褐藻多糖、薄叶大黄多糖、茶叶脂够糖、葡萄皮脂多糖、麦秸半纤维素B、针裂蹄多糖、酸模多糖、地衣多糖。来源于微生物的多糖有猪苓多糖、银耳多糖、香菇多糖、灵芝多糖、黑木耳多糖、云芝多糖、茯苓多糖、竹黄多糖、木蹄多糖、蘑菇多糖、裂褶多糖、亮菌多糖、酵母多糖、细菌脂多糖、大肠杆菌脂多糖、变形杆菌热窄多糖、NK131细菌多糖和产氨短杆菌外多糖。来源于动物的多糖有 肝素、硫酸乙酰刮素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸、壳多糖和胎盘脂多糖。 (二)糖类药物的生理活性 1.调节免疫功能。主要表现为影响补体活性，促进淋巴细胞增殖，激活或提高吞噬细胞的功能。增强机体的抗炎、抗氧化和抗衰老作用。 2.抗感染作用。多糖可以提高机体组织细胞对细菌，原虫，病毒和真菌感染的抵抗力。如甲壳素对皮下肿胀有治疗作用，对皮肤伤口有愈合作用。 3.促进细胞DNA，蛋白质的合成，促进细胞的增殖、生长。 60抗辐射损伤作用，茯苓多糖、紫菜多糖、透明质酸、甲壳素等均能抗 4.C。-γ射线的损伤，有抗氧化、防辐射作用。 5.抗凝血作用。肝素是天然抗凝剂。甲壳素、芦荟多糖、黑木耳多糖等也具有肝素样的抗凝血作用。 6.降血脂，抗动脉粥样硬化作用。类肝素(heparinoid)硫酸软骨素、小分子量肝素等具有降血脂、降血胆固醇，抗动脉粥样硬化作用，用于防治冠心病和动脉硬化。 第二节 糖类药物生产工艺 糖类药物品种繁多，发展迅速，现根据其来源、性质及工艺特点不同，主要介绍具有代表性的几个重要品种的生产工艺。 一、D-甘露醇(D-Mannitol)的制备。 )结构与性质 (一 甘露醇又名己六醇。 甘露醇为白色针状结晶，无臭，略有甜味，不潮解。易溶于水(15.6g 18?)溶于热乙醇，微溶于低级醇类和低级胺类，微溶于吡啶，不溶于有机溶剂。在无 20菌溶液中较稳定，不易为空气所氧化。溶点166?，[α]+28.6?(硼砂溶液)。 D (二)生产工艺 甘露醇在海藻、海带中含量较高。海藻洗涤液和海带洗涤液中甘露醇的含量分别为2%与1.5%，是提取甘露醇的重要资源。以葡萄糖为原料，经电解、脱盐、精制即可制得，电解转化率为98~99.6%，也可以用发醇法生产。 1.提取法 (1) 工艺路线: (2)工艺过程: ?浸泡提取、碱化、中和 海藻或海带加20倍量自来水，室温浸泡2~3h，浸泡液套用作第二批原料的 提取溶剂，一般套用4批，浸泡液中的甘露醇含量已较大。取浸泡液用30%NaOH，调pH值为10~11，静置8h，凝集沉淀多糖类粘性物。虹吸上清液，用1:1 HSO24中和至pH6~7，进一步除去胶状物，得中性提取液。 ?浓缩、沉淀 沸腾浓缩中性提取液，除去NaCl和胶状物，直到浓缩液含甘露醇30%以上，冷却至60~70?趁热加入2倍量95%乙醇，搅拌均匀，冷至室温离心收集灰白色松散沉淀物。 ?精制 沉淀物悬浮于8倍量94%乙醇中，搅拌回流30min，出料，冷却过夜，离心得粗品甘露醇，含量70~80%。重复操作一次，经乙醇重结晶后，含量>90%，氯化物含量<0.5%。取此样品重溶于适量蒸馏水中，加入1/8~1/10活性炭，80?保温0.5h，滤清。清液冷却至室温得结晶，抽滤，洗涤得精品甘露醇。 ?干燥、包装 结晶甘露醇于105~llO?烘干。 -- 检验Cl合格后(Cl<0.007%)进行无菌包装，含量98~102%。 2.发酵法 (1) 工艺路线 (2)工艺过程 ?菌种选育 Aspergillus oryzae 3.409菌种接种于10ml斜面培养基中，31?，培养4天。斜面存于4?冰箱中，2~3个月传代一次。使用前重新转接活化培养。 培养基的制备:取麦芽1kg，加水4.5L，于55?保温1h，升温到62?，再保温5~6h，加温煮沸后，用碘液检查糖化度应在12?糖化度以上，pH5.1以上，即可存于冷室备用，取此麦芽汁加2.1%琼脂，灭菌后、冷冻制成斜面，存于4?备用。 ?种子培养 取经活化培养4天的斜面菌种2支，转接于17.5L种子培养基中，31??1?