猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N_糖基化分析

猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N_糖基化 17 卷 5 期Vol . 17 No . 5 生 物 工 程 学 报 Chinese J ournal of Biotechnology September 2001 2001 年 9 月 猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达 及产物的 N2糖基化分析 3 1 1 1 1 1 2 欧阳菁龙綮新魏平华杨林王章邢珂 1 ( )中山大学生物防治国家重点实验室 、生物医药中心 ,广州 510275 2 ( )广东省农业科学院 , 广州 510650 αα摘 要 利用含有强启动子 P和2MF 信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒 p PICZA 构建出含 PST 基因的重 AOX 1 αα组质粒 p PICZA2pST。通过电击将经 S ac ?酶切后线性化的 p PICZA2pST 质粒转化到巴斯德毕赤酵母 X233 菌中 ,并 + 筛选 Mut 表型的重组菌 。表达产物的 SDS2PAGE 和 Western blot 结果表明 ,分泌于胞外的 PST 蛋白分子量比天然 αPST 分子量稍大 ,而胞内的 PST 蛋白分子量与天然 PST 大小相同 。将经 S ac ?酶切后线性化的 p PICZA2pST 再次转 + α) (化重组酵母细胞 X233Πp PICZA2pSTMut ,所得表达产物的 SDS2PAGE 和 Western blot 结果显示 , PST 基因的表达水 平明显提高 ,且表达产生的蛋白均可发生正确的抗原2抗体结合反应 ,表达量达 956mgΠL 。将发酵液上清进行 N2糖 基化分析 ,显示 rPST 无 N2糖基化加工修饰 。 关键词 猪生长激素 , 巴斯德毕赤酵母表达载体系统 , 基因表达 , N2糖基化分析 () 文章编号 100023061 20010520520206 中图分类号 Q786 文献标识码 A ( ) ) 猪生长激素 Porcine somatoropin , PST是由猪脑 CAGCTGCTCTCCACGAAG23′由上海生工生物有 限公司合成 。垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质 激素 。它不仅能促进蛋白质的合成 ,减少脂肪沉积 , 11113 其 它 : T4DNA 连 接 酶 、所 有 限 制 酶 、丙 烯 酰 还能增加矿物吸收与滞留 ,是一种具有广泛生理功 胺 、N , N′2亚 甲 双 丙 烯 酰 胺 、p GEM 2T Easy Vector 能的生长调节素 。利用基因工程技术 ,人们已通过 System1 均购自 Promega 公司 ; RNase A 、辣根过氧化 1 ,4 5 物酶标记的羊抗兔 IgG 抗体为华美生物工程公司产 大肠杆菌原核表达系统、鼠胚胎成纤维细胞、 6 7 品 ;兔抗猪生长激素抗体由广东省农科院兽医研究 酵母细胞和杆状病毒表达载体系统将 PST 基因 所提供 ;天然猪生长激素 、酸洗玻璃珠 、3 ,3′2二氨基 进行了表达 。本文利用近年来研究发展最快的甲基 ( ) 联苯氨盐酸盐 、Endoglycosidase H 购自 Sigma 公司 ;硝 营养型巴斯德酵母 Pichia pastoris 对 PST 基因进行 了高效分泌表达研究 。 酸纤 维 素 膜 购 自 Schleicher &Schuell 公 司 ; YNB 、Bi2TM otin 、Easy SelectPichia Expression Kit 购自 Invitrogen1 材料和方法 公司 ;QIA quick Gel Extraction Kit 购自 Qiagen 公司 ; 1. 1 材料 Advantage 2HF PCR Kit 购自 CLONTECH 公司 。 ( ) 11111 质粒和菌株 : 含猪生长激素 PST基因的质 1. 2 方法 粒 p X32pST 由中山大学生物防治国家重点实验室保 11211 PCR 扩增 :参照试剂盒的 。α存 ;质粒 p PICZA 、大肠杆菌 TOP10F′、巴斯德毕赤酵 11212 酵 母 表 达 载 体 的 构 建 : 参 照 Sambrook 的 方s ) α( 母 X233 、GS115ΠAlbumn Mut、GS115Πp PICZΠlac Z 8+ TM 。法 () Mut 、Zeocin均购自 Invitrogen 公司 。 TM 11213 酵 母 的 电 击 转 化 : 参 照 Easy SelectPichia ( 11112 Expression Kit 的说明 。引 物 : 上 游 引 物 5′2CCGGAATTCCCAGC2 ) (11214 CATGCCCTTGTC23′下游引物 5′2GCTCTAGAAGGCA2 重 组 酵 母 Mut 表 型 的 筛 选 : 参 照 Easy Se2 收稿日期 :2001201216 ,修回日期 :2001204209 。 () 基金项目 :广东省自然科学基金资助 963007。 3 联系作者 。Tel :86220284112504 ; Fax :86220284036551 ; E2mail :jauntyoy @hotmail . com TM α() lect Pichia Expression Kit 的说明 。p PICZA2pST 为所需的重组质粒 图 2。 知 8 11215 表达产物的检测 :参照 Sambrook 的方法。 μ11216 糖蛋白的 N2糖基化分析 : 在 30L 发酵上清 μμ中加入 2L Endoglycosidase H ,总反应体系为 50L , 37 ?作用 5,15h 。 2 结果 2. 1 PST 基因的 PCR 扩增与测序 以含 PST 基因的质粒 p X32pST 为模板 , 根据运 行程序 :95 ?5min ,94 ?30s ,50 ?30s ,72 ?1min ,30 个 循环后 72 ?延伸 10min 进行 PCR 。电泳结果显示 , ) ( PCR 产物大小约为 580bp 图略,与预期大小一致 。 将 PCR 产物回收 ,插入到 p GEM 2T2Easy 载体上 ,进 行全自动序列测定 ,结果表明 ,除插入子的第 183 位 ( ) 发生同义突变 G ?A外 , 其它碱基均与 预 期 的 相 α图 2 重组质粒 p PICZA2pST 的酶切鉴定 同 。α Fig. 2 Characterization of p PICZA2pST by EcoR ?ΠXba ? α M. 1kb DNA ladder ;a . p PICZA digested by S ac ?;α2 . 2 含 PST 基因的重组质粒 pPICZA2pST 的构建 α b. p PICZA2pST digested by EcoR ?+ Xba ?从 p GEM2T2Easy2pST 上 用 EcoR ?、Xba ?双 酶 切出 α含 PST 基因的片段 ,并克隆到载体质粒 p PICZA 强启α2 . 3 重组质粒 pPICZA2pST 的电击转化及筛选 动子 P下游的 EcoR?+ Xba?酶切窗口中 ,构建 AOX1 μα将 5,10g p PICZA2pST 回收纯化 ,用 S ac ?酶 α() 重组质粒 p PICZA2pST 图 1。用 EcoR?、Xba ?双酶 切使之线性化后 ,用高压脉冲电流转化宿主菌巴斯 TMα切 p PICZA2pST , 得 到 大 小 2 个 片 段 , 大 片 段 约 μ德毕赤酵母 X233 ,转化物涂布于含 100 gΠmLZeocin α 316kb ,包含载体 p PICZA 的大部分序列 ; 小片段约的 YPDS 板上 ,28 ?培养 2,3d 。将得到的 20 个 X2 TMαμ 580bp ,为含 PST 基 因 的 片 段 。由 酶 切 鉴 定 结 果 可33Πp PICZA2pST 转化子再 转 接 到 500gΠmL Zeocin 的 YPDS 板上 ,得到 16 个能正常生长的含多拷贝基 因的重组菌 。 2. 4 转化子表型的筛选 α用无 菌 牙 签 挑 取 X233Πp PICZA2pST , 并 分 别 点 s ) (至 MM 板 和 MD 板 , 同 时 将 GS115ΠAlbumn Mut和 + α() GS115Πp PICZΠlac Z Mut 先后点至 MMH 板和 MDH () 板上 对照,28 ?培养 2,3d 。结果有 14 个在 MM+ 和 MD 板上生长速度一致 , 其表型为 Mut ; 有 2 个 s ( 在 MM 上生 长 缓 慢 甚 至 不 生 长 , 其 表 型 为 Mut图 ) 略。 2. 5 PST 基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及其表 达产物的鉴定 α 分 别 挑 取 1 个 X233Πp PICZA 、6 个 X233Π+ s α() α() p PICZA2pSTMut 和 4 个 X233Πp PICZA2pST Mut 的单菌落 ,接种至 BMGY 培养基 ,28 ?培养至 OD600 ?2 . 0,6 . 0 。离心收菌 ,并重悬于 BMMY 培养基中 进行摇瓶培养 。将培养液上清和细胞可溶蛋白样品 α图 1 重组转移载体质粒 p PICZA2pST 的构建 α进行 SDS2PAGE 检 测 , 结 果 显 示 , X233Πp PICZA2pST + αFig. 1 Construction of recombinant transfer plasmid p PICZA2pST () Mut 的培养液上清和细胞可溶蛋白样品均比 X2 αα2factor :2factor signal sequence and priming site ; MCS :multiple cloning α( ) 33Πp PICZA 的多了一条约 22kD 的蛋白带 图 3,而site ; myc + Histag : myc epitope tag and 6 ×His tag 6 生 物工程学报17 卷 522 αμp PICZA2pST 中 , 并 将 转 化 物 涂 布 于 含 1000gΠmL TM Zeocin的 YPDS 板上 ,28 ?培养 2,3d 。得到的转化 TM μ子再用 2000gΠmL Zeocin的 YPDS 板筛选 。 