射频消融治疗兔肝VX2肿瘤后消融病灶鬼影细胞的研究（可编辑）

射频消融治疗兔肝VX2肿瘤后消融病灶鬼影细胞的研究（可编辑） 射频消融治疗兔肝VX2肿瘤后消融病灶鬼影细胞的研究 第三军医大学 硕士学位论文 射频消融治疗兔肝VX2肿瘤后消融病灶鬼影细胞研究 姓名:王琦 申请学位级别:硕士 专业:外科学(普外) 指导教师:马宽生 20080501第三军医大学硕十学位论文 射频消融治疗免肝肿瘤后消融病灶鬼影细胞研究 摘 要 一、背景 手术切除是许多恶性肿瘤的首选治疗方法,然而常常由于肝功能的严重损 害、肝 外转移、门静脉的浸润及严重肝外疾病等原因,肝癌患者中能接受手术治疗 的只有% 左右。】。大部分患者不得不使用一些非手术治疗,因此一些以局部消融为特 点的治疗 ,、微波凝固、激光治疗、聚焦超声 手段,如射频消融治疗 等成为了肿瘤治疗的研究热点。其中,射频消融治疗因其具有微创、安全、有效、可 重复、操作简单等优点,在原发性、继发性肝癌局部治疗中获得了最广泛的应用【习】。 射频消融技术从年代初期开始用于治疗肝肿瘤,在射频治疗中,利用高频交流 电流 使肿瘤细胞组织内离子产生振动摩擦生热,最终导致肿瘤毁损破 坏。当温度超过,即刻引起细胞内蛋白质和脂质双分子层变性,导致细胞不可逆 性死亡。即使在较低的温度条件下一。,射频治疗维持?分钟仍然可以造成 细胞不可逆的损伤【 。当温度不足以造成坏死时还可以导致另一种形式的细胞死亡, 即凋亡【。经高温作用灭活后的肿瘤组织由于其细胞免疫表型的变化而具有瘤苗的功 能,可以进一步刺激机体的抗肿瘤免疫作用,从而发挥特殊的抗肿瘤作用。另外,由 于肿瘤内的血管迂曲不规则、血流缓慢、且缺乏神经调节,使肝脏肿瘤加热后,热量 散失较慢,故其升温较正常组织快。同时加热后细胞内酸性代谢产物对肿瘤细胞的杀 ,】。 伤作用明显加强,这些特点也进一步加强了热疗对肿瘤的治疗【 尽管目前已被广泛用于治疗各种肝脏肿瘤,并取得了好的效果,但在射频消 融治疗过程中,常常由于受到肿瘤大小、数量、解剖定位及其他因素的限制,而形成 不完全的毁损即残癌的发生。在射频治疗效果的评估中,以往认为病理学检查是最为 科学的方法,但随后的研究发现,染色下并不能科学的评判消融灶坏死范围。在 【】等的研究中,通过中空电极注射高张生理盐水射频消融兔肝脏肿瘤,研究发 现射频消融治疗数小时至数天后,部分消融组织在显微镜下形态结构仍保存完好,他 们称之为“鬼影’’现象。虽然这种现象还不曾被人们广泛了解,但是鬼影现象经常出 现在大多数热凝固治疗后,表现为瞬间的组织凝固和固定。鬼影现象通常出现在消融 毁损区域边缘至中心针道区的广泛区域内,在染色下,这种无活力的消融组织染 第二军医大学硕十学位论文 色比活体组织染色稍微偏浅,由于瞬间消融的组织细胞形态没有明显改变,很难将其 。 与活体肿瘤细胞区别开,容易造成消融病灶依旧存在残癌的误判‘’ 以往国外学者也仅仅报道在染色下发现鬼影细胞这种现象‘’’ ,并未深入 研究。究竟鬼影细胞能存在多久何时在消融病灶中消失它存在有何意义目『未见 系统研究报道。国外学者采用 组织化学染色 法,评价射频治疗后的消融灶,证实此方法评价消融病灶坏死范围是特异和有效的【孓 。借鉴这种方法可以将失活的鬼影细胞与残癌正确区分,为研究鬼影细胞提供了 可能。 二、研究目的 本研究通过动物实验,观察射频消融治疗兔肿瘤后病灶鬼影细胞存在的时间 及不同时间段形态变化。 三、实验方法与主要结果 .兔肝脏肿瘤模型的建立 将肿瘤组织切成约××的组织块【】,接种于只新西兰大 白兔肝脏,周后观察肿瘤的大小及生长情况。结果:?实验兔术后均正常存活,肿 瘤接种成功率%,肿瘤灶均位于肝左叶,其中有只动物发现肝内转移灶。?肿 瘤呈类圆形,无明显包膜,突出于肝表面,直径.左右,部分瘤块中心呈灰白色 坏死样改变。?镜下肿瘤细胞排列紊乱,呈浸润性生长。?周后肿瘤易发生肝、肺、 腹腔淋巴结等广泛转移。 .射频消融活体免肝探索射频控制条件 研究表明消融灶温度达到?即刻引起细胞不可逆死亡,保证消融彻底‘’。 应用只新西兰大白兔活体肝脏,探索在相同治疗功率下采用不同电极展开直径,能 达到?消融区域的范围。结果:?治疗功率均为,治疗后共产生个消融病 灶。?在电极展开直径、及时,平均消融直径分别为.、.、 .,超过?区域直径分别为.、.、.。?在相同电极展 开直径下,消融灶直径小于达到?区域的直径。 .射频消融治疗兔肝肿瘤后消融病灶鬼影细胞研究 前期建立的兔肝肿瘤模型,行控制条件下的射频消融治疗,取、、、、 、周共个时间段标本在相邻层面分别行和染色,观察鬼影细胞存在 时间及不同时间段的变化。结果:?染色证明消融病灶完全失活,鬼影细胞出 现在消融灶周边充血带区和中心针道炭化区域之间的消融毁损区内,数量不多,呈灶 第二军医人学硕十学位论文 状分布。?射频消融治疗兔肝肿瘤后,消融灶鬼影细胞形态至少能保持到治疗后 周,周后,鬼影细胞形态消失。 四、结论 、兔肝脏肿瘤模型,具有复制简单、成功率高、成瘤周期短及稳定的特点: 是在具有正常免疫能力的大动物体内建立的,良好肿瘤模型。能够很好的用于 肿瘤射频消融的研究。 .活体兔肝射频消融条件的探索对后续的兔肝肿瘤射频治疗具有重要的指 导意义,为保证消融灶彻底灭活提供了科学依据。 .鬼影细胞出现在消融灶周边充血带区和中心针道炭化区域之间的消融毁损 区 内,数量不多,呈灶状分布。 .