实验性脊髓缺血性损伤后神经元病变的神经丝免疫组织化学研究

实验性脊髓缺血性损伤后神经元病变的神经丝免疫组织化学研究 实验性脊髓缺血性损伤后神经元病变的神 经丝免疫组织化学研究 ; / 实验性脊髓缺血性损伤后神经元病变的神经丝免疫组织化学研究——李长有,荨 实验性脊髓缺血性损伤后神经元 神经丝免疫组织化学研究 323 ? 基础研究? 的 李长有.林国宏//,z2, 摘要目的:观察实验性兔腰髓缺血40rain和再灌流4h的脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变. 方法:用免疫组织化学方法观察神经丝(neurofilaments,NF)抗体特异标记神经元胞体和轴突.并对其结 果进行图像结果:缺血40rain,脊髓前角运动神经元胞体和轴突内神经丝反应异常增强,胞体内神 经丝分布紊乱聚集.再灌流4h一脊髓前角运动神经元胞体和轴突内神经丝反应阳性,胞体内神经丝散 乱,稀疏,崩溃和溶解.轴突肿胀扩大,消失.图像分析了脊髓前角运动神经元胞体内神经丝的面积,灰 度和脊髓前索内轴突的数量,其结果具有明显的统计学意义.结论:神经丝免疫组织化学方法睢更清楚 地显示脊髓运动神经元胸体和轴突的病理学改变,脊髓损伤后细胞骨架紊乱在神经元的病理发病机制 中起重要作用. 关键调神经丝免疫组织化学脊髓 Theneurofilament chemicsp!halcordinJury/LIChangyou 199B,8(6):323,325 缺血兔硒 / studyofpathologicalchllilgesofillelil”oliltonexperimentalIs= LINGuohong//ChineseJournalofsp|mandsp|nIICm-d, AbstractObjactive:ThepathologicalchangesofcellbodiesandaxonsofmotorneuronsWereinvesti— gatedinrabbitslumbarspinalcordafter40minofischemiaand4bofreperlusion.Metbnd{Neurofilamen t (NF)antibodywasadoptedtolabelcellbodiesandaxonsspecificallyandwereobservedwiththeim— method.Theresultswereanalysedbytheimagepatternanalysis.ResultlTheexces— siremlsaecumulationofNFwasobservedinthecellbodiesandaxonsofmotorneuronsintheventral hornafter40rainofischemiaandthedistributionofNFinthecellbodieswasdiaturbedandacmula tire.TheNFt.eo.{2t~otx?uIdheshom-ainthecellhodieBsnd~,XOrtftof after4hofrepedusion,andthedistributionofNFinthecellbodieswasdivergent,rareanddislntegra— tire,theaxonawereswollenandvanish.Theareas,greylevelsofNFinthecellbodiesandthenumber8 ofaxonsintheanteriorfunlculusweremeasuredandthestatisticslanalysisshowedsignificantdiffer— ence.Conclusion:Thepathologicalchangesofcellbodiesandaxonsofmotoneuronsweredemonstrated clearlybyNFimmunohistochemicalreactlon,andthedisorderofcytomatrixplayedallimportantrolein thepathogenesisofneuronscellbodyandaxons. AuthorsaddressDepartmentofOrthopaedicSurgery?1stHospital,ChinaMedicalUniversity. Shenyang,Liaoning?110001 KeywordsNeurofilamentImmunohistoehemySpinalcordlschemiaRabbit 免疫组织化学方法在实验性脊髓损伤评价 1中国医科大学第一临床学院骨科110001沈阳市 2中国医科大学宿理教研室 收稿日期Il997—1230 方面的报遭较少.