清咽滴丸抗柯萨奇病毒B3,B5的实验研究

清咽滴丸抗柯萨奇病毒B3,B5的实验研究 清咽滴丸抗柯萨奇病毒B3,B5的实验研究 第17卷2期 2011年6月 天津医科大学JournalofTianjinMedicalUniversityVo1.17,No.2 Jun.2011181 文章编号1006—8147(2011)02—0181-04 清咽滴丸抗柯萨奇病毒B3,B5的实验研究 迟玮.陈霞,王小龙,褚玉晶,李志媛,李晓眠 (天津医科大学微生物学教研室,天津300070) 摘要目的:探讨清咽滴丸在细胞水平及血清水平对柯萨奇病毒 B3,B5(CVB3,CVB5)的抑制作用.方法:利用CPE法和MTT法 在细胞水平上检验清咽滴丸抗CVB3,CVB5感染的作用;观察不同时间段的含药血清抑制CVB3,CVB5的情况,进而在血清水平 上验证清咽滴丸的抗病毒作用.结果:(1)细胞水平上,清咽滴丸在7.81x10g/mL时对CVB3的抑制作用最好,在3.91x10~g/mL 时对CVB3的治疗作用最强.血清水平上,当血药浓度1:10且在灌胃65min时对CVB3呈现最好的抑制作用,抑制率达到 58.74%(P<0.05).(2)细胞水平上,清咽滴丸在7.81xlOg/mL时对CVB5的抑制作用最好,在3.91x10g/mL时对CVB5的治疗 作用最强.血清水平上,当血药浓度1:10且在灌胃85min时对CVB5呈现最好的抑制作用,抑制率达到74.23%(P<0.05).结 论:清咽滴丸有一定的抗柯萨奇病毒B3,B5的功效. 关键词清咽滴丸;柯萨奇病毒;CPE;MTr;血清药理学 中图分类号R373文献标识码A StudyofQingyandiwananti-CoxsackievirustypeB3,B5 CHIWei,CHENXia,WANGXiao-long,CHUYu-jing,LIZhi—yuan,LIXiao—mian (DepartmentofMicrobiology,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China) Abstract0bjective:TostudytheinhibitoryeffectofQingyandiwanonCVB3andCVB5atthecellularlevelandtheserumlevelin vitro.Methods:TheeffectivenessofQingyandiwanintheVerocellsinfectedbyCVB3andCVB5wereobservedbyCPEandM1Trmeth- odsatthecellularleve1.Theantiviralmechanismswereinvestigatedbytwodifferentways.TheeffectsofsernmcontainingQingyandiwan indifferentconcentrationsonCVB3andCVB5wereobservedinordertomakefurtherverificationontheantiviraleffeetivenessof QingyandiwanattheseYllmleve1.Results:(1)QingyandiwancouldinhibitthepathogenicityofCVB3whenQingyandiwanwasdiluted to7.8lxlOg/mLandcouldcurethecellsinfectedbyCVB3on3.91x10g/mL.QingyandiwanshowedthebestinhibitoryrateOllCVB3 jnl:10theaddiblequantityofdrug— containedsenltnaftergiventhedrug65min.Theinhibitoryrateof65rainwas58.74%(P<0.05).