射频消融治疗兔肝肿瘤后,消融灶鬼影细胞形态至少能保持到治疗后 周,周后细胞整体结构变模糊,周后鬼影细胞形态消失。 .治疗后判断消融病灶治疗效果,常规染色不可靠,必须加用染色 才能有效防止误判 关键词:射频消融 鬼影细胞 兔肿瘤肝脏肿瘤模型 第三军医人学硕十学位论文 :?,, ,略 , 、,, 【. ., ? , , , , , , ,’ , . , 艳, ’ 【?. , ?,? . 。, . ,。一。,? . ‘ , 曲曲?.’ ,..,, .. , , ’ 第三军医大学硕士学位论文 ; , ’., ’ , 【 . , 诧, , , , , . , ,.【】 ,“’’ . ,, , “” . ..? , . , .. 【’ , . , . ?‘、’ , . , 培 ’ 【 ?. ,. 第三军医人学硕士学位论文 . ,. . . × × 【, . . : ? ,%, ,.? , , , . ? ., , 、, ? ,. 。., 【’ . 、, 危。.:龟 , 、 , .? .、.、.,。 .、.、.。?,。 . :印第三军医人学硕士学位论文. 、 、 、 、 、 , ??, .:? , , 印.? 叩 .. .., , , .. . , 远 .曲 乏, . , , , . ??。 , : 、 、 、 、 第三军医人学硕士学位论文 英文缩写词表 英文缩写 英文全称 中文全称 彩色多普勒血流显像计算机断层摄片术冷冻治疗细胞外基质鬼影细胞肝细 胞癌苏木素和伊红 高强度聚焦超声 激光治疗 ? 色下腔静脉微波凝固治疗 分钟磁共振 还原型辅酶 硝基蓝四唑盐吩嗪硫酸甲酯经皮醋酸注射经皮无水酒精注射 门静脉 射频 射频消融秒 选择性门静脉栓塞 经导管肝动脉栓塞化疗周第三军医大学研究生学位论文独创性声明 秉承学校严谨的校风和科研作风,本人申明所呈交的论文是我本人在 导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别 加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果,也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料, 与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 论文作者签名: 第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离 校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查 阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除外,可 以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名: 指导教师签名: 龚 日 期:第三军医人学硕士学位论文 射频消融治疗免肝肿瘤后消融病灶鬼影细胞研究 .??一 刖 吾 肝癌是人类最常见恶性肿瘤之一,目前全世界肝癌患者在万人以上,在我国 原发性肝癌发病率仅次于胃癌,排在第二位?。肝脏也是癌症转移的好发部位, 最常 见的肝脏内转移灶是由结直肠癌转移所引起【’。手术切除是肝癌治疗的首 选, 由于受肿瘤部位、大小、数量、血管侵犯和肝外转移及身体状况等因素的影 响,只有 约%的患者能够接受手术切除。已接受手术切除的患者,仍有相当高的复发率,其 年生存率只有一%【培】。近年来国外学者先后开展了许多微创性的局部治疗方 法,如经皮无水乙醇注射 ,、经皮醋酸注射,、冷冻 ,、射频消融 治疗 ,、微波治疗 ,、激光 治疗 ,、经导管肝动脉化疗栓塞 ,、聚焦超声等。其中射频消融因为微创、安 全、经济、并发症少等优点,逐渐成为目前国内外应用最广泛的肝癌局部治疗手段【。】。 射频消融治疗肿瘤的基本原理与微波、激光、聚焦超声的治疗机理相似,是应用 热损伤致肿瘤细胞坏死。将射频电极直接插入肝癌组织内,射频发生器产生频率为 ~的射频电流,通过使射频电极针周围组织中的带电离子高速震荡, 摩擦产热,局部温度达到?~?,当温度超过?时,电极针周围组织细胞发 生凝固性坏死,从而达到治疗肝癌的目的【。引。据先前的研究报道,射频消融对直径 肝癌的疗效已经得到充分肯定,单次治疗完全坏死率为?%,、、 年的生存率可以达到.?%、..%、.?%。对于直径的肝肿瘤,单 次治疗完全坏死率为一%,肿瘤局部复发率达.?.%【。】。尽管射频治疗肝 癌在临床上取得了较满意的疗效,特别是对于无手术切除指征的小肝癌的治疗,治疗 后生存率较高,但是由于穿刺定位漏空现象等多方面因素影响,直径大于的肝癌 难以完全消融坏死,肿瘤术后复发率较高【。 在射频治疗效果的评估中,通常用超、、等在内部回声、血供变化、 坏死程度及密度改变方面的影像来进行疗效评价。超虽然具有操作方便、经济、可 实时显像的优势,但因其不能准确评估凝固性坏死的确切范围,对残余肿瘤也不能很 第三军医人学硕十学位论文 好鉴别,所以对术后长期随访的作用有限。和能准确判断热损伤范围,早期 发现复发或新生的肿瘤,可作为治疗后的疗效评价的首选方法。但是由于影像学技术 的限制,可能会漏掉某些微小病灶。以往人们认为消融灶采用病理学检查评价疗效是 更加科学的方法,射频组织灭活灶早期典型的病理特征为以电极为中心向外分为个 【】等研究发现,在热凝固 区域,?