2. 7 PST 基因再次转化后的表达及其表达产物的 鉴定 随机挑 选 再 转 化 后 的 6 个 转 化 子 进 行 表 达 , αSDS2PAGE 检测结果表明 X233Πp PICZA2pSTΠ927 的表 α达 水 平 最 高 。 将 X233p PICZA2pSTΠ9 和 X233Π Π αp PICZA2pSTΠ927 的 培 养 液 上 清 和 细 胞 可 溶 蛋 白 进 图 3 表达产物 rPST 的 SDS2PAGE 检测 α行 SDS2PAGE 检测 ,比较发现 , X233Πp PICZA2pSTΠ927 Fig. 3 SDS2PAGE analysis of the expressed rPST α( 的表达水平比 X233Πp PICZA2pSTΠ9 的明显提 高 图 M. Mid2range protein molecular marker ;a . Supernatants ) ) (5,且分泌的 rPST重组猪生长激素与胞内 rPST 含 αfrom cultured X233Πp PICZA ; b. Supernatants from cultured ( ) 量的比值也相应增大 图 5 、图 6。进一步的 West2 αX233Πp PICZA2pSTΠ9 ;c . Soluble cellular proteins from ern blot 分析表明 ,培养液上清和细胞可溶蛋白中的 αcultured X233Πp PICZA ; d. Soluble cellular proteins from rPST 均 可 进 行 正 确 的 抗 原 ———抗 体 结 合 反 应 αcultured X233Πp PICZA2pSTΠ9 () 图 7。 s α) (X233p PICZA2pSTMut的 培 养 液 上 清 和 细 胞 可 溶 Π 蛋白样品中 22kD 的蛋白带不清晰 。这说明 , PST 基 + 因在 Mut 表 型 转 化 子 中 的 表 达 水 平 远 远 高 于 在 s αMut表 型 转 化 子 中 。从 6 个 X233p PICZA2pST Π + () Mut 中挑出表达量最高的 9 号 进 行 Western blot 分析 ,结果表明 ,其培养液上清和细胞可溶蛋白中均 有一条猪生长激素特异反应带 ,且上清中的比天然 α( ) PST分子量约为 22kD略大一 点 , 而 X233p PICZA Π ( ) 中为阴性结果 图 4, 这说明表达产物即为预期的 PST 蛋白 。图 5 再转化后培养液上清的 SDS2PAGE 检测 Fig. 5 SDS2PAGE analysis of supernatants after retransformation M. Mid2range protein molecular marker ; αa . Supernatants from cultured X233Πp PICZA ; α b,d. Supernatants from cultured X233Πp PICZA2pSTΠ9 ,921 ,927 图 4表达产物 rPST 的 Western blot 分析 Fig. 4 Western blot analysis of expressed rPST M. Mid2range protein molecular marker ; αa . Natural pST ; b. Supernatants from cultured X233Πp PICZA2pSTΠ9 ; 图 6 再转化后胞内可溶蛋白的 SDS2PAGE 检测 αc . Soluble cellular proteins from cultured X233Πp PICZA2pSTΠ9 ;Fig. 6 SDS2PAGE analysis of suluble cellular proteins αd. Supernatants from cultured X233Πp PCIZA ;after retransformation αe . Soluble cellular proteins from cultured X233Πp PICZAM. Mid2range protein molecular marker ; αa . Soluble cellular proteins from cultured X233Πp PICZA ; α2. 6 重组质粒 p PICZA2pST 的再次电击转化及筛选 b,d. Soluble cellular proteins from cultured ; X233Πp PICZα将经 S ac ?