(2) QingyandiwancouldinhibitthepathogenicityofCVB5whenQingyandiwanwasdilutedto7.81x10g/mLandcouldcurethecellsin- fectedbyCVB5on3.91xl0g/mL.QingyandiwanshowedthebestinhibitoryrateonCVB5in1:10theaddiblequantityofdrug—con— tainedserumaftergiventhedrug85min.Theinhibitoryrateof85minwas74-23%(P<0.05).Conclusion:Qingyandiwanhastheeffects ofanti—CVB3andanti—CVB5. KeywordsQingyandiwan;Coxsackievirus;CPE;MTY;Seropharmacology 清咽滴丸是一种高效,速效中药制剂,具有疏 风清热,解毒利咽,消肿止痛的作用.在现代药理学 研究中显示出对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有 一 定的抑菌作用[11.同其它一些中药口含片相比,清 咽滴丸的抑菌效果较显着【2J,且稳定性好,无不良反 应[31.柯萨奇病毒B3(CVB3)是病毒性心肌炎的主要 病原],病毒持续感染可导致扩张型心肌病.柯 萨奇病毒B5(CVB5)主要引起脑炎,心肌炎,心包 炎,腹膜炎,肝炎,睾丸炎,疱疹性咽峡炎等,偶见皮 疹[8j.本研究旨在探讨清咽滴丸在体外(细胞水平及 血清水平)对CVB3,CVB5的治疗作用,为筛选新型 抗病毒药物奠定基础. 作者简介迟玮(1987一),女,硕士在读.研究方向:临床病毒学与分子 生物学:通信作者:李晓眠.E—mail:lxmian@126.tom. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病毒与细胞CVB3(Nancy株),CVB5(Kauchker 株),Vero细胞株均为本实验室保存. 1.1.2药物清咽滴丸由天津中新药业集团股份 有限公司第六中药厂生产,国药准字号Z10930004; 病毒灵由山西太原药业有限公司生产,国药准字号 H14023460. 1.1.3实验动物雄性健康SD大鼠6只,体重均 约250g,购自中国医学科学院放射医学研究所医 学实验动物中心. 1.1.4主要试剂和仪器RPMI一1640培养基(Gib— co);胎牛血清(Hyclone);四甲基偶氮唑蓝(MTD(Sig- ma);二甲基亚砜(天津大学科威公司);96孔培养板 182天津医科大学第17卷 (Costar);CO2培养箱(美国ThermoForma,3111型); 倒置显微镜(德国Zeiss,Axiorert200);酶标仪(Mul— tiskanMk3,ThermoLabsystems). 1.2方法 1.2.1病毒滴度测定根据Reed—Muench法计算 CVB3,CVB5的半数组织感染剂量(TCID).实验用 病毒浓度为100TCID5o. 1.2.2药物毒性测定取对数生长期的Vero细胞 100L/孑L接种在96孔板,置于37~C,5%CO培养箱 中24h,待细胞长成单层,弃培养液.连续倍比稀释 药液,浓度分别为2xl0-Eg/mL,lxl0-2咖L,5x10-3咖L, 2.5xlOg/mL,1.25xl0g/mL,6.25xl0g/mL, 3.125xl0g/mL,1.56xl0g/mL,7.81xl0g/mL, 3.91xl0g/mL,每稀释度4孔,另设正常细胞对照 组.培养72h,每13在倒置显微镜下观察细胞变化, 记录CPE. 1.2.3细胞水平上清咽滴丸对CVB3,CVB5的作用 1.2.3.1治疗法:在病毒吸附细胞2h后加入清咽 滴丸最大无毒浓度的0.5倍,1倍,5倍,l0倍,20倍 浓度药液【埘,每个浓度4孔,另设有病毒对照组,病 毒灵对照组,正常细胞对照组.培养72h,M1Tr,法[" 测定细胞存活率,计算抑制率.病毒抑制率(%)=(药 物处理孔A值一病毒对照孔A值)/(细胞对照孔A 值一病毒对照孔A值)xl00%. 1.2.3.2同时法:将清咽滴丸最大无毒浓度的0.5倍, 1倍,5倍,l0倍,20倍浓度药液分别与病毒混合, 接种到培养板上,每个浓度4孑L,另设病毒对照组, 病毒灵对照组,正常细胞对照组.培养72h,MTT法 测定细胞存活率,计算抑制率. 1.2.4血清水平上清咽滴丸对CVB3,CVB5的作用 1.2.4.1含药血清的制备:清咽滴丸按100mg/kg (相当于成人临床推荐剂量的6倍)给大鼠灌胃,给 药前禁水禁食12h.