针道碳化区:?热凝固区;?充血出血带区。 区,由于温度迅速升高,细胞内的酶和蛋白质瞬问凝固,细胞来不及发生自溶 就已被固 定,因此形态结构保存完好,组织虽已经失活但形态上和活体组织非常相似,称之为“鬼 ”。在染色 影现象”,已发生凝固性坏死的肝脏肿瘤细胞形成“鬼影细胞曲 下,由于没有明显的细胞形态改变,很难将其与活体肿瘤细胞区别开,容易造成消融病 灶依旧存在残癌的误判‘’ 。鬼影细胞现象的出现,使人们对染色评价射频消融 灭活效果产生了疑问。 国外学者采用 组织化学染色法,评价射 ’ 频治疗后的消融灶灭活效果,证实此方法评价消融病灶坏死范围是特异和有效的【 ?。以往文献仅仅报道在染色下发现鬼影细胞这种现象‘’、’,并未深入研 究。究竟鬼影细胞能存在多久何时在消融病灶中消失它存在有何意义目前未见系 统研究报道。 本实验采用建立兔肿瘤模型,射频消融治疗后,组织标本引入组织 化学染色法,将失活的鬼影细胞与残癌细胞正确区分,观察其存在的时间及不同时间 段形态变化。课题主要从以下两个部分进行研究: 第一部分:兔肝肿瘤模型的复制及射频活体兔肝探索射频控制条件 第一节:兔肝脏肿瘤模型的复制 第二节:射频消融活体兔肝探索射频控制条件 第二部分:射频消融治疗兔肝肿瘤后消融病灶鬼影细胞研究 第三军医大学硕十学位论文 第一部分:兔肝肿瘤模型的复制及射频消融活体 兔肝探索射频控制条件 射频消融 ,是一种利用高频电流使组织中带电粒子 高速震荡摩擦产热,致使组织细胞发生凝固性坏死而达到治疗目标的临床治疗手段; 由于其微创、操作简单、经济、效果良好、术后恢复快等特点日益得到广泛的应用; 并逐渐成为肝脏肿瘤及身体其他部位肿瘤局部治疗的常见有效方法【“】。 在射频治疗效果的评估中,通常用超、、等在内部回声、血供变化、 坏死程度及密度改变方面的影像来进行疗效评价。但是由于影像学技术的限制,可能 会漏掉某些微小病灶。消融病灶采用病理学检查评价疗效以往被认为是最科学的方法, 等【、】研究发现在热凝固区,由于温度迅速升高,细胞内的酶和蛋白质瞬间 凝固,肿瘤细胞来不及发生自溶就已被固定,因此形态结构保存完好,组织虽已经失 活但形态上和活体组织非常相似,他们称这种已发生凝固性坏死的肝脏肿瘤 细胞为“鬼 影细胞曲 ”。在染色下,由于没有明显的细胞形态改变,很难将其与活体 肿瘤细胞区别开,容易造成消融病灶依旧存在残癌的误判。 为研究鬼影细胞现象,建立良好的肿瘤动物模型是实验成功的重要保障。以往以 具有免疫缺陷的裸鼠肿瘤模型为多见,这些模型的建立常需要较高的实验条件,实验 周期长、成功率低或因为免疫缺陷而未完全模拟肿瘤生长特性的全部病理过程,具有 种种的不足。肿瘤是由病毒在兔皮肤诱发的一种可移植的中分化鳞癌瘤株, 既往研究发现肿瘤可在兔体内具有丰富血供的皮肤、肝脏、肺等组织快速生长, 是目前临床研究肝脏肿瘤的常用理想模型【。射频消融是一种利用热能杀伤肿瘤细胞 的方法,由于高温热凝固形成的失活的鬼影细胞与活体肿瘤细胞在形态上难以区分, 保证肿瘤灶消融完全彻底是研究鬼影细胞的前提,否则仅在染色下容易将残癌细 胞误认为是鬼影细胞。以往的研究认为,当消融灶局部温度超过?,可立即引起胞 内蛋白质和胞膜变性,引起细胞不可逆性的死亡【吼。根据上述研究结论,在射频治 疗中若能使消融区域内肿瘤细胞温度达到?,则疗效可评价为%。实验中由于 肿瘤直径大小不同,治疗电极展开的直径也会不同,那么如何控制治疗电极展开直径, 从而保证不同直径的肿瘤均能在超过?的条件下彻底灭活,我们在活体兔肝首先探 索了射频治疗的控制条件,了解在射频治疗中,不同电极展开直径下,能达到?消 融区域的直径范围,从而为后续的肿瘤射频消融提供科学参考。第二军医人学硕士学位论文 实验第一节,建立兔肝脏肿瘤模型。第二节,射频消融活体兔肝探索射频控 制条件。 第一节 免肝脏肿瘤模型的复制 肿瘤动物模型在肿瘤病因学、发病机制及防治治疗等方面的研究上具有重要意义。 选择合适的动物模型是实验成功的重要前提,用于实验研究的肝肿瘤模型以鼠肝癌模 型较多。但由于鼠的肝脏体积小,可复制出的肿瘤较小,出入肝脏的血管也相对较细,因 此,鼠肝癌模型不太适合于射频以及介入治疗等方面的研究。目前,在较大动物建立的 肿瘤模型尚少,兔肝肿瘤是少数建立在较大动物的肝肿瘤模型,肿瘤具有生长速 度快、血供较丰富、较早出现坏死和转移等特点,表现与人类原发性肝癌类 似,是目 前临床研究肝脏肿瘤的常用理想模型。近年来不少学者将其用于介入、高强 度聚焦超 声、微波治疗等方面的实验研究‘’、引。本实验根据上述肿瘤特点建立肝 脏移植 瘤模型,观察肿瘤生长情况,待肿瘤生长?周后,用于后期的肝肿瘤射频治疗。 材料与方法 一、实验动物 成年健康新西兰大白兔只,体重.~.砖,月龄~个月,雌雄不限; 重庆市渝达实验兔场提供,于西南医院实验动物中心饲养。 二、实验材料 .基本药物 速眠新注射液:./支 军事医学科学院军事兽医研究所 .%氯化钠注射液:/瓶 西南药液股份有限公司 灭菌注射用水:/瓶 四川美大康佳乐药业有限公司 %硫化钠溶液: 第三军医大学教保处供应 .手术器械与用品 寸钳 寸钳 眼科镊,眼科剪 拉钩 持针器钢笳 组织剪 线剪 丝线 若干 注射器 若干 无菌手套 若干 】 无菌小纱布 若干 兔固定台 第二军医大学硕十学位论文 三、肿瘤细胞株 肿瘤荷瘤兔,由重庆医科大学实验动物研究所购买。 