血管活性肠肽对肺组织CTP：磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性的影响

血管活性肠肽对肺组织CTP：磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性的影响 血管活性肠肽对肺组织CTP:磷酸胆碱二胞 苷酰转移酶活性的影响 察v对该酶影响的量.效关系与时.效关手以厦蛋白激酶c抑制荆H-7 和钙调蛋白阻断剂w.7预处理后酶活性的变化=蛄果:?浓度为3x10real,L的v可引起微粒 体CTPI磷酸胆碱 二胞苷酰转移酶的活性增强,井随着v浓度增加,酶活性增加(P<001).?用 3×10..mol?L’.VIP作用8h,酶的 活性开姑显着增强(P<001),随着作用时间延长,酶活性避渐增加.?H’7和w.7可显着抑制 3×10,reel,L的 v对CTP:磷醢胆碱二胞苷酰转移酶活性的增强作用.站论:肺内神经肽v可促进成年大最肺 组织微粒体中CTP., 磷醢胆碱二胞苷酰转移酶活性,其细胞内信号转导连轻与蛋白激酶c和钙调蛋白有关. [关键词】血管活?陆脐肽;肺;CTP:磷醢胆碱二胞苷酰转移酶活性 [中国分类号】R332.2[文献标识码】A【文章编号】1000-5625(2002)(12-0099..03 Effectsofvasoactlveintestinalpepfideontheenzymeactivityof CTP:phosphorylcholinecytidylyltransferasefi’omtheratlung GUANCha-xiang,ZHOUFu-wen,LU0Zi—qia”g,etal, (口?rr矾c阿:1,X/a~ya&hodCe-z~South睁tch田4100”/8,c) Abstract:0bjot~tiveToinvestigatetheeffectofvasoaetiveintestinalpepfide(VIP)orltheIT1ie10s0 CTP:phcsoho~lcholinecyfidylyltransferaseactivityofculturedlungexplantsanditsmechanisms.MethodsThe CDP-[M-C]cholinecontentreflectingthemic~semalCTPIphosphoryleholinecytidylyltransfeactivityof culturedlungexplantsWaSmeasuredthliquidsnintillafion.Results?VincreasedthemicCTP: phcsphorylcholinee)~idylyltransferaseactivityofculturedlungexplantsinadose-dependencelnflJ1/lerandina time.dependencefashion;? Theeffeetof3×10”.mol?LVIPonthe~crosomalCTP:phosphoryleholinecyti— dylyltmnsferaseactivityofculturedlungexpimatsWaSinhibitedbyH-7,aproteinkinaseC(PKC)inhibitorand W,aealmodulinantagonistrespectively.Conclusion”vq_Pinthelungmaybe0neofthekeyregulatorsin一 ~lvedinthesynthesisofohosphatidylcholhnemediatedbyPKCandealnmdulin. Keywor~:vasoacfiveintestinalpeptide;CTPIphosohorylehollneidylyhransferase;lung [BullnlUlanMedUniv,2002,27(2):0099433] 肺表面活性物质(pulmortarysurfnetant,Ps)是维 持正常呼吸功能的重要物质,PS的缺乏或异常可引 起新生儿呼吸窘迫综合征(NRDs)或成人呼吸窘迫 综合征(ARDS)而危及生命.PS是由肺泡?型细胞 台成和分泌的脂蛋白复合物,由脂质,蛋白质和糖基 组成,其中磷脂酰胆碱(phcsphatidylcholine,Pc)是其 主要组分.在成人呼吸窘迫综合征发生中活性氧损 害PS台成的机制与?型上皮细胞内Pc合成的限速 酶一cI’P:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性降低有 关.血管活性肠肽(?P)是肺内含量颇为丰富的 :?”作者:蒋蕈耋鐾j嘉署牟溉套蓥婆击轰}嘉!研究.:家 ?湖南医科大学学报,2OO2,27(2) 神经肽,具有扩张平滑肌,增强支气管上皮细胞抗氧 化性损伤等多种作用’.作为效应广泛的神经肽, VIP可能参与Ps的合成调控,而国内外尚未见相关 报道.为证实该设想,本研究观察了VIP对成年大 鼠肺组织微粒体膜CTP:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶 活性的影响,并探讨其机制,以进一步了解肺内神经 肽VIP的生物学意义. 1与 1.1材料Wistar大鼠由中南大学湘雅医学院实验 动物学部提供,雌雄不拘,体重(223?36)g.DMEM 培养基(Giboe),VIP,w7,H.7均为Sigma公司产品; c磷酸胆碱为NENTM公司产品,其它均为国产分析 纯试剂. 1.2方法 1.2.1无血清成年大鼠肺组织培养氨基甲酸 乙酯(1g?kg)腹腔注射麻醉大鼠,75%酒精消毒 皮肤,开胸暴露心肺,肺动脉插管,用生理盐水冲洗 肺血,分离双肺,剪成约1II】T小块.预冷DMEM 洗3次,取加一30小块肺组织置于直径为30rllJll 培养皿中,加入不含血清的DI~IEM1m】(每m】含青 霉素100u,链霉素100g?m】),5%C02,37?