搅拌通气培养20~24h。通气量1:0.5V/V?min，搅拌速度350rpm，罐压101KPa。 种子培养基:NaN0 0.3%，KHPO 0.1%，MgSO 0.05%，KCl 0.05%，FeSO 324440.001%，玉米浆0.5%，淀粉糖化液2%，玉米粉2%，pH6~7。 ?发酵 2 于500L发酵罐中，加人350L发酵培养基，150KPa蒸汽灭菌30min，移入种子培养液，接种量5%，30~32?发酵4~5天，通气量1:0.3V/V?min，发酵20h后改为1:0.4，罐压101KPa，搅拌速度230rpm，配料时添加适量豆油，防止产生泡沫。发酵培养基与种子培养基相同。 ?除杂质、分离结晶 发酵液加热100?，5min凝固蛋白，加入1%活性炭，80~85?加热30min，离心，澄清滤液于55~60?真空浓缩至糖化度31?，于室温结晶24h，甩干得甘露醇结晶。将结晶溶于0.7体积水中，加2%活性炭，70?加热30min，过滤。 清液通过717强碱型阴树脂与732强酸性阳树脂，检查流出液应无氯离子存在。 ?浓缩、结晶、烘干 精制液于55-60~C真空浓缩至糖化度25?，浓缩液于室温结晶24h，甩干结晶，置105~110?烘干，粉碎包装。 3.制剂 取适量注射用水，按20%标示量，称取结晶甘露醇，加热90?搅拌溶解后，加入1%活性炭，加热5min，过滤，再补足注射用水至标示量，检测pH4.5~6.5和含量，合格后，经G垂熔玻璃漏斗澄清过滤，分装于50ml，100ml，250ml3 安瓿瓶或输液瓶中，以101KPa蒸汽灭菌40min，即得甘露醇注射液。20%甘露醇注射液是饱和溶液，为防止在温度过低时析出结晶，配制时需保温45?左右趁热过滤。5.07%甘露醇溶液为等渗溶液，长时间高温加热，会引起色泽变黄，在pH8时尤为明显，配制时应注意操作。含热原的注射液可通过阳树脂Amberlite IRho(H+型)与阴树脂Amberlite IRA-400(OH-)处理，制得pH合适又不含热原的注射液。 二、肝素(Heparin)的制备 (一)结构与性质 肝素是天然抗凝剂，是一种含硫酸基的酸性粘多糖。其分子具有由六糖或八糖重复单位组成的线状链状结构。三硫酸双糖是肝素的主要双糖单位，L-艾杜糖醛酸是此双糖的糖醛酸。二硫酸双糖的糖醛酸是D-葡萄糖醛酸。三硫酸双糖与二硫酸双糖以2:1的比例在分子中交替联结。其分子结构的一个六糖重复单位如下图所示。 在其六糖单位中，含有3个氨基葡萄糖。 分子中酌氨基葡萄糖苷是α-型，而糖醛酸苷是β-型。肝素的含硫量为9%~12.9%，硫酸基在氨基葡萄糖的2位氨基和6位羟基上，分别形成磺酰胺和硫酸酯。在艾杜糖醛酸的2位羟基也形成磺酰胺。整个分子呈螺旋形纤维状。 肝素分子量不均一，由低、中、高三类不同分子量组成，平均分子量为12000?6000。商品肝素至少含有21种不同分子量组成，其分子量从3000到37500，两种不同组成间的分子量差距约为1500~2000，即相当于一个六糖或八糖单位。 肝素及其钠盐为白色或灰白色粉末，无臭无味，有吸湿性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂，其游离酸在乙醚中有一定溶解性。游离酸 2020的比旋度(牛、猪)的[α]=+53?~+56?;中性钠盐(牛)的比旋度[α]=+42?;DD20酸性钡盐(牛)的比旋度[α]=+45?。肝素在185~220nm有特征吸收峰，在D-1-1-1890cm”，940cm有红外特征吸收峰，测定1210~1150cm的吸收值可用于快速测定。 肝素分子中含有硫酸基与羧基，呈强酸性，为聚阴离子，能与阳离子反应成盐。肝素的糖苷键不易被酸水解，O-硫酸基对酸水解相当稳定，N-硫酸基对酸水解敏感，在温热的稀酸中会失活，温度越高，pH越低，失活越快。在碱性条 件下，N-硫酸基相当稳定。与氧化剂反应，可能被降解成酸性产物，因此使用氧化剂精制肝素，一般收率仅为80%左右。还原剂的存在，基本上不影响肝素的活性。肝素结构中的N-硫酸基与抗凝血作用有密切相关，如遭到破坏其抗凝活性则降低。