MTA对大鼠牙乳头细胞增殖和分化能影响的实验研究

MTA对大鼠牙乳头细胞增殖和分化能影响的实验研究 分类号,『,,—— 密级—— 硕士学位论文 ,,,对大鼠牙乳头细胞增殖和分化能力影响的 实验研究,,,,;, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,?,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ;,?桑桑?作者姓名: 李飞来 学科专业: 口腔临床医学 学院(系、所) 湘雅医院 指导教师: 阙国鹰教授 论文答辩日期墨丝鍪旦垫岛答辩委员会主席逊～～:) , 中南 大学 二,一 年五月 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名:扭日期:丝年(上月立目 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的，即:学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅:学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。 泓期:冱哟挈。„„,上 ,。,硕士学位论文 中文摘要 摘要目的 ,(体外原代培养大鼠牙乳头细胞(,,,,,,,,,,即,,,, ;,,,,，,,,,,)，鉴定并观察其生长状况，为下一步实验提供细胞来源 ,对比三氧化矿物凝聚体(,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,)和氢氧化钙对大鼠牙乳头细胞增殖和分化能力的影响，为,,,应用于根尖诱导成形提供实验依据。方法 ,无菌条件下解剖分离出生,,的,,系大鼠下颌骨磨牙牙胚(组织块法原代培养,,,;,，纯化后鉴定并进行相关实验 ,分别用不同浓度的,,,和氢氧化钙浸提液培养细胞,,，并设立空白对照组，通过,,,技术检测细胞增殖活性，筛选两种药物最佳作用浓度 (， ,用最适浓度的,,,和氢氧化钙浸提液作用细胞，并设立空白对照组，分别于,、,、,、,,检测细胞的增殖能力、分泌的碱性磷酸酶(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,)活性，于,、,、,,检测，胶原含量，比较,,,和氢氧化钙对,,,;,增殖及分化能力的影响。结果 ,通过石蜡切片,正染色、细胞形态学检查、免疫组织化学染色证明所培养细胞是,,,,,:体外培养的,,,;,呈梭形或星形，生长状态良好，原代培养第,天细胞进入生长旺盛期(第,天达到生长高峰。传代,次后，细胞增殖速度变缓、活力降低。 ,(高浓度(,,,,，,,)的,,,和氢氧化钙(,(,,,,,,,,)明显抑制细胞生长，低浓度(,,‖,及以下)的,,,和氢氧化钙 (,(,,,,譬,,及以下)可促进细胞增殖，差异有统计学意义(,,, ,,)。硕士学位论文 中文摘要 ,与对照组比较，,,,培养的刚),;,第,、,、,,增殖加速、,,,活性增强，第,、,, ，型胶原含量增加(差异有统计学意义 (,,,(,,)。与氢氧化钙比较，,,,培养细胞第,,时，,,,活性增强、，型胶原含量增加，差异有统计学意义(,,, ,,);第,,时，,,,和氢氧化钙组,,,活性与，型胶原含量未见明显不同，差异无统计学意义(,,,(,,)。结论 ,(体外培养的,,,;,具有良好的增殖和分化能力，可作为牙组织工程的种子细胞并为根尖诱导成形提供细胞来源。 ,(,,,能够促进,,,,,增殖和分化:与氢氧 化钙对比，,,,促进细胞分化更快(可能封闭根尖时间更早，有望替代传统的氢氧化钙作为根尖诱导成形材料。关键词大鼠牙乳兴细胞，三氧化矿物凝聚体，氢氧化钙，增殖分化硕士学位论文 英文摘要 ,,,,,,,,,,,,;,,,, , ,, ;,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,(,,,;,),, ,,仃,，,,,,,母,,,,,,,, ;,，， ,,,，,,, ;,,,,;,,, ,,, ,, ,,,,,,, ,,, ;,,， ,,,,;, ,,, ,,,,,,,,,,;, , ,, ;,,,,,, ,,, ,髓;,, ,, ,,,,,,,”,,,,,, ,,,,,,,,,(,,,),,,;,,;,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,印,,,, ;,,,,(,,,,,),,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,， ,,,,, ,,, ,,, ,,,印,,,,, ,, ,,,印,,,,;,,,,,(,,,,,,, , ,, ,;,,,, ,,,,, ,,兀,,丘, ,,,,,,,, ,, ,,九, ,, ,,,。