灌胃前第1次内眦采血,灌胃 后25min第2次采血,以后每隔20min采血1次, 每次取血约1.5mL,共6次.无菌分离血清,56?, 30min灭活后,将每个时间点血清样本分别用细胞 维持液稀释成1:2,1:4,1:6,hl0,1:16,一20oC冻存. 1.2.4.2最适血清浓度测定:不同时间点不同稀释 度的含药血清按每孔100ILL加到单层Vero细胞孔 中,每个浓度设4孔,另设正常血清对照组,病毒对 照组,病毒灵对照组.培养72h,每13在倒置显微镜 下观察细胞变化,记录CPE. 1.2.4.3含药血清对CVB3,CVB5的抑制作用:将 每个时间点血清样本分别用细胞维持液稀释成 1:10,按每孔100L加到单层Vero细胞孑L中,每浓 度设4孔,同时分别用100IxL100TCID50CVB3, CVB5感染细胞,另设正常血清对照组,病毒对照 组,病毒灵对照组.培养72h,MTF法测定细胞存活 率,计算抑制率. 1.3统计学方法采用统计软件SPSS11.0对数据 进行ANOVA单因素方差,各组间两两比较采 用SNK-q检验. 2结果 2.1Vero细胞形态学变化正常Vero细胞为梭形 或多边形,排列整齐紧密,呈上皮样,胞浆清楚,折 光性好.CVB3或CVB5接种于Vero细胞上第l,2 天出现细胞病变,细胞变小呈椭圆形或树枝状,细 胞内颗粒增多,折光性变差,3d后几乎全部固缩, 死亡,脱落,悬浮在培养液表面.清咽滴丸,病毒灵 及含药血清均是直接使细胞变小变圆,高浓度时直 接抑制细胞增殖,导致细胞迅速死亡. 2.2病毒滴度CVB3:TCIDso=10,CVB5:TCID50= 1O.7. 2.3药物毒性不同浓度的清咽滴丸接种于细胞 72h后,7.81xl0g/mL及其以下浓度未见细胞出 现明显形态变化,故清咽滴丸的最大无毒浓度 (TC0)为7.81x10g/mL.同理可知,病毒灵的TC0为 6.25x10#mL. 2.4细胞水平上清咽滴丸对CVB3,CVB5的作用 2.4.1清咽滴丸对CVB3的作用由表1可知在同 时法中加入TC.(7.81x10g/mL)清咽滴丸组能明显 抑制病毒增殖,与病毒对照组差别有统计学意义 (P<0.05),其余4个清咽滴丸组与病毒对照组差别 无统计学意义(0.05).镜下观察的结果跟统计结 果一致,说明清咽滴丸有抑制CVB3感染细胞的作 用,且7.81x10g/mL清咽滴丸组效果最好. 表1不同给药方法清咽滴丸抗CVB3的病毒抑制率(%) Tab1InhibitionratioofQingyandiwantoCWB3through differentgivenmemods(%) 与病毒对照组比较尸<O.05 在治疗法中加人5TC.(3.91xl0g/mL)清咽滴 丸组对病毒的治疗作用最好,与病毒对照组差别有 统计学意义(P<0.05),其余4个清咽滴丸组与病毒 第2期迟玮,等.清咽滴丸抗柯萨奇病毒B3,B5的实验研究183 对照组差别无统计学意义(尸>0.05).镜下观察的结 果跟统计结果一致,说明清咽滴丸有治疗CVB3感 染细胞的作用,且3.91x10g/mL清咽滴丸组效果 最好. 2.4.2清咽滴丸对CVB5的作用由表2可知在同 时法中加入TC0(7.81xlOg/mL)和0.5TCo(3.91x10 g/mL)清咽滴丸组能明显抑制病毒增殖,与病毒对照 组差别有统计学意义(P<0.05),其余3个清咽滴丸组 与病毒对照组差别无统计学意义(.05).镜下观察的 结果跟统计结果一致,说明清咽滴丸有抑制CVB5 感染细胞的作用,且7.81x10#mL清咽滴丸组效 果最好. 在治疗法中加入0.5TC.(3.91xl0#mL)清咽 滴丸组对病毒的治疗作用最好,与病毒对照组差别 有统计学意义(P<0.05),其余4个清咽滴丸组与病 毒对照组差别无统计学意义(尸>0.05).镜下观察的 结果跟统计结果一致,说明清咽滴丸有治疗CVB5 感染细胞的作用,且3.91x10g/mL清咽滴丸组效 果最好. 表2不同给药方法清咽滴丸抗CVB5的病毒抑制率(%) Tab2InhibitionratioofQingyandiwantoCVB5through differentgivenmethods(%) 与病霉对照组比较P<O.05 统计结果显示同种给药方法中,清咽滴丸抑制 CVB3和CVB5增殖或治疗CVB3和CVB5的感染 的结果差异无统计学意义(尸>O.05). 