酶切后线性化的 p PICZA2pST 再次 αA2pSTΠ9 ,921 ,927 电击 转 化 到 已 整 合 有 多 个 PST 基 因 拷 贝 的 X233Π 图 7 再转化后表达产物的 Western blot 分析图 9 表达产物的 N2糖基化分析 Fig. 9 Analysis of N2glycosylation of expressed products Fig. 7 Western blot analysis of expressed products M. Mid2range protein molecular marker ; after retransformation αa . Supernatants from cultured X233Πp PICZAM. Mid2range protein molecular marker ; αb. Supernatants from cultured X233Πp PICZAΠ927 ; αa . Supernatants from cultured X233Πp PICZA2pSTΠ927 ; αc . Supernatants from cultured X233Πp PICZAΠ927 αb. Soluble cellular proteins of strain X233Πp PICZA2pSTΠ927 ; digested by Endoglycosidase H αc . Supernatants from cultured X233Πp PICZA ; αd. Soluble cellular proteins from cultured X233Πp PICZA ;e . Natural PST 3 讨论 2. 8 表达效率及表达量的测定 利用 SDS2PAGE 检测甲醇诱导时间对表达量的 本实验室曾将猪生长激素基因在杆状病毒载体 7 ,虽能保证真核蛋白的翻译后加工修 系统中表达影响发现 ,诱导后 12h 有表达产物出现 ,随着时间的 饰 ,但表达产物仅占 胞 内 可 溶 蛋 白 的 4148 % , 产 量 ( 延长 ,表达量逐步增大 。诱导后 72h 达到最大值 图 不高 ,不利于产业化研究 。本论文利用的巴斯德毕 ) 8,用日本岛津 CS 双波长薄层扫描仪扫 描 估 测 可 赤酵母表达体系是近年来发展最快的极具潜力的真 知 ,rPST 约占上清中可溶蛋白的 4718 % 。根据 Brad2 核表达系统 ,已成功地应用于多种异源蛋白的商业 ford 比色法测定得知 ,上清中可溶蛋白的总浓度为 9 ,11 2gΠL ,因此 rPST 的表达量约为 956mgΠL 。化生产 。本研究所采用的巴斯德毕赤酵母表达 α载体质粒 p PICZA 含有甲醇诱导型启动子 ———乙醇 α 氧化酶启动子 P和2MF 信号肽序列 。P可AOX ? AOX ? 有效防止外源基因表达产物对酵母生长可能产生的 α细胞毒性 , 2MF 信号肽序列可在蛋白质分泌到胞外 的过程中被有效切除 。加之巴斯德毕赤酵母仅分泌 很低水平的自身蛋白 ,这将更有利于重组猪生长激 12 素蛋白的分离与纯化。大多数情况下 ,包含多拷 贝基因的重组酵母菌株可生产出更 高 水 平 的 蛋 白 () 质 。获得多拷贝表达菌株有以下方法 : 1利用表达 TM 图 8 甲醇诱导 12,96h 培养上清的 SDS2PAGE 检测 载体中含卡那霉素或 Zeocin抗性基因的特点 ,不断 Fig. 8 SDS2PAGE analysis of supernatant from 12h to 96h after inducement TM () 提高 G418 或 Zeocin 在培养基中的浓度 ; 2将含多 M. Mid2range protein molecular marker ; α() a,g. Supernatants from cultured X233Πp PICZA2pSTΠ927 重表达盒的拷贝插入到一个载体质粒中 ; 3将目的 from 12 ,36 ,48 ,60 ,72 ,84 ,96h 基因的 DNA 片段在体外连接成串联体后再转化酵 13 母菌 。本研究利用电击法获得转化菌株 ,然后利 2 . 9 培养液上清中表达产物的 N2糖基化分析 TM μ() 用更高浓度的 Zeocin 500 gΠmL 进行筛选的结果 α 将 X233Πp PICZA2pSTΠ927 72h 的 培 养 液 上 清 用 证明 ,获得的转化菌株含多拷贝基因的几率比较高 。 N2糖基化酶 Endoglycosidase H 37 ?作用 5,15h ,SDS2 在此基础上 ,本研究还应用了一种“再转化”的方法 , PAGE 检测显示 ,经 N2糖基化酶作用的目的蛋白分 使 rPST 基因的表达水平进一步得到了提高 ,且培养 ( ) 子量没 有 减 小 图 9, 说 明 rPST 并 未 发 生 N2糖 基 液上清与胞内可溶蛋白中目的蛋白含量的比值也相 化 。分子量比天然 PST 偏大 ,很可能是由于 O2糖基 应增大 ,这说明有更大比例的 rPST 分泌至胞外 。表 化作用的结果 。 生物 工程学报17 卷 524 phage T7 lysozyme on the production of biologically active porcine so2 达的 rPST 水平达到 956mgΠL ,具有产业化潜力 。 