,,,,,,, ,, , ,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,,,,砌),,, ,,,, ;,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,;, ,,,,,, ,,, ,,,,,,丘,,(,, ,,,,,, ,,, ;,,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,(,,,,, ,,,, ;,，,,,,, ,,,, ,,亡,,,,, ,,,,,;,扪,,,, ;,,;,,,,,,,,毫,,, ,,,, ;,,;,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,，, ;,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,,,(,,,,,, ;,?桑簦酰颍澹?,,,, ,,,“,, ;,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,, ,, ;,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,，,,,, ;,,,,, ,,, ,,,,,,, ;,,;,,,,“,, ,,,,, ,,, ,,,,,( , ,,,,, ,,,, ;,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,;, ,,,,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,，,,, ;,,;,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ;,,;,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,;,,,,,,，,,,,,;,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ;,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,墅?,, ;,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,?电,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,，,;,,,,,, ,,,,,,,,,。,,,,,,,,,,,(,,,),,, ，,,,, ,,,,,, ， ;,,,,,,,,,,,, ;,,，, ,, , ,(,(,,硕士学位论文 英文摘要,,,,,,, ,(,),;, ,,, ,,,,,讯,, ,,,,,,曲,, ,,,,,,“, ,, ,,,,,, ,,;,,,,,，;,,, ,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,;”,;,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,, ;,,,, ,,,,,,, ,,,州, ,,,, ,,,,,,,,,, ,订,,, ;,,，可,,;, ,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,, ,;,;, ,,,, ,,、 ,,, ,,,, ,,,, ,,,,曲;,,;,,,,,,,,,,(,,,‖,,),,, ;,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ;,,;,,廿,,,,,,(, ,, ,,,,,，),,,,,右;,,,，, ,,,，,,,,, ;,,,, ,,,州, ,,,,,,,, ;,,;,,,,,,,,,,(,,,,,, ,,, ,,,, ,,,, ,,‖,，),,, ;,,;,,,,,,,,,,,, ,,,,, ;,,;,,,,,,,,,,(, ,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,, ,叭,,‖,,);,, ,,,,,,, ;,,, ,,,,,,,,,,,,(,,, ,,) , ,,,,,,,, ,,,, ,,, ;,,,,,, ,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,;,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,“, ,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,，,,，,, (,,, ,,) ,,, ,,,,, ,,,,,, ， ;,,,,,,, ,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,, ,,,,，,, ;,,, ;,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,“,，,,,,, ,,,, ,,, ,, ,;,,,时,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ， ;,,,,,,, ,,,,,;, ,, ,,, ,,,,, ,,,, ,追,,矗;,,,,)?,,,,,,,, ,, ,,(,,, ,,)，,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,;,,,,;,,,,, ,, ;,,,,,, , ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,? ,,, , ,,,, ,,,,,,,,“,, ,,, ,,色,,,,,,,,,, ,,,?