分子中游离羟基被酯化，如硫酸化，抗凝活性也下降，乙酰化不影响其抗凝活性。 肝素具有聚阴离子性质，能与多种阳离子反应成盐。这些阳离子包括金属阳 2+2++，有机碱的长链吡淀化合物如十六烷氯化吡啶(CPC)、番木离子;Ca,Na，K 鳖碱、碱性染料—天青A等。阳离子表面活性剂(长链季铵盐)如十六烷基三甲基溴化铵;阳离子交换剂和带正电荷的蛋白质如鱼精蛋白等。 肝素与碱性染料如天青A、甲苯胺蓝等反应可使染料的光吸收向短波方向移动，如天青A在pH3.5时的特征吸收蜂为620nm，与肝素结合后其最大吸收移向505~515nm，在此波长下光吸收值增加与肝素浓度成正比。 用过量醋酸与乙醇能沉淀肝素失活产物。失活肝素的分子组成与分子量变化不大，但分子形状变化很大，使原来螺旋形的纤维状分子结构发生改变，分子变短，变粗。 肝素酶能使肝素降解成三硫酸双糖单位和二硫酸双糖单位。乙酰肝素酶?能将4糖单位降解为一个三硫酸双糖单位和一个二硫酸双糖单位。肝素活性还与葡萄糖醛酸含量有关，活性高的分子片段其葡萄糖醛酸含量较高，艾杜糖醛酸含量较低。 硫酸化程度高的肝素具有较高的降脂和抗凝活性。高度乙酰化的肝素，抗凝活性降低甚至完全消失，而降脂活性不变。小分子量肝素(分子量4000~5000)具有较低的抗凝活性和较高的抗血栓形成活性。 (二)生产工艺 肝素广泛分布于哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠粘膜、肌肉和血液里。因此肝素可由猪肠粘膜、牛肺、猪肺提取。其生产工艺主要有盐解—季胺盐沉淀法，盐解-离子交换法和酶解-离子交换法。肝素在组织内和其他粘多糖一起与蛋白质结合成复合物，因此肝素制备过程包括肝素蛋白质复合物的提取，解离和肝素的分离纯化两个步骤。 提取肝素多采用钠盐的碱性热水或沸水浸提，然后用酶如胰蛋白酶、胰酶(胰脏)、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶等水解与肝素结合的蛋白质，使肝素解离释放。也可以用碱性食盐水提取，再经热变性并结合凝结剂如明矾、硫酸铝等除去杂蛋白。所得的粗提液，仍含有未除尽的杂蛋白、核酸类物质和其他粘多糖，需经阴离子交换剂或长链季胺盐分离，再经乙醇沉淀和氧化剂处理等纯化操作，即得精品肝素。 1.盐解-离子交换生产工艺 (1)工艺路线 肝素钠精品。 (2)工艺过程: ?提取 取新鲜肠粘膜投入反应锅内，按3%加入NaCl，用30%NaOH调pH9.0，于53~55?保温提取2h。继续升温至95?，维持10min，冷却至50?以下，过滤，收集滤液。 ?吸附 加入714强碱性Cl-型树脂，树脂用量为提取液的2%。搅拌吸附8h，静置过夜。 ?洗涤 收集树脂，用水冲洗至洗液澄清，滤干，用2倍量1.4mol/L NaCl搅拌2h，滤干。 ?洗脱 用2倍量3mol/L NaCl搅拌洗脱8h，滤干，再用1倍量的3mol/L NaCl搅拌洗脱2h，滤干。 ?沉淀 合并滤液，加入等量95%乙醇沉淀过夜。收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥得粗品。 ?精制 粗品肝素溶于15倍量1%NaCl，用6mol/L盐酸调pHl.5左右，过滤至清，随即用5mol/L NaOH调pH11.0，按3%量加入H2O2(H2O2浓度为30%)，25?放置。维持pH11.0，第2天再按1%量加入H2O2，调整pH11.0，继续放置，共48小时，用6mol/L盐酸调pH6.5，加入等量的95%乙醇，沉淀过夜。收集沉淀，经丙酮脱水，真空干燥，即得肝素钠精品。 2.酶解-离子交换生产工艺 (1) 工艺路线 (2)工艺过程 ?酶解 取100kg新鲜肠粘膜(总固体5~7%)加苯酚200ml(0.2%)，如气温低时可不加。 在搅拌下，加入绞碎胰脏0.5~1kg(0.5~1%)，用40%NaOH调pH至8.5~9.0，升温至40~45?，保温2~3h。维持pH8.0，加入5kgNaCl(5%)，升温至90?