四、肿瘤模型制作 用耳缘静脉空气栓塞法处死荷瘤兔,常规消毒铺巾。取上腹部正中切口,无菌条 件下切取具有肿瘤组织的肝脏,剥取肿瘤并用生理盐水冲洗,切取肿瘤边缘具有 光泽呈鱼肉样活力旺盛的组织,眼科剪将肿瘤剪成约××的均匀组织 内禁食不禁饮,采用速眠新注射液 块,置于生理盐水中备用。实验动物术前 下肢肌肉注射.~./体重麻醉。麻醉生效后将实验兔仰卧固定,上腹部用% 硫化钠溶液脱毛。按外科无菌程序消毒术区皮肤,铺无菌巾。剑突下 处沿腹白线 作一长~ 的正中切口,逐层进腹,暴露肝脏,用镊子轻夹肝左叶将其拉出体外, 在距其下缘约~. 处用眼科镊沿肝包膜下向肝实质中央斜插约深,做成一 直径为的隧道见照片。取备用的肿瘤组织块植入隧道底部见照片,压迫止 血。沿植入肿瘤的肝叶表面向腹腔内加入 蒸馏水以杀灭操作过程中可能脱入腹 腔的癌细胞,依次缝合切口。术后待麻醉兔清醒,放入笼中观察饲养周。 结 果 一、动物一般情况 手术后实验动物均出现明显食欲下降、少动、嗜睡状态,天后全部恢复正常。 只新西兰大白兔术后均正常存活,所有动物均未发生腹腔出血,胆瘘及腹腔感染等 严重并发症。 二、接种肿瘤生长情况 在随后的射频前剖腹探查均证实肿瘤种植成功,肿瘤接种成功率为%。肿瘤 灶均位于肝左叶,其中有只动物发现肝内肿瘤转移灶,呈粟粒样大小分布于肝脏表 面,只动物出现肿瘤切口种植转移。肿瘤块突出于肝表面,呈灰白色结节样包 块,质地较硬,部分瘤块中心呈灰白色坏死样改变。肿瘤边缘生长旺盛,呈鱼肉样, 直径.左右,与正常肝组织分界欠清晰见照片。 三、肿瘤病理 肿瘤细胞染色低倍镜下表现为见照片:肿瘤组织与肝实质分界明显, 结缔组织较少,个别有完整包膜形成,有些肿瘤细胞聚集成癌巢样结构、肝索结构紊乱、 瘤巢边缘分布着被浸润的肝索结构。肿瘤细胞弥散排列,可见纤维间隔,新生毛细血管 第三军医人学硕十学位论文 丰富。肿瘤中心部分细胞因缺血发生坏死样改变。高倍镜下肿瘤细胞呈现中分化鳞癌 的特征见照片,异形性明显,形态不规则,体积较大,胞浆较少,细胞核大小形态 各异,排列紊乱,可见病理核分裂像。核染色深,染色质分布不均匀,核仁增大,数 目常增多。问质内可见淋巴细胞、浆细胞浸润。 论 讨 肿瘤是由病毒在兔皮肤诱发的鳞癌经数十次传代而建立,是一种可移 植的中分化鳞癌瘤株【,被广泛用于各种肿瘤模型的建立,如兔肝脏肿瘤模型、肾癌、 乳腺癌、骨肿瘤、子宫肿瘤等【‘删。兔肝肿瘤是目前唯一能在较大动物建立的 可移植性肝肿瘤模型。 肿瘤细胞在体种植成活主 肝肿瘤模型的制备方法国内外有较多报道, 要依赖于两个条件:浓度和环境,故有细胞悬液经皮穿刺直接种植法、细胞悬液经肝 动脉、门静脉注射法、剖腹直视下瘤组织块直接种植法等‘““,采用肿瘤细胞或悬 液直接种植成功率可达%,但较费时、费力,采用腿部皮下接种成瘤并传代作 为 瘤种进行肝脏接种虽然成功率不及前者,但较简单、经济,有报道成功率为%。 由于兔肝脏的左叶体积明显大于右叶,肝左动脉也比肝右动脉粗大,左叶血供较 丰富,故文献报道一般选择种植在肝左叶。本研究通过开腹方式,选取肿瘤生长最为 大小的瘤块移植到肝脏制成肝 活跃而又没有发生坏死时切除肿瘤,将肿瘤切成 肿瘤模型,既简单又方便;选取的瘤块生长旺盛且肿瘤细胞数量充足,保证了瘤细胞 正常生长的浓度;组织块成为瘤细胞抵御机体免疫力的屏障,延缓了清除过程,增强 了对新环境的适应力;由于开腹切口小,故模型建立创伤小,动物术后恢复快。术中 严格外科无菌技术,术后无需特殊处理,易管理。肿瘤接种成功率高达%。根据 自身体会,认为肿瘤接种成功率高的关键在于:?接种前的取材要选取肿瘤边缘生长 旺盛的部位,彻底去除结缔组织; ?肿瘤组织块大小尽量一致,接种部位距肝包膜的 深度一致;?取材、修剪及接种过程中严格注意无菌原则;?接种过程中注意无瘤技 术,术中避免瘤块接触非接种部位,瘤块植入后立即用压迫方法彻底止血,关腹『加入 蒸馏水以消灭可能脱落到腹腔内的癌细胞等。根据以上制作要点,不但提高了模 型制作的成功率,且复制出孤立的、大小较一致的肝脏肿瘤,增加了实验的可比 性。 在本实验中建立的荷瘤兔模型中,有只发生了肝脏转移灶,只出现肿瘤切口 第二军医大学硕十学位论文 种植转移,这与肿瘤具有较强侵袭转移能力有关。瘤株种于肝脏成活后呈 指数性生长,?周生长最旺盛,其体积迅速增大,切面呈实质性,中心无变性坏死,此 阶段为供瘤血管形成期,故较少发生坏死;周后由于肿瘤生长过快,血供逐渐不足, 肿瘤中心出现液化坏死灶,到第周可并有肝脏、肺和腹腔淋巴结转移,此阶段为供瘤 血管稳定期;~周肿瘤中心呈大片液化坏死灶并形成囊腔,此阶段为供瘤血管退 化期【 。故进行肿瘤传代、模型制作及进行实验研究时,不宜太晚,一般以周以内 为宜,以免因肿瘤坏死和转移影响实验观察结果。 、兔肝脏肿瘤模型,具有复制简单、成功率高、成瘤周期短及稳定的特点; 是在具有正常免疫能力的大动物体内建立的,良好肿瘤模型。能够很好的用于 肿瘤射频消融的研究。 、兔肝脏肿瘤由于具有较强的侵袭转移能力,并且瘤体中心容易发生液化 坏死,所以进行实验研究时,应在成瘤周以内为宜。第二军医人学硕十学位论文 第二节 射频消融活体兔肝探索射频控制条件 射频消融的原理是将射频电极插入组织内通过射频发生器发射.