橹瘢?,,, ;,, ,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ;,,, , ,,,,,,,, ,,,, ;,,;,,, 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传统的根尖诱导成形材料是氢氧化钙，其诱导成功率较高,】。但由于治疗周期长、就诊次数多、操作复杂，再次感染和根折的风险较大【,】,,。因此有必要寻找一种新型有效的诱导材料。,,,作为一种牙髓病治疗的新型生物材料，因其具有良好的生物相容性、封闭性、诱导组织再生性，自,,,,年,,,等〔,】首次报道，,上来便成为研究热点。与其它常规修补材料相比，,,,具有疗效好、操作方便的优点。目前，它已被广泛用于直接盖髓、活髓切断、根管侧穿修补、髓室底穿底修补、根尖诱导成形以及根管倒充填等，特别是在根尖诱导成形方面，具有极大的应用前景【,】。许多实验均表明,,,具有诱导组织再生的能力，与细胞和组织接触后能够促进软硬组织的再生”,。有学者用,,,对狗根尖组织进行诱导，结果显示根尖周组织无炎症反应，根尖孔全部封闭,”。,,,,,,，,,等〔,〕用,,,对,例牙髓坏死的上中切牙进行根尖诱导，一年后复诊，检查发现根尖炎症完全消失，且,线片显示根尖有硬组织形成。目前，对于,,,在根尖诱导成形方面的研究大都集中在临床方面(对其具体机制的研究很少(鲜有,,,对牙乳头细胞增殖、分化能力影响的报道。因此(本实验首次尝试用,,,和氢氧化钙浸提液培养,,,;,，通过对比,,,和氢氧化钙对,,,;,增殖和分化能力的影响，探讨,,,在根尖诱导方面的作用效果和优势。 ,,,比色法是普遍应用于检测细胞增殖活性的方法，通过测定反应后的吸光度值(,,)值可反映细胞数量和增殖能力。 碱性磷酸酶(,,,,,,,,口,,,,,,诅,,(,,,)是骨和牙齿等矿化组织形成过程中的重要因子，在活化的成骨细胞和成牙本质细胞中有很高的表达，通过调控磷酸盐硕士学位论文 第一章的转运参与骨和牙本质的形成，目前许多实验研究证实,,,与细胞分化状态密切相关，细胞分化程度越高，分泌矿化基质的能力越强，则,,,活性越高,”。目前,,,己被广泛用于检测牙源性问充质细胞分化。 ，型胶原是牙本质有机成分中的主要物质，成牙本质细胞分泌的，型胶原等细胞外基质在胞外交织成网，进而矿化形成牙本质。成牙本质细胞，型胶原的表达变化可以反映细胞的成熟状态。因此(，型胶原可作为检测牙乳头细胞分化的另一标志四。 综上所述，本实验用形态学、免疫细胞化学等方法对体外原代培养的,，),;,生物学性状进行观察;分别用,,,和氢氧化钙浸提液培养,,,;,，通过对细胞的增殖、细胞分泌的,,,活性和，型胶原含量的检测，比较,,,和氢氧化钙对,,,;,增殖和分化能力的影响(探讨,,,在根尖诱导方面的作用效果、机制和优势(进而为临床应用,,,作为根尖诱导成形药物提供实验依据。硕士学位论文 第二章 第二章大鼠牙乳头细胞的体外培养 在牙齿发育过程中(牙乳头细胞起源于胚胎的神经嵴，具有增殖和分化的潜能，能最终分化形成成牙本质细胞【“。成牙本质细胞分泌，型胶原、牙本质涎磷蛋白等细胞外基质，进而矿化形成牙本质。本实验采用组织块法原代培养大鼠牙乳头细胞，为后续实验提供细胞来源。,(,材料,(,(,动物 出生,,的,,系大鼠，重】,,,,,，雌雄不拘。 ,(,(,主要试剂 ,,,,高糖培养基、胰蛋白酶(,,,,,,,(,,,,)、胎牛血清、青链霉素(,,,;,，美国)，,(,(,主要仪器 ;,,细胞培养箱饵,,,,,,，德国)，倒置相差显微镜、,,, ,,,,,酶联免疫检测仪(,,,,,,,，日本,。,(,方法,(,(,细胞原代培养 取,只出生,,,,系大鼠断颈处死(置于,,,酒精中浸泡消毒,,,(无菌条件下解剖下颌骨(图,,,)，放入含有青链霉素的, ,,,,,，, ,,,(,,, ,)缓冲液中漂洗，于下颁磨牙位置分离牙胚(图,(,)，随机选取部分组织进行鉴定，剩余组织剥离表面纤维囊膜，置于, ,,,,儿,,,(,,, ,)漂洗两次，将组织剪碎约,一,,,大小，用牙科无菌探针将组织块均匀铺于,,,,培养瓶底(事先用,,,培养液润湿培养瓶底)，各组织块间相距约, ,;,，小心，逐滴加入台,,,胎牛血清的,,,,高糖培养液约】,,，缓慢翻转培养瓶(勿使组织块漂浮)，置于,,?、,,;,拒温培养箱中进行培养(第二天续液,,】，每,,换液一次，每日在显微镜下观察细胞的生长情况井照相记录。待细胞生长至瓶底,,,时，采用差别消化法分离纯化牙乳头细胞:将,,,, ,,,胰酶滴入培养瓶中，使其覆盖到整个瓶底，,,?作用,,,,，显微镜下观察(当大部分棱形细胞变圆时加入,,,培养液终止消化(注意不要吹打)(按,:,进行首次传代培养，经过,—,次差别消化法传代后即可得到纯化的牙乳头细胞。此后进行,:,传代，每,,换液一次，每日在显微镜下观察细胞 ,硕士学位论文 第二章的生长情况并照相记录。