本实验应用神经丝(neurofi— lament.NF)抗体对实验性脊髓缺血损伤进行 了评价. 324 1与方法 I.I实验动物 健康雄性日本大耳白兔23只,体重2.1, 3.0kg,平均2.58+0.40kg.全部动物均在同一 实验室按相同饲养方法由专人饲养.室内空气 新鲜,温度保持在2O?左右.实验动物手术和 监测详见另文”. I.2免疫组织化学染色 缺血前,缺血40rain,再灌流4h,分别在活 体状态下,取同一伤段脊髓行病理学检查.标本 固定于10中性福尔马林液中.标本常规制 样,HE,尼氏染色供一般病理学研究神经丝免 疫组织化学方法如下:石蜡切片脱蜡和水化, 0.3HO:和甲醇(1t9)室温下孵育15min, 以阻断内源性过氧化物酶的活性.3正常羊血 清室温下孵育10min,减少非特异性背景.应用 鼠抗人NF抗体(Maxim,70KD+200KD)室温 下孵育60rain进行抗原抗体特异结合.生物素 标记的羊抗鼠IgG(Maxim)室温下孵育 10rain.加链霉素抗生物素蛋白一过氧化酶室温 下孵育10min.新鲜DBA溶液显色,显徽镜下 观察3,5rain,中性树胶封固.每步之间均用 PBS冲洗3次,每次3,5rain.阳性呈黄色,阴 性对照片用PBS代替第一抗体. I.3图像分析处理 应用日本Luzex—F型图像分析系统,在2O 倍物镜下随机测定缺血前,缺血40min,再灌流 4h各组脊髓前角30个有核细胞神经丝的平均 面积和平均灰度,同时渊定各切片脊髓前索内 轴突数量. I.4统计学处理 所有测定值以平均值士差示,统计 学意义通过MicrosottExcel5.0torWindows 电子表格软件中的,检查和t检查进行评价, P值d0.05为具有显着性差异. 2结果 2.I组织病理学改变 缺血前组:前角运动神经元轮廓清楚,多极 形,细胞核大多位于中央,核仁清晰可见,尼氏 体呈网斑状均匀排列于核周,胞浆均匀,深染, 前索轴突分布均匀. 缺血40rain组:前角运动神经元肿胀,圆 形,胞核偏位,核仁尚清楚,尼氏体呈细尘状颗 粒,浅染,松散,捧列紊乱或位于细胞周边部.灰 质内可见大片出血.前索轴突分布较散乱. 再灌流4h组:前角运动神经元固缩,变小, 呈三角形.胞核结构大多萎缩消失,尼氏体溶 解,消失,胞浆呈空泡状改变.前索轴突分布明 显紊乱,数量明显减步(详见另文”) 2.2神经丝免疫组织化学改变 免去第一抗体的标本都呈NF阴性反应. 缺血前组:前角运动神经元轮廓清楚,多极 形,细胞核轮廓清晰可见.NF染色呈丝网状均 匀分布于胞浆中(图1,插I)前索轴突分布均 匀,轴突NF染色均匀一致(图2,插I) 缺血40rain组:前角运动神经元肿胀,胞 核轮廓尚清楚,NF呈强阳性不均匀分布于胞 质中,神经丝排列紊乱聚集(图3,插-).前索 轴突散乱分布,NF染色强阳性(图4,插I). 再灌流4h组:前角运动神经元固缩,变小, 大致呈三角形.胞核结构大多萎缩消失NF染 色阳性,神经丝紊乱,稀疏,溶解,消失(图5,插 I).前索轴突分布明显紊乱,轴突肿胀,扩大, 消失,轴突内NF染色阳性(图6,插-). 2.3图像分析结果 缺血40rain组脊髓前角运动细胞NF平均 灰度(注:灰度表示图像各部分颜色的深浅程 度,切片底色越浅,灰度值越高.)明显低于缺血 前组(尸<O.01),再灌流4h组平均灰度低于缺 血前组(尸<0.05),且与缺血40rain组比较P d0.01结果见附表 缺血40rain组脊髓前角运动细胞NF平均 面积与缺血前组没有明显差异(P>0.05).再 灌流4h组平均面积较缺血前和缺血40min组 明显减少(Pd0.0I) 缺血40min组脊髓前索轴突数量低于缺 血前组(P<O.05),再灌流4h组轴突数量明显 减少,与缺血前组和缺血40min组比较尸< 001 经丝免疫组织化学研究——牵325 附衰脊?