matotropin in Escherichia coli from a gene transcribed by T7 RNA 在蛋白质的合成过程中 ,当分泌蛋白质的 N 端 polymerase . Gene ,1990 ,91 :275,279( 新生肽刚一出现 ,信号识别体 Signal recognition par2 4 ] Chen , H C , Hwang ,C F ,Mou ,D G. Long2term expression of the bio2 ) ticle ,SRP即与带有新生肽链的核糖体结合 ,使肽链 logically active growth hormone in genetically modified fibroblasts af2 ter implantation into a hypophysectomized rat . Enzyme Microb Tech2 延伸作用暂时终止或延伸速度大大减慢 ,一旦 SRP2 () nol ,1992 ,14 4:321,326 核糖体复合体结合到内质网上 ,蛋白质合成的延伸 5 ] Hwang ,L H , Chen B F ,Lee P L et al . Use of helper2free retroviral 作用又重新开始 ,直到完成蛋白质的合成 。分泌蛋 vector to direct a high expression of porcine growth hormone in mouse 白质经移位后进入内质网 ,在小腔内进行肽链折叠 、 () fobroblast cells. Biotechnol Appl Biochem ,1992 ,16 2:171,181 6 ] J ung J ,Lee M et al . Method for the production of porcine growth hor2 N 端信号肽的切除及初步糖基化作用 。然后产生转 mone using a synthetic gene in yeast cells. United States Patent 5 , 运小泡 ,进入高尔基复合体 。高尔基复合体对糖蛋 541 ,086 ,1996 白上的寡聚糖核作进一步的修饰与调整 ,并进行分 ( ) ( ) ( ) OUYANG J 欧阳菁,WEI P H 魏平华, YANG L 杨林et al . 7 ] 14 拣 ,直至将糖基化的蛋白质送往分泌粒。本研究 Expression of porcine growth hormone gene in baculovirus vector sys2 ( ) () tem. Chinese virology 中国病毒学,2000 ,15 3:285,290 所采用的酵母系统 ,其 N2糖基化和 O2糖基化作用都 8 ] Sambrook J ,Pritsch E F and Maniatis T. Molecular Cloning : A L abo2 是从内质网开始的 ,然后在高尔基体中作进一步的 nd ratory Manual , 2ed , New York : Cold Spring Harbor Laboratory 加工修饰 ;而哺乳动物细胞的 O2糖基化最先定位在 Press ,1989 15 高尔基体。所以 ,胞内的 rPST 由于缺乏糖基化加 Romanos M A ,Scorer C A ,Clare ,J J . Foreign gene expression in ye2 9 ] ast :a review. Yeast ,1992 ,8 :423,488工修饰或糖基化程度很低 ,尽管在 N 端融合了信号 Sreekrishna , K. Strategies for optimizing protern expression and secre2 10 肽的 89 个氨基酸 ,但与天然的已进行糖基化修饰的 tion in the methylotrophic yeast Pichia pastoris , In :Baltz ,R H , Hege2 成熟猪生长激素差不多大 。又因为巴斯德毕赤酵母 ( ) man , G D , Skatrud , P L ed. , Industrial Microorganisms : Basic and 中糖蛋白的糖基化程度虽比酿酒酵母中低得多 ,但 Applied Molecular Genetics , American Society of Microbiology , 16 Washington ,D C ,1993 ,pp . 119,126 仍比哺乳动物细胞中的要大一些,所以分泌至上 ( ) Sreekrishna K , Kropp , K. Pichia pastroris . In : Wolf , K 1 ed. ,Non2 11 清中的 rPST 的分子量比天然 PST 大 。 Conventional Yeasts in Biotechnology ,Berlin : Springer ,1996 ,pp . 203 巴斯德毕赤酵母在分泌加工的过程中将 N2和 ,252 O2糖添加到糖蛋白上 ,通常 N2糖的早期加工比较保12 Barr K A , Hopkins S A ,Sreekrishna K. Protocol for efficient secretion 16of HSA developed from Pichia pastoris . Pharm Eng ,1992 ,12 : 48, 守 。巴斯德毕赤酵母中仅有极少百分比的糖蛋 15 51 白发 生 O2糖 基 化。