，用6mol/L HCl调pH6.5，停止搅拌，保温20min，过滤即得。 ?吸附 取酶解液冷至50?以下，用6mol/L NaOH调pH7.0，加入5kgD-254强碱性阴离子交换树脂，搅拌吸附5h，收集树脂，水冲洗至洗液澄清，滤干，用等体积2mol/L NaCl洗涤15min，滤干，树脂再用2倍量1.2mol/L NaCl洗涤2次。 ?洗脱 树脂吸附物用半倍量5mol/L NaCl搅拌洗脱1h，收集洗脱液，再用1/3量3mol/LNaCI洗脱2次，合并洗脱液。 ?沉淀 洗脱液经纸浆助滤，得清液，加入用活性炭处理过的0.9倍量的95%乙醇，冷处沉淀8~12h，收集沉淀，按100kg粘膜加入300ml的比例，向沉淀中补加蒸馏水，再加4倍量95%乙醇，冷处沉淀6h，收集沉淀，用无水乙醇洗1次，丙酮脱水2次，真空干燥，得粗品肝素。 ?精制 粗品肝素溶于10倍量2%NaCl，加入4%KMnO(加入量为每亿单位肝素加4 入0.65molKMnO)。加入方法:将KMnO4调至pH8.0，预热至80?，在搅拌下4 加入，保温2.5h。以滑石粉作助滤剂，过滤，收集滤液，调pH6.4，加0.9倍量95%乙醇，置于冷处沉淀6h以上。收集沉淀，溶于1%NaCl中(配成5%肝素钠溶液)，加入4倍量95%乙醇，冷处沉淀6h以上，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，得精品肝素，最高效价140单位/mg以上。收率2万单位/kg肠粘膜(换算成总固体7%计)。 三、硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate)的制备 (一)结构与性质 硫酸软骨素(CS)的药用商品名为康得灵，是从动物软骨中提取制备的酸性粘多糖，主要是硫酸软骨素A、C及各种硫酸软骨素的混合物。硫酸软骨素一般含有50~70个双糖单位，链长不均一，分子量在1~3万，硫酸软骨素按其化学组成和结构的差异，又分为A、B、C、D、E、F、H等多种。硫酸软骨素A和C都含D-葡萄糖醛酸和α-氨基-脱氧-D-半乳糖，且含等量的乙酰基和硫酸残基，两者结构的差别只是在氨基己糖残基上硫酸酯位置的不同。 硫酸软骨素为白色粉末，无臭，无味，吸水性强，易溶于水而成粘度大的溶液，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂中，其盐对热较稳定，受热80?亦不破坏。游离硫酸软骨素水溶液，遇较高温度或酸即不稳定，主要是脱乙酰基或降解成单糖或分子量较小的多糖。 (二)生产工艺 硫酸软骨素广泛存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨，牛、马鼻中隔和气管中，在骨腱、韧带、皮肤、角膜等组织中也有。鱼类软骨中含量也很高，如鲨鱼骨中含50~60%。在软骨中，硫酸软骨素与蛋白质结合成蛋白多糖，并与胶原蛋白结合在一起。其提取分离方法有稀碱-酶解法、浓碱水解法、稀碱-浓盐法、酶解-树脂法。 1.稀碱-浓盐法 (1) 工艺路线: (2)工艺过程 ?提取 取经处理的洁净碎软骨置于提取罐中，加入3~3.5mol/L NaCl浸没软骨，用50%NaOH调PH12~13，室温搅拌提取10~15h，过滤。滤渣重复提取一次，合并提取液。 ?盐解 提取液用2mol/LHCl调pH7~8，升温至80~90?，保温20min，冷却后过滤，得清液。 ?除酸性蛋白 将盐解液调pH2~3，搅拌10min，静置后再滤至澄清，调pH6.5，加2倍去离子水调整溶液中的NaCl浓度为lmol/L左右。 ?沉淀 在清液中加入95%乙醇，使乙醇浓度60%，沉淀过夜。 ?干燥 收集沉淀，用乙醇脱水，60~65?，真空干燥，得成品硫酸软骨素。 2.稀碱-酶解法 (1) 工艺路线 (2)工艺过程 ?提取 取洁白干燥软骨40kg，加250kg2%NaOH于室温，搅拌提取4h，待提出液比重达糖化度5?(20?)时，过滤，滤渣再以2倍量2%NaOH提取24h，过滤，合并滤液。 ?酶解 提取清液，用1%HCl调pH8.8~8.9，升温至50?、加入1/25量的胰酶(1300g)，于53~54?保温水解6~7h。水解终点检查:取水解液10ml加10%三氯乙酸1~2滴，应仅呈现微混，否则需酌情增加胰酶用量。 ?吸附 以1%HCl调节水解液pH至6.8~7.0，加入活性白陶土7kg，活性炭200g保持pH6.8~7.0搅拌吸附1h，再用HCl调pH6.4，停止加热，静置过滤，得清液。 ?沉淀、干燥 用10%NaOH调节pH至6.0，加入清液体积1%量的氯化钠，溶解，过滤至澄明。加入95%乙醇至乙醇浓度达75%，偶加搅拌，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置8h以上。收集沉淀，无水乙醇脱水，60~65?真空干燥。 3.制剂 按配方含2%硫酸软骨素、0.85%NaCl，称取标示量107%的硫酸软骨素干粉(以纯品计)，撒人注射用水中，使其溶胀，搅拌溶解，再加入NaCl，调pH5.5，加热煮沸，用布氏漏斗过滤，滤液加入0.3~0.5%活性炭，加热至微沸，保持15min，用砂棒包扎滤纸趁热过滤，滤液冷却后，补加注射用水至全量，用3号垂熔玻璃漏斗过滤至澄明，按每支2ml灌封，灭菌，即得硫酸软骨素注射液。 四、透明质酸(Hyaluronic Acid)的制备 )结构与性质 (一 透明质酸是由(1?3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1?4)-O-β-D-葡萄糖醛酸的双糖重复单位所组成的酸性多糖，分子量50~200万。 透明质酸为白色、无定形固体，无臭无味，有吸湿性，溶于水，不溶于有机 D溶剂，水溶液的比旋度为[α]-70?~-80?，具有较高的粘度特性。下述因素会20 影响透明质酸溶液的粘度，如pH值低于或高于pH7.0，或有透明质酸酶存在时会引起分子中糖苷键的水解。许多还原性物质如半胱氨酸、焦性没食子酸、抗坏血酸，重金属离子和紫外线、电离辐射等也能引起分子间的解聚而造成粘度下降。 (二)生产工艺 制备透明质酸的常用原料有公鸡冠、眼球玻璃体、人脐带、猪皮、免皮等。工艺过程包括提取，除蛋白等杂质，分级分离，有机溶剂沉淀等。纯化方法有离子交换层析法、制备电泳法、凝胶过滤法和吸附法等。 1.工艺路线 2.工艺过程 ?提取 新鲜鸡冠用丙酮脱水后粉碎，加蒸馏水浸泡提取24h，重复3次，合并滤液。 ?除蛋白，沉淀 提取液与等体积CHCl3混合搅拌3h，分出水相，加2倍量95%乙醇，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得粗品透明质酸。 ?酶解 粗品透明质酸溶于0.1mol/LNaCl，用lmol/LHCl调pH4.5~5.0，加等体积CHCl搅拌，分出水层，用稀NaOH调pH7.5，加链霉蛋白酶，于37?酶解24h。 3 ?络合、解离、沉淀 酶解液用CHCl除杂蛋白，然后加入等体积1%CPC，放置后，收集沉淀，3 用0.4mol/LNaCl解离，离心，取出清液，加入3倍量95%乙醇，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥，得精品透明质酸。 (三)作用与用途 透明质酸具有很大粘性，对骨关节具有润滑作用。还能促进物质在皮肤中的 2+2+++扩散率、调节细胞表面和细胞周围的Ca，Mg，K，Na离子运动。在组织中 的强力保水作用是其最重要的生理功能之一，故被称为理想的天然保湿因子，其理论保水值可高达800ml/g，在结缔组织中的实际保水值为80ml/g。此外，透明质酸还有促进纤维增生、加速创伤愈合作用。 透明质酸作为药物主要应用于眼科治疗手术，如晶状体植入、摘除，角膜移植，抗青光眼手术等，还用于治疗骨关节炎、外伤性关节炎和滑囊炎以及加速伤口愈合。透明质酸在化妆晶中的应用更为广泛，它能保持皮肤湿润光滑、细腻柔嫩，富有弹性，具有防皱、抗皱、美容保键和恢复皮肤生理功能的作用。