缺血再灌流NF图像分析结果士) 注,与缺血前相比,?代表P<OOl,代表P<0.05t?代表P>0.05 3讨论 脊髓损伤的基础研究方法很多,但免疫组 织化学方法应用于实验性脊髓损伤的研究很 少.本实验采用单克隆NF抗体特异地显示神 经元胞体和轴突的细胞骨架结构.结果显示缺 血40min,神经元胞质中NF呈强阳性反应,神 经丝紊乱聚集,轴突NF也呈强阳性,分布不均 匀,了缺血40rain神经元胞体和轴突有明 显的免疫组织化学方面病理学损伤.再灌流4h 神经元损伤进一步加重,NF反应阳性,神经丝 紊乱,稀疏,崩溃,溶解,轴突肿胀,扩大,消失. 说明再灌流4h神经元胞体和轴突损伤进一步 加重.上述结果用图像分析,经统计学比较而证 实.这与作者用脊髓血流(SCBF),超微结构,自 由基观察到的缺血后再灌注损伤结果一致”. 本实验证实神经丝免疫组织化学方法较一般病 理组织学方法能更清楚地显示脊髓神经元胞体 和轴突病变. 在细胞骨架结构中,NF是一神经元特异 中间丝,由神经丝蛋白构成,对于维持细胞的特 定形状及多种细胞生理功能具有重要意义.它 广泛分布于神经元的胞体和突起内,这种特异 性组织学分布是胚胎发育过程中获得并一直维 持下来的.神经丝由三种主要多肽类亚单位 (?0KD,160KD,200KD)组成,本抗体能与 70KD及200KD亚单位起反应,特异性标记脊 髓运动神经元和神经突起.. 缺血时,组织血供减少,ATP减少,膜泵功 能失灵.细胞不能维持通过细胞膜适宜的离子 梯度,Ca进入细胞内激活依赖性蛋白水解酶, 通过黄嘌呤氧化酶系统在缺血再灌组织中产生 大量自由基”.脊髓神经元胞体和轴突内脂质 过氧化水平增高,膜性结构受损,进一步增加了 ca从线粒体的释放及细胞外的内流,从而激 活了由钙激活的中性蛋白酶(cANP).CANP 在神经丝蛋白的代谢中起重要作用,可将髓鞘 蛋白分解成小泡状结构,并可将NF分解成小 片断,导致NF降解,细胞骨架解体,形成轴突 空泡样变性和Waller溃变”.实验证明,神经 生长因子可降低质膜脂质过氧化水平而稳定细 胞膜和膜性细胞器,稳定细胞内游离钙浓度t减 轻NF的受损程度:. 脊髓损伤后病理生理机制非常复杂,各种 原因均可引起神经元胞体和轴突病变.本实 验说明了细胞骨架紊乱在脊髓损伤后神经元的 病理发病机制中起重要作用. 4参考文献 1李长有,王星铎.叠明熙,等.应用激光多瞢勒血蓖仪监测 兔急性肯蕾缺血损伤后属矗血流动力学变化及病理学观 察的研究.中华骨科杂志?1997,5:299. 2Li…RKYenSH,SolomoaGE,etal_Intermediatefila— meritsinDe~’oUBtissues.JCellBiol,1918,79:637. 3DahlDImmunohistochemieaIdi{fegbetweenncur~ filamentsmperiLarye.dendritesandamExtCeLlRes, l983,149:397. 4BuldLeFGB.Freeradicalmediatedreperfusioninjury{… IectirevW.BrJCancer,1987t55:66 5SchLDepferWWNeur.{ilameats:Btructu,metabolos mandimplicationsindisease.JNeuropathoIExpNeurolt 1987,46:1l7. 6SchlaepferWW,MickoS.Chemicalandstructuralchanges ofneurilamemsintranseetedr&tsciatic?.JCelIH— ol,1987,78:369. 7PereaPoLoJR.ForemanPJJacksonGR,eta1.Nerve growthfactorand…rIcellath.MolNeurobinl, 1990,4:57 8PovlJshockJT.Traumatieal1yinduceBaxonalin~ty1patho genesidandpathobioLoglcalimplicatior=s.BrainPathoI, 】992,2:1.