从 rPST 的 N2糖 基 化 分 析 可 Thill G P ,Savis G R ,Stillman G R et al . Positive and negative effects 13 知 ,rPST 分泌过程中 ,几乎未发生 N2糖基化 ,这与其 of multi2copy integrated expression vectors on protein expression in ( ) 一级结构分析的结果一致 : PST 基因中未发现常见 Pichia pastroris , In : Heslot H ,Davies J , Florent J et al . ed, Pro2 th ceedings of the 6International Symposium on Genetics of Industrial 的 Asn2X2SerΠThr N2糖基化位点 ,但存在多个 O2糖基 Microorganisms , Strasbourg , France , societe Franaise de Microbiolo2 化的可能序列 ,这就说明 rPST 进行的可能是 O2糖基 gy ,Paris ,1990 ,pp . 477,490 化修饰 ,而几乎不存在 N2糖基化加工 。O2糖基化对 ( ) ( ) ( ) SHEN T沈同,WANG J Y王镜岩,ZHAO B T赵邦悌et al . 14 17 于蛋白质形成正确的二 、三 、四级结构至关重要, ( ) ( )Biosynthesis of protein , In : SHEN T 沈同, WANG J Y王镜岩 nd () ( ) ed, Biochemistry 生 物 化 学, 2ed ,Beijing : Higher Education且对于保证激素类信号分子的生物学活性也起到不 18 Press ,1995 ,pp . 411,414可缺少的作用。因此进一步研究 rPST 的 O2糖基 Philippe van den S ,Pauline ,M R ,Raymond ,A D et al . Concepts and 15 化作用将是件十分有意义的工作 。 principles of O2linked glycosylation. Critical Reviews in Biochemistry () and Mollecular Biology ,1998 ,33 3:151,208 )(REFERENCES 参考文献 Gemmill T R ,Trimble R B. Overview of N2and O2linked oligosaccha2 16 ride structures found in various yeast species. Biochim Biophys Acta , ( ) ] SU T Z 苏 悌 之 , Oxender D L , Rl2Geweley M E et al . cDNA 1 () 1999 ,1426 2:227,237recombinant of porcine growth hormone and expression in Escherchia Otvos L J r , Krivulka G R ,Urge L et al . Comparison of the effects of ( 17 coli . Chinese J ournal of Biochemistry and Biophisics 生物化学与生 amino acid substitutions and beta2N2vs. alpha2O2glycosylation on the ) () 物物理学报,1990 ,22 2:111,120 T2cell stimulatory activity and conformation of an epitope on the ra2 ( ) ( ) 2 ] YU X P 余旭平,QI S Z齐顺章. High level temperature induc2 bies virus glycoprotein. Biochim Biophys Acta ,1995 ,1267 :55,64 ible expression of porcine growth hormone in Escherchia coli . Chinese George ,A J T. Surface2bound cytokines2a possible effector mechanism ( ) () 18 J ournal of Biotechnology 生物工程学报,1991 ,7 4:307,311 in bacterial immunity ? Immunol . Today ,1994 ,15 :88,89 3 ] O’Mahony , D J , Wang , H Y , McConnell , D J et al . The effect of High Level Secretion Expression of Porcine Somatoropin Gene in Pic hia pastoris and N2 Glycosylation Analysis of Products 1 1 1 1 1 2OUYANG JingYANG LinLONG Qing2XinWANG Xun2ZhangXING KeWEI Ping2Hua 1 ( )State Key L aboratory f or Biological Control , Biopharmaceutical Center , Zhongshan University Guangzhou 510275 , China 2 ( )Guangdong Academy of Agricultural Sciences Guangzhou 510650 , China αAbstract The porcine somatoropin gene was inserted into the Pichia pastoris expression vector of p PICZA which contains AOX αα?promoter and2factor signal sequence . The recombinant plasmid of p PICZA2pST was linearnized by S ac ? and transformed into X233 by electroporation. The multi2copy insert transformants were selected and cultivated in flasks. SDS2PAGE and Western blot analysis showed that PST gene products were observed in the supernants with a little larger molecular weihgt size than the natural PST’s ,however ,the molecular weight size of the PST gene products in the soluble cellular proteins were identical to the αnatural PST’s. Retransformation of the linearnized p PICZ2pST showed the expression level was improved greatly and rPST has the same antigenicity as natural one . The expressed rPST accumulated up to about 956mgΠL . The N2glycosylation analysis showed rPST had no N2glycosylation. Key words porcine somatoropin , Pichia pastoris expression vector system , gene expression , N2glycosylation Received : January 16 ,2001 () This work was supported by Grant from Guangdong Nature Science Fund 963007. 3 Corresponding author . Tel :86220284112504 ; Fax :86220284036551 ; E2mail :jauntyoy @hotmail . com 科学出版社生物类图书精品推荐 () 863 生物高技术丛书作 译者 定价出版日期书号 ISBN 28 100 22212 203200892924ΠQ. 1019 017分子文库沈倍奋 李育阳 基因表达技术 基因治疗 38 100 0122219 7203200861220ΠQ. 991 顾健人 基因组科学与人类疾病 两 42 100 0122219 7203200907624ΠQ. 1033 陈 竺 系法杂交稻理论与技术 农 38 100 0122220 7203200898928ΠQ. 1025 卢兴桂 业微生物基因工程 生物安 45 100 0125228 720320091712XΠQ. 1043 日黄大全 方 70 100 0122220 7203200888420ΠQ. 1013 刘 谦 生物技术药物 水稻病毒 59 100 0122220 7203200907025ΠQ. 1031 马大龙 的分子生物学 转基因棉 李 毅 花 32 100 0122216 7203200887728ΠQ. 1011 贾士荣 作物 DNA 分子标记辅助育种 38 100 012228 7203200842824ΠQ. 965 方宣钧 42 100 012228 72032874327ΠQ. 1004 16 100 012228 7203200880028ΠQ. 1012 即日起 ,欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书 。凡购书者免邮费 ,且可享受各种折扣优惠 。请按以下方式联系我们 : 电话 :010 - 64011127 ,64002234 传真 :010 - 64034622 电子邮件 : directselling @sina . com 通讯地址 :北京东黄城根北街 16 号 科学出版社 邮政编码 :100717 联系人 :卢秀明 同时欢迎访问生 物编辑部主页 : http :ΠΠspbio . yeah. net 和网上售书合作伙伴 : http :ΠΠwww. biogene . com. cn。