培养6 h后按实验设计分别加入各处理因素.不同浓度 (10,,3×10,,10,3×10,mol?L)vIP培养16h 和3×10,mol?L..vIP培养2h,4h,8h,及16h后, 收集肺组织;于加入3x10,mol?LvIP前30min 分别加入钙调蛋白抑制剂7(10,mol?L)和 PKC抑制剂H7(10mol?L)以探讨vIP的作用 机制. 122肺组织细胞膜的CTP:磷酸胆碱二胞苷酰转 移酶活性的测定(1)分离提纯微粒体:对照组及 各处理组加人BufferA(50n眯唑,015MKCI.2 札?EDTA,pH7.4).按4m】?g湿肺组织匀浆1000 g和20000g分别4~C离心10min去除未破碎细胞 和线粒体.取上清100000g4~C离心60min分离微 粒体;加BufferB(50nm咪唑,0.15MKC1,2mkl EDTA,pH70)人微粒体,测蛋白质浓度,使各组酶 浓度一致,均为0.8rm】.(2)C一磷酸胆碱掺人 量的测定:加加微粒体蛋白人反应液(16mlVl c一磷酸胆碱,3.0rCTP,120mMM,50mkl咪 唑,2.0mlVlEDTA,38mlVlKCI,pH70)37反应25 min,反应终止液(10%三氯乙酸,150mlVl磷酸胆碱) 终止反应.6%活性碳吸附反应产物CDP-C胆碱, 1000g离心5rain,并用微孔滤膜(045Il?1)过滤收集 活性碳,用水反复洗涤3次后加入1提取液(乙 醇:氢氧化铵:水为190:11:1l8)反复萃取4次,液闪 计数测定CDP-”C胆碱的产量.CTP:磷酸胆碱二胞 苷酰转移酶(CT)活性用每毫克蛋白质nmol-rain 表示. 13统计学分析实验数据以?s表示,采用方差 分析.若F>0.05,组问比较则用q检验,P<0.05 示差异有显着性意义. 2结果 2.1VIP对CTP:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性影 响的量效关系用浓度为l0,,3×10,mol?L的 V口作用l6h,在浓度为3x10m01-L时即可引起 crP:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶的活性增强,并随着 VIP浓度增加,酶活性增加(r=0.97l4,P<001). 2.2vIP对CTP:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性影 响的时效关系用3×10mol?LVIP作用2l6 h,于作用8h时,酶的活性开始显着增强(P< 0.01);随着作用时问延长,酶活性逐渐增加.但作 用时间过短(<8h),VIP对酶活性的影响与对照组 相比,差异无显着意义(P>0.05,图1). o481216 Time(h) 圈1VIP对cn:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶恬性影响的时 教关系 F.1TheIdep目’d肌I缸0n0fsliH山effect0fva90奸d inle~tlmlpeptiae(~P)OI3cm踟tc1P:.hm? 曲ne一咖?(cr)哼 w_7和H.7对VIP预处理后crPl磷酸胆碱二胞苷酰转移醇括 Hg.2E口ectofw.7H-7mcrPlrIc}Idmeqdybn-嚣e性的影响(n=10)?与@@组比较,P<0_01 (cr)activity(n=9rP>0.o5饵叫,Hg3Thel伸.geffectofVIP(3x10一’mol?L’)mtIIemic瑚口_lBl c:I呷IIkll0I.眦dy黜(cr)由wagp ~lishedW_7mdH.7印ecy(n=10).?(0-101 回@ 4讨论 Ps合成的调控可通过离体肺,肺组织块培养及 肺泡?型上皮细胞培养三个水平来研究本实验通 过探索所建立的肺组织块培养作为研究Ps合成调 控的平台,具有实验条件易于控制,模拟性好的优 点,且测定cIP:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性即在 离体肺组织培养的基础上进行. Ps的主要成分PC是由胆碱在胆碱激酶和磷酸 胆碱胞苷酰转移酶作用下生成CDP-胆碱,然后与二 酰基甘油生成PC,而CTP:磷酸胆碱二胞苷酰转移 酶活性将直接关系到PC的合成速率,是Pc合成的 限速醇本室的前期工作证明肺内神经肽内皮 素1在生理浓度时能与肺泡II型上皮细胞的ETA 受体结合上调Ps的合成与分泌.研究表明,广泛 存在于人和动物呼吸系统内的v具有显着的抗 炎,抗损伤,扩张平滑肌,抑制嗜酸性粒细胞的释放 与黏附等作用.在表皮生长因子或其它应激条件 下,肺泡巨噬细胞,支气管上皮细胞等分泌的VIP明 显增多[9],而本研究结果显示,VIP能增强CTP;磷 酸胆碱二胞苷酰转移酶活性,表现出明显的量效关 系与时.效关系,从而促进Ps的主要成分Pc的合 成,提示肺内微环境中的神经肽VIP对Ps合成有重 要的调节作用. 钙调蛋白和PKC是细胞内信号转导的重要分 子为进一步探讨v口促CTP:磷酸胆碱二胞苷酰 转移酶活性的作用机制,本研究采用w.7和H.7分 别阻断钙调蛋白和PI,均显示抑制VIP对该酶的 上调作用,提示细胞内ca2.钙调蛋白以及PKC的激 活是vIP促Ps合成的细胞内信号转导的重要环节. 探讨VIP对Ps的作用将有助于进一步阐明肺内微 环境自稳态的调控网络,为呼吸窘迫综合征等临床 疾病的防治提供理论基础. 参考文献 LI】crimc?口wjSub/eth~畸I,epe~fi,::ieiohi~t*al’~ar qe?cellsm’faetamph~pidbi佣l}cTr[J.AmJ ,1995.268:U29—135. [2]秦晓群,孙秀醚.张长青.等.血瞥括性肠肽对兔支气管上皮细 胞抗臭氧损伤的保护作用[J]中国应用生理学杂志.1998.14 01:250—253. 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