的射 频电流,使交变射频电流从插入电极末端向周围组织发射,随着电流方向的改变引起 局部组织中离子振动,相互摩擦产热,局部温度增高使肿瘤组织发生凝固性坏死,直 接杀灭肿瘤细胞从而达到治疗的目的。热杀死细胞主要有以下几个机制:?细胞膜损 伤,包括细胞膜的组成成分、胞膜通透性及流动性改变引起细胞死亡;?溶酶体损伤, 溶酶体内消化酶的释放引起胞膜破裂使细胞死亡;?合成、有关的蛋白质 受损伤而间接引起细胞死亡;?改变肿瘤内微循环的结构和功能,促使肿瘤细胞死亡。 当肿瘤细胞处于一?时,可引起部分肿瘤细胞凋亡【】;~?为热休克温度, 肿瘤细胞在?条件下 仍有一定数量的细胞恢复活性【】;在温度达到? ?,持续? ,可以造成不可逆的细胞损伤;当温度超过?,可立即引起胞 内蛋白质和胞膜变性,引起细胞不可逆性的死亡【’。根据上述结论,在射频 治疗中 若能使消融区域肿瘤细胞内温度达到?,则疗效可评价为%。本次实验就是基 于这个原理,射频消融活体兔肝脏探索在不同电极展开直径下,能达到?消 融区域 的范围。 材料与方法 一、实验动物 成年健康新西兰大白兔只,体重.~. ,月龄~个月,雌雄不限;重 庆市渝达实验兔场提供,于西南医院实验动物中心饲养。 二、实验材料 .基本药物 军事医学科学院军事兽医研究所 速民新注射液:./支 .%氯化钠注射液:/瓶 西南药液股份有限公司 %硫化钠溶液: 第三军医大学教保处供应 .手术器械与用品眼科镊 寸钳 寸钳拉钩 眼科剪 持针器钢盆 组织剪 线剪 第三军医大学硕士学位论文 丝线 若干 注射器 若干 无菌手套 若干 无菌小纱布 若干 兔固定台 .主要仪器设备 ?多极射频消融系统 四川绵阳立德电子技术有限公司 四川绵阳立德电子技术有限公司 多电极射频消融针见照片 中性电极 广东新会白生医疗器械有限公司 测温数字万用表 深圳市深有谷仪表厂 三、射频治疗过程 实验动物术前 内禁食不禁饮,采用速眠新注射液下肢肌肉注射.~ ./体重麻醉。麻醉生效后将实验兔仰卧固定,上腹部用%硫化钠溶液脱毛。按 处沿腹白线作一长 的正中 外科无菌程序消毒术区皮肤,铺无菌巾。剑突下 切口,逐层进腹,暴露肝脏,用镊子轻央肝叶将其拉出体外,肝脏周围垫生理 盐水纱布, 在距其下缘约.~ 处插入多电极射频消融针,测温电极探头置于肝脏表面,在 同一只兔的不同肝叶射频电极展开直径分别为、、,起始功率均为, 启动?多极射频消融系统开关见照片,随着治疗时间的延长,阻抗也 逐渐上升,直到达到最大,射频机自动停止工作,收回电极针并拔出针道。在 射频治 疗过程中,测温电极探头实时监测消融区域肝组织温度,测量温度超过?的 区域范 围见照片。治疗结束后,实验动物用耳缘静脉空气栓塞法处死,切取消融肝脏组织, 测量消融灶切面直径大小。 结 果 一、消融灶大体形态 实验动物射频治疗后共产生个消融病灶,射频毁损区直径大小在?范 围内,呈类球形。标本中心针道区呈黑色,为组织因高温严重脱水凝固炭化所致,毁 损区中央呈灰白色,组织变脆,消融灶周边水肿出血带呈暗红色,与周围下常肝组织 分界不清晰。 二、 不同电极展开直径的消融范围 治疗后消融病灶大小测量以毁损区灰白色区域的直径为标准,在相同的起始功率 下,随着射频电极展开直径增大,达到?的消融区域范围逐渐扩大,测量消融标本 时,消融病灶 直径也不断增加,治疗时间逐渐延长见表。在电极针展开直径为 第三军医人学硕十学位论文 时,消融病灶直径为 直径为 见照片;电极针展开直径为 见照片; 时,消融病灶直径为 电极针展开直径为 见照片 表 电极展开直径与消融范闸和大于?区域关系 从上表中可得到以下结果:在电极展开直径时,平均消融直径为., 超过?区域直径为.;在电极展开直径时,平均消融直径为., 超过?区域直径为.;在电极展开直径时,平均消融直径为., 超过?区域直径为.。 论 讨 鬼影细胞是存在于消融区内已经失去活力的细胞,其形态由于高温瞬间凝固并 固定下来,在染色下与活体细胞难以正确区分。研究鬼影细胞的前提必须保证 病灶消融彻底,不能存在残留有活力的细胞,根据文献报道,消融区域内温度超过 ?可使细胞瞬时灭活,造成不可逆的坏死,因此为保证后续实验具有科学依据, 本节先用活体兔肝脏射频消融探讨不同电解展开直径下,消融区域大小和超过 ?区域的范围。第三军医大学硕学位论文 实验中使用测温探头的敏感度很高,在治疗中能实时监测消融区域的温度,为保 证彻底消融提供了依据。射频组织灭活灶早期典型的病理特征为以电极为中心向外分 为个区域:?针道碳化区:由于针道周围温度过高组织呈炭化或汽化空泡改变;? 热凝固区:灭活的组织;?充血出血带区:位于坏死组织周围的活体组织,表现为充血、 出血、水肿和炎性细胞浸润。在充血出血带区,由于组织仍存在活性,所以在评判测 量消融灶直径时,通常采用测量病灶灰白色区域的大小,在此区域内,能保证组织彻 底灭活。从消融灶测量的平均直径来看,均小于测温探头测量的超过?区域的范围, 这是由于正常肝组织在达到?时,虽然肝细胞已经失去活力,但是同正常肝组织颜 色仍然十分类似。在温度达到?时,肝脏组织才能即刻呈现灰白色凝固性坏死表现。 射频治疗的热效应损伤半径受诸多因素影响,如治疗功率、肝脏质地、局部散热 情况、电极数量、生物种属等【’】。本实验中,在治疗功率恒定的情况下,在活体肝 脏实施射频治疗,可以近似的模拟肝肿瘤射频消融过程,为探讨随后的兔肝肿瘤 射频治疗控制条件提供了有效的参考。 .在起始功率条件下,随着射频电极展开直径增大,达到?