取纯化的第,代,,,;,用于鉴定和相关实验，,(,(,细胞来源鉴定和,,染色 取纯化的第,代,,,;,(加入, ,,,胰酶, ,,】(,,?作用,,,，相差显微镜下观察，见大部分星形成纤维细胞样细胞变圃时终止消化。加入,,,培养液(用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞(使其成为均匀分散的细胞悬液(细胞计数板计数(密度调整为,×,,,,,,。将细胞接种到,孔板中的盖玻片上(尽量不让液体溢出盖玻片)(每孔，,，，小心放入,,?、,,;,二恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至,,,时取出盖玻片，, ,,,,,几,,,(,,, ,)漂洗,次，分别进行细胞来源鉴定和,,染色， 细胞来源鉴定:多聚甲醛固定生长在盖玻片上细胞】,,,,,,,，, ,,,,,几,,,(,,, ,)洗去多余的固定液。常规,,;法进行波形丝蛋白、角蛋白单抗染色，脱水，透明，封片，镜检。 细胞旺染色:多聚甲醛固定生长在盖玻片上细胞, ,—,,,,,，, ,,,,,几,,,,,,, ,)洗去多余的固定液。常规,,染色(封片，镜检。,(,(,细胞生长曲线测定 取纯化的第,代细胞，加入, ,,,胰酶, ,,,，,,?作用,,,,，相差显微镜下观察(见大部分星形成纤雏细胞样细胞变圆时终止消化。加入少量培养液，用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞(使其成为均匀分散的细胞悬液，细胞计数板计数，密度调整为,×,一，,，，将细胞接种于,,孔细胞培荠板中，每孔,,,,,，冕于,,?、,,;,:恒温培养箱中进行培养，定期换液。每天取,孔细胞消化计数(每次计数两次，取平均值，绘制生长曲线。,(,,细胞冻存和复苏 细胞冻存:预先配制冻存液(,,,,,,,，,,,胎牛血清)(置于,?冰箱内保存预冷。将多个培养瓶中的培养液去掉，加入, ,,,胰酶, ,，,,，,,?作用,,,，相差显微镜下观察，见大部分星形成纤维细胞样细胞变圆时终止消化。加入少量培养液，用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液，细胞计数板计数。然后将细胞收集于离心管中离心(,,,,,,,(,,分钟,。将预冷的冻存液加入离心后的细胞中(用滴管轻轻畎打混匀，使细胞浓度在,×,,,,, ,,, ,，札之间。在每支冻存管中加入,,,细胞悬液(密封后标记好细胞名称、种类、代次和冻存日期。将装好细胞的冻存管装入沙布袋内置入,?冰箱中,,,小时，再移至冰箱冷冻层((,,?)内,,,小时，之后吊入液氮容器颈部存放,小时，最后沉入液氯中。硕士学位论文 第二章 细胞复苏:从液氯罐中取出冻存管，直接投人,,?温水中，待细胞悬液融化后，用吸管吸出(移入离心管中，加入,,,培养液，混匀后低速离心，小心吸弃上清液，细胞计数(用培养液稀释至,,,,,,,,(取,滴细胞悬液，加,滴,,,台盼蓝溶液，混匀(用细胞计数板分别计数活细胞和死细胞(,分钟内)，计算细胞存活率。,(,结果,(,(,组织块来源鉴定 石蜡切片,,染色可见，分离得到的组织呈现牙胚结构(图,,,)。外层为上皮组织(内包含牙乳头组织。内、外釉上皮在颈环处形成缩余釉上皮，牙乳头内可见大量未分化细胞。证明分离所得组织为大鼠牙胚。,，,(,体外培养的,,,;,生物学特征,(,(,(,原代培养,,,;,形态学观察 原代培养第,,(细胞从组织块边缘爬出(圈,—,)，形态为星形或梭形(胞体两端有多个胞浆突起(胞核清晰，印为牙乳头细胞。原代培养第,,(大量细胞聚集在组织块周围(呈放射状排列(图,—,)。此时可见组织块周围出现上皮样细胞 (釉上皮细胞)(生长密集时形成“铺路石”样结构。原代培养,,左右(细胞可长满瓶底的,,,(此时采用差别消化法进行传代，传代后的细胞以多胞浆突的细胞为主，仅有少数的上皮样细胞(经,(,次差别消化法可得到纯化的,,,;,(图,(,、图,—,)， 纯化的,,,;,生长旺盛(,(,,即可传代一次。传代次数超过,次后，细胞生长速度减缓，形态发生明显改变(胞体变宽，,,再为典型的成纤维细胞样细胞，细胞内出现颗粒样物质。,(,(,(,细胞来源鉴定和,,染色: 免疫组化结果显示(培养的,,,;,呈明显波形丝蛋白染色阳性(图,?,)，角蛋白染色阴性(图,,,,)。 ,,常规染色显示，,,,;,为多胞浆突的成纤维细胞样细胞(细咆呈梭形或星形，核大、呈圆形或卵圆形，核仁明显(圈,—,,)。,(,(,,,大鼠牙乳头细胞生长曲线 从曲线中可以看出(图,(】)，,,,;,的数目随着时间的延长逐渐增多(曲线大体呈“,型”。细胞接种第,、,,生长较慢，第,,起细胞增殖加速进入对数生硕士学位论文 第二章长期，第,,细胞生长速度达到高峰，至第,,细胞数目达到高峰，此后生长渐缓进入平台期。第,,起(细胞间相互竞争抑制，细胞数目下降。 时间(,) 圈,(, ,,,;,生长?线,(,制论 ? 年轻恒牙是指虽已萌出(但未达咬台平面，在形态、结构上尚未完全成熟的恒牙，其牙髓腔宽大，牙根尚来形成(根尖孔呈开扩的漏斗状…。牙齿借助牙根与牙槽骨紧密相连，牙根的状态对牙齿的稳固非常重要。一旦发生牙髓炎症将严重影响牙齿继续生长发育，甚至造成牙齿脱落。虽然目前可用种植体修复缺失牙，但其价格昂贵且无法提供和周围组织天然、紧密的关系。因此，诱导根尖组织再.