的消融区域 范围逐渐扩大,测量消融标本直径也不断增加,治疗时间也随之延长。 .消融灶的平均直径小于测温探头测量的超过?区域的范围。 .活体兔肝射频消融条件的探索对后续的兔肝肿瘤射频治疗具有重要的指 导意义,为保证消融灶彻底灭活提供了科学依据。 第三军医人学硕学位论文 第二部分 射频消融治疗免肝肿瘤后消融病 灶鬼影细胞研究 射频消融 ,是一种利用高频电流使组织中带电粒子 高速震荡摩擦产热,致使组织细胞发生凝固性坏死而达到治疗目标的临床治疗手段, 由于其微创、操作简单、经济、效果良好、术后恢复快等特点同益得到广泛的应用, 并逐渐成为肝脏肿瘤及身体其他部位肿瘤局部治疗的常见有效方法【“。。以往采用 超、、等评价消融灶疗效,但是由于影像学技术的限制,可能会漏掉某些微 小病灶。病理学检查被认为是评价消融病灶疗效最为科学的方法,但是等【】研 究发现,在消融灶热凝固区,虽然肿瘤组织因高温凝固己完全失活,但是仍然发现一些 细胞的形态结构能够保存完好,和活体组织非常相似,他们称之为鬼影细胞 。在染色下,由于没有明显的细胞形态改变,很难将其与活体肿瘤细胞区别 开,容易错误的认为消融治疗不彻底,消融病灶依旧存在残癌。 究竟鬼影细胞能存在多久何时在消融病灶中消失它存在有何意义既然常规的 染色难以正确区分消融病灶究竟是鬼影细胞还是残癌细胞,那么我们研究鬼影细 胞就需要寻求如何区分两者的有效方法。通过 组织化学染色法,可以正确区分坏死无活力的鬼影细胞和残留有活力组织。残癌组织 中含量高,显色呈蓝紫色,而灭活组织中无,所以不显色‘’。】。应用 这种组化方法为研究鬼影细胞提供了技术条件支持。 实验的第一部分研究显示,兔肝脏肿瘤模型具有复制简单、成功率高、成瘤 周期短及稳定的特点,能够很好的用于肿瘤射频消融的研究。同时在活体兔肝探 索了射频治疗控制条件,为射频治疗兔肝肿瘤保证消融彻底提供了科学依据。在 第二部分的实验中,将对荷瘤兔行控制条件下的射频消融治疗,取不同时间段标本在 相邻层面分别行和染色,观察鬼影细胞存在时间及不同时间段的变化。 材料与方法 一、实验动物 肝脏接种肿瘤的荷瘤兔共只,肿瘤生长时间为?周,体重.~. , 月龄~个月,雌雄不限;由重庆市渝达实验兔场提供,于西南医院实验动物中 心 饲养。实验兔随机分为组,分别为射频消融即刻组、、、、、周组,每组 第二军医人学硕士学位论文 均为只。 二、实验材料 一主要试剂及药物 硝基蓝四唑盐 美国?公司 吩嗪硫酸甲酯 美国.公司 氧化型辅酶 美国?公司 乳酸钠溶液 上海生工生物工程技术有限公司 .磷酸盐缓冲液 北京中衫金桥生物公司 明胶 惠利试剂公司 甘油 北京红星化工厂 包埋剂 三医大防原教研室 苯酚 西南医院肝胆外科实验室 %甲醛溶液 西南医院肝胆外科实验室 西南医院肝胆外科实验室 蒸馏水 速眠新注射液:./支 军事医学科学院军事兽医研究所 .%氯化钠注射液:/瓶 西南药液股份有限公司 灭菌注射用水:/瓶 四川美大康佳乐药业有限公司 %硫化钠溶液: 第三军医大学教保处供应 二手术器械与用品眼科镊 寸钳 寸钳拉钩 眼科剪 持针器 组织剪 线剪 钢盆 丝线 若干 注射器 若干 无菌手套 若干 若干 无菌小纱布 兔固定台 三主要仪器设备 ~多极射频消融系统 四川绵阳立德电子技术有限公司 多电极射频消融针 四川绵阳立德电子技术有限公司 中性电极 广东新会白生医疗器械有限公司 测温数字万用表 深圳市深有谷仪表厂 三医大防原教研室 ?恒冷冰冻切片机 石蜡切片机 三医大防原教研室 第三军医人学硕十学位论文 型电子天平 德国公司 ?光学显微镜 西南医院肝胆外科实验室 一显微照相机 西南医院肝胆外科实验室 恒温培养箱 西南医院肝胆外科实验室 低温冰箱 西南医院肝胆外科实验室 移液器 西南医院肝胆外科实验室 粗滤纸 西南医院肝胆外科实验室 防脱载玻片 惠利试剂中心 液氮罐 话南医院肝胆外科实验室 三、实验方法 一射频治疗过程 实验动物术前 内禁食不禁饮,采用速眠新注射液下肢肌肉注射.~ ./体重麻醉。麻醉生效后将实验兔仰卧固定,上腹部及背部用%硫化钠溶液脱 的 毛。按外科无菌程序消毒术区皮肤,铺无菌巾。剑突下 处沿腹白线作一长 正中切口,逐层迸腹,探查有无肿瘤,用镊子轻央肝叶将其拉出体外,测量肿 瘤大小, 肝脏周围垫生理盐水纱布。将射频治疗针插入肿瘤中心部位,根据肿瘤大小 调整射频针 展开面积,测温电极探头置于肿瘤边缘.,开始射频治疗。射频治疗参数:输出 功率为,阻抗~ ,治疗时间为? 。随着治疗时间的延长,阻抗 也逐渐上升,达到最大,测温电极测得肿瘤边缘温度均超过?见照片,确保肿 瘤细胞完全消融,此时射频治疗机停止工作完成治疗,拔出射频针,沿消融肿 瘤的肝叶 表面向腹腔内加入 蒸馏水以杀灭操作过程中可能脱入腹腔的癌细胞,依次 缝合切 口。术后待麻醉兔清醒,放入笼中观察饲养。 二标本取材及处理方法 、、周共个时间点处死,取射 实验动物分别于射频结束后即刻、、、 频消融灶中心至肿瘤边缘未灭活的正常肝组织作为检测标本,每例标本分成 两份,一块 用%甲醛溶液固定,行常规切片染色,另一块用包埋后,放入液氮中速冻, 冰冻切片作肿瘤细胞活力染色。 .染色切片制作 %甲醛溶液固定组织块小时 梯度酒精逐级脱水 二甲苯透明第二军医人学硕学位论文 浸蜡、包埋、修块 切片厚度与贴片 脱蜡染色 脱水透明 封固 .组织化学染色切片制作 配置孵育液 ?硝基蓝四唑盐 ?.磷酸盐缓冲液 ... ?吩嗪硫酸甲酯 ?%乳酸钠溶液 ?氧化型辅酶 上述试剂依次加入,搅拌均匀使其溶解,经粗滤纸过滤除去其中杂质,放入棕 色 瓶中,?冰箱内保存。 另外配制甘油明胶封片剂:明胶加入蒸馏水,加热溶解,再加入甘油 ?,苯酚.,搅拌均匀,倒入瓶中备用。 制作冰冻切片 ?预冷:恒冷冰冻切片机预设切片刀温度为一,冷室温度一?。 × × 大小。 ?修剪:取出液氮保存标本,刀片修剪边缘,约成 ?切片:包埋剂包埋标本,切片厚度为。 ?冲洗:冰冻切片标本贴于防脱载玻片,蒸馏水冲洗后,室温下放置。 切片染色 ?标本入?孵育液。 ?蒸馏水冲洗切片,置室温下晾干。 ?甘油明胶封片剂封片。 阴性对照:为保证切片染色具有特异性,防止出现假阳性或假阴性结果,去除孵 育液中的乳酸钠,进行对照实验。 结果判断:染色反应采用四唑盐法,在活体细胞内含有乳酸脱氢酶,细胞内的酶 可使底物乳酸钠脱氢,氢传递给辅酶氢受体,再递给硝基蓝四唑豁,后者还原呈 蓝紫色颗粒沉淀于细胞浆中,使有活力的区域染成蓝紫色。消融灶内失活细胞中乳酸 脱氢酶被破坏,不能参与显色反应,故不染色。第二军医人学硕十学位论文 结 果 一、射频治疗结果 一实验动物一般情况 实验动物射频治疗后共产生个消融病灶,均位于左肝叶,射频消融治疗后动物 均出现明显食欲下降、少动、嗜睡状态, 后恢复正常。在观察的周时间内,有 只动物因术后腹腔内感染衰竭死亡,只因术后肿瘤复发转移至肝脏、肠系膜淋巴结 见照片、肺脏见照片而死亡。 二肿瘤消融灶大体形态 射频消融处理后即刻切除的标本大体呈类球形,消融灶边缘达到周围正常肝 组织, 消融区为灰白色,组织变脆,中心针道区可见黑色组织,为癌细胞严重脱水凝固炭化 所致。中心区外呈干燥的凝固性坏死,与周围组织界限清楚,周边充血出血带呈淡褐 色,瘤体较消融前有所缩小见照片。周组标本毁损区中央呈浅灰白色,周边水 肿带界限变清晰,最外层有少许菲薄的纤维带形成,厚约。周组标本毁损区中 央仍呈灰白色,但部分中心组织较软易破碎,周边出现白色半透明纤维带,厚约? 见照片。周组标本见毁损区内部分组织呈灰色,大部分中心组织坏死伴有 液化,周边纤维带显著增厚,由灰白色半透明变成白色,厚约?见照片。 周组标本毁损区内呈灰红色,大部分组织坏死、易破碎,周边纤维带呈白色,质地变 硬,较前有所增厚,厚约?见照片。周组标本毁损区内呈灰白色,大部 分组织变硬,被瘢痕组织代替,与周围正常肝组织分界明显。 三电极展开直径及消融范围 ,治疗结束 射频治疗前测量肿瘤直径为.? ,电极针展开直径为. , 时最大阻抗为~ ,治疗时间为? ,消融毁损灶直径为.?. 。 射频治疗中测温探头测量达到?区域直径为.?. 二、光镜观察切片 射频消融治疗当天标本,切面行染色,消融区外有活力的组织染成蓝紫色, 而消融区域未见染色,证明该区域内的肿瘤细胞己完全失去活力见照片。在相邻 切面行染色,低倍镜下见消融区内大片组织坏死,大部分细胞结构破坏,仅见组 织轮廓,细胞核碎裂、核固缩、核溶解,管内血液凝固,局灶性肿瘤细胞成为均匀红 染无结构物质,核消失见照片。消融边界达到肿瘤边缘正常肝组织,凝固性坏死 灶与周围正常肝组织分界明显,中间间隔充血出血带见照片,充血出血带外面的第三军医大学硕十学位论文 肝组织结构尚正常,肝细胞可有各种变性:水肿,空泡样变性,胞浆疏松化,淡染, 细胞核多正常。在高倍镜下,消融灶周边充血带区和中心针道炭化区域之间的消融毁 损区内,发现消融区域呈灶状分布一些失去活力的细胞箭头所示,其细胞核和胞体 形念清晰完整,与活体肿瘤细胞无明显区别见照片,这就是鬼影细胞。 射频消融治疗周后标本,相邻切面的染色证实消融病灶内不染色,灶内 细胞完全失活见照片。染色下,毁损区中心见部分坏死的肿瘤细胞开始溶解液 化,而旁中心区凝固性坏死的肿瘤细胞仍处于固缩状态见照片,高倍镜下在旁中 心区发现与活体肿瘤细胞形态无明显差异的鬼影细胞,呈灶状分布见照片。毁损 交界区出现宽窄不一的肉芽带,有较多的炎症细胞浸润,凝固性坏死区周边出现早期 机化现象。毁损交界区外肝小叶结构完整,但肝细胞出现肿胀、水样变性明显,部分 肝细胞出现双核、大核等修复性增生现象。 射频消融治疗周后标本,相邻切面的染色证实消融灶无活体细胞存在见 照片。染色下,毁损区中心见部分坏死的肿瘤细胞开始溶解液化更加明显,旁 中心区凝固性坏死的肿瘤细胞仍处于固缩状态见照片,高倍镜下仍发现部分灶状 分布的鬼影细胞,形态与活体肿瘤细胞类似,鬼影细胞出现的数量较前减少见照片 。消融灶边缘的肉芽带增多、增宽,伴有炎症细胞浸润。病灶周边的肝细胞肿胀、 水样变性减轻,肝细胞继续出现修复性增生现象。 射频消融治疗周后标本,相邻切面的染色证实消融灶无活体细胞存在见 照片。染色下,消融灶周边的肉芽组织逐渐被纤维、胶原组织所替代,形成胶 原化的纤维性包膜。纤维带外的肝组织趋于恢复正常见照片,毁损区中心见 溶解 坏死液化区范围进一步加大,旁中心区凝固性坏死的区域减少见照片。但在高倍 镜下仍旧观察到与活体肿瘤细胞相似的鬼影细胞,但是细胞核和胞浆染色稍偏浅见照 片。 射频消融治疗周后标本,相邻切面的染色证明消融区内不染色,病灶无 活力细胞见照片。染色下,消融区液化坏死灶出现纤维母细胞、新生毛细血管 及炎症细胞组成的肉芽组织,这些肉芽组织由外向内逐渐替代凝固性坏死组织。消融 灶外的肝脏组织经修复增生后,肝细胞已基本恢复正常见照片、。凝固性坏死 灶内只发现残存一些坏死的肿瘤细胞轮廓,细胞整体结构逐渐变模糊,与活体肿瘤细 胞形态可明显区分见照片。 射频消融治疗周后,相邻切面的染色证明消融区无活体细胞存在见照 片。染色下,消融灶内肉芽组织逐渐成熟,伴炎症细胞浸润,毛细血管减少,第三军医大学硕士学位论文 胶原纤维增多,纤维母细胞逐渐转变成纤维细胞。最后胶原纤维发生玻璃样变性,纤 维细胞和毛细血管成分明显减少,形成粗大的纤维结构,最终转化为瘢痕组织见照片 、。消融病灶见大片均匀红染的区域,染色变浅,高倍镜下已不见可辨认的肿瘤 细胞轮廓见照片,未发现鬼影细胞存在。 讨 论 射频消融在肝癌等恶性肿瘤的治疗中应用越来越广泛,在对消融治疗后病灶灭活 范围的评价中,以往的影像学和病理检查,被认为是特异有效的【。。但是在射频治 疗中由于高温瞬间凝固作用,病灶内有些肿瘤细胞形态被固定下来,虽然已经失活, 但是在染色下与活体细胞难以正确区分,这就可能造成对治疗结果的误判。研究 鬼影细胞的前提必须保证病灶消融彻底,不能存在残留有活力的细胞。根据文献报道, 要保证消融区肿瘤细胞完全灭活,病灶内温度超过?即可造成不可逆的坏死【 。本 实验在前期活体兔肝探索射频控制条件的基础上,明确了射频治疗中需多大功率、电 极展不直径和最大阻抗才能保证消融彻底。另外引入测温探头,实时检测治疗病灶温 度,为保证治疗彻底提供了科学依据。虽然采取了上述方法确保了兔肝肿瘤的彻 底灭活,但是由于肿瘤恶性程度较高,在射频治疗前可能已经发生肝内、肺脏、 腹腔淋巴结等处的转移,致使在射频治疗后的观察时间内,这些肿瘤转移灶复发,最 终使观察时限达到射频消融治疗后周的动物例数减少,仅有只存活至术后周。 消融病灶典型的病理特征是以电极为中心个同心圆区域:区为针道碳化区域, 由于针道周围温度过高组织呈炭化或汽化空泡改变所致;区为消融灶热凝固苍白区, 区域内的组织完全失活;区为充血出血带区,位于坏死组织周围的残存活体组织, 表现为充血、出血、水肿和炎性细胞浸润‘、。本实验结果表明鬼影细胞在射频当天 就已经存在,位于消融灶周边充血带区和中心针道炭化区域之间的消融毁损区内,数 量不多,呈灶状分布,中间间隔凝固性坏死区。直至观察到射频消融治疗后周,这 种失活的细胞依旧存在,数量比射频当天明显减少,除细胞染色稍微偏浅外,在形态 上无显著变化,染色下与活体肿瘤细胞不能明确区分。但是在射频消融治疗周 后标本中,消融区凝固性坏死灶内只能发现残存一些坏死的肿瘤细胞轮廓,细胞整体 结构逐渐变模糊,染色偏浅,与活体肿瘤细胞形态有明显差异,容易区分。观察至射第三军医大学硕士学位论文 频治疗后周,消融灶内鬼影细胞已经基本消失。据国外文献报道鬼影细胞长久存在 可能的机制是:一方面射频高温凝固作用使细胞形态固定,阻止了细胞内溶酶体酶类的 释放,延缓了后继的细胞自溶分解;另一方面,由于射频消融破坏了瘤内的血管,炎 症细胞,例如巨嗜细胞、中性粒细胞不能浸润这些区域参与组织自溶。因而细胞形态 能够长久保留下来【 。虽然鬼影细胞形态能存在至少周,但是随着消融区外肉芽组 织由外向内逐渐替代凝固性坏死组织,鬼影细胞最终趋于消失。 为证明消融灶内出现的是失活的鬼影细胞而不是残存有活力的肿瘤细胞,在本实 验中引入了组织化学染色法。以往国外学者采用染色评价射频治疗后 的消融灶,证实此方法评价消融病灶坏死范围是特异和有效的‘’’。染色 原理为:乳酸脱氢酶广泛存在于活体细胞的胞质内,代表了细胞的活力,它能催化乳 酸氧化为丙酮酸,同时将还原为,将传递给硝基蓝四唑盐使其 还原为不溶性的蓝紫色颗粒而沉淀于胞浆内。消融灶内细胞由于射频热损伤而失活, 胞内的乳酸脱氢酶被破坏,故胞浆不染色【。我们在中发现,有些肿瘤虽然经 过彻底的消融治疗,但是在肿瘤切除后的病理报告中,仍然报告存在残癌,认为消融 治疗不彻底,这种残癌究竟是真正没有灭活的肿瘤组织,还是由于高温形成已经失活 的鬼影细胞,在染色下通常难以辨别,容易造成消融病灶依旧存在残癌的误判。 以往国外学者也仅仅报道在染色下发现鬼影细胞这种现象,并未深入研究。本实 验中我们引入了细胞活力染色法来研究鬼影细胞,将鬼影细胞同残癌细胞正确 区分开,为观察鬼影细胞随时间变化提供了科学依据。 射频治疗肝癌前,采用穿刺活检,可能引起肿瘤沿穿刺针道播散转移,利用鬼影 细胞和活体肿瘤细胞形态相似的特性,在射频消融治疗结束后再行穿刺活检,如果在 活检标本中发现鬼影细胞,既可以表明病灶为肿瘤组织,又能避免肿瘤沿针道播散转 移。 本实验结果提示:治疗后判断消融病灶治疗效果,常规染色不可靠,必须 加用染色才能有效防止误判。由于技术条件限制,我们只能在组织切片相邻层 面分别采用染色和染色进行研究,今后如何在同一切面观察鬼影细胞,还 需寻找新的技术来支持。通过研究鬼影细胞,完善了对肝肿瘤射频消融治疗后病理学 形态变化的认识,为正确评判射频治疗恶性肿瘤的疗效提供了科学依据。第三军医人学硕士学位论文 .鬼影细胞出现在消融灶周边充血带区和中心针道炭化区域之间的消融毁损区 内,数量不多,呈灶状分布。 .射频消融治疗兔肝肿瘤后,消融灶鬼影细胞形态至少能保持到治疗后 周,周后细胞整体结构变模糊,周后鬼影细胞形态消失。 .治疗后判断消融病灶治疗效果,常规染色不可靠,必须加用染色 才能有效防止误判。第三军医人学硕士学位论文 全文结论 本研究通过肿瘤组织块接种于新西兰兔肝脏,建立肝脏肿瘤模型,?周后 控制射频条件及肿瘤边缘