2.5血清水平上清咽滴丸对CvB3,CVB5的作用 2.5.1最适血清浓度测定由观察的细胞病变情 况可知,同一浓度不同时间含药血清的作用效果类 似,含清咽滴丸血清在稀释度为1:10以上时对细胞 的毒性作用明显减轻,故最适清咽滴丸血清浓度为 1:10. 2.5.2含药血清对CVB3,CVB5的抑制作用含药 血清在65min组和105min组时抑制CVB3增殖显 着,细胞存活良好,与病毒对照组差别有统计学意 义(P<O.05),但与病毒灵对照组差别无统计学意义 (P>0.05);其余4组含药血清与病毒对照组差别无 统计学意义(P>0.05).含药血清在65min组,85 min组和105min组时抑制CVB5增殖显着,细胞 存活良好,与病毒对照组差别有统计学意义(P< 0.05),但与病毒灵对照组差别无统计学意义(P> 0.05);其余3组含药血清与病毒对照组差别无统 计学意义(P>0.05).提示清咽滴丸在大鼠体内药 物浓度的峰值在65,105min之间,且抑制病毒增殖 的效果与病毒灵几乎没有差别.见表3. 表3含药血清对CVB3,CVB5的抑制作用 Tab3Inhibitedeffectofdrug-containedserumt0CVB3andCVB5 I,?,?,?组分别对应含药血清实验组,正常血清对照组,病毒对 照组,病毒灵对照组;与病毒对照组比较O.05 3讨论 柯萨奇病毒属小核糖核酸病毒科,肠道病毒 属.柯萨奇B组病毒是引起感冒,疱疹性咽炎,无菌 性脑膜炎,病毒性心肌炎,心包炎等多种疾病的病 原,经呼吸道,消化道传播.由该组病毒引起的心肌 炎,心包炎,无菌性脑膜炎等疾病死亡率都很高,对 人群潜在危险很大.目前,常用的抗病毒药病毒灵 虽然可有效抑制病毒复制,但病毒灵属核苷类似 物,毒性较大,甚至有致畸作用.因此,寻找更加安 全有效的抗病毒药物势在必行. 清咽滴丸是治疗咽喉疾病的良药,主选牛黄清 热解毒为君药,青黛清热解毒凉血,薄荷疏风清热, 冰片利咽散火止痛,三药辅牛黄为臣药;诃子人肺经,利咽散火,止咳解毒治失音为佐药;甘草清热利 咽,调和诸药,益气和中为使药.诸药合用具有疏 风清热,解毒利咽,消肿止痛功效,用于治疗风热喉\ 痹,咽痛,咽干,口渴或微恶风,发热,咽部红肿,舌 边尖红等急,慢性咽炎等症. 根据以上的实验结果,细胞水平实验证明清咽 滴丸具有很强的直接杀灭CVB3和CVB5的作用, 并且对CVB3和CVB5的治疗作用效果显着.在一 定范围内清咽滴丸对CVB5的抑制率随药物浓度的 降低而增强. (下转第186页) 186天津医科大学第l7卷 2.5对脏器重量及系数的检查各组大鼠的脏器 系数及脏器重量与对照组比较无显着差别. 3讨论 连续26周大鼠反复灌胃给予相当于人临床拟 用日剂量的50,25和l2.5倍的不同浓度同体积的 黄连合剂混悬液后,雌,雄动物体重,尿量,排便量, 饮水量,摄食量及一般体征与对照组比较均无明显 差异.血液学测定中,给药26周后各项检测指标与 对照组比较均无明显差异.血液生化学检查中,给 药z6周后,雌性动物中剂量组肌酐升高,雄性动物 低剂量组甘油三酯略有升高,虽有统计学意义,但 因未见剂量相关性与性别相关性,故认为不具有临 床毒理学意义.其他指标与对照组比较未见明显差 异.这些指标表明该药对大鼠的肝脏,肾脏,血糖无 明显影响.脏器重量及脏器系数检查,各剂量组动 物脏器重量和脏器系数与对照组比较无显着差别. 病理组织形态学检查中,大体观察各组动物主要脏 器未见明显病变.光镜下检查各剂量组与对照组 肝,肺间质组织均可见轻度炎细胞浸润,但相比较 并无显着性差别,所以并不具有毒理学意义. 综合以上结果,在本实验条件下对大鼠黄连合 剂26周反复灌胃给药后,在其心,肝,脾,肺,肾等 主要器官未见明显毒性反应.本品的无毒性反应剂 量定为7.5g生~j/kg. 参考文献: [1]李磊,胡广林,FrankSC,等.丹参抗氧化成分及其分布特性fJ】. 江西农业大学,2001,23(4):487 [2]黄诒森,张均田.丹参中三种水溶性成分的体外抗氧化作用田. 药学,1992,27(2):96 [3]中华人民共和国卫生部药政管理局编.中药新药研究指南【M】. 中华人民共和国卫生部药政管理局,1993:205—20r7 [4]王兆婴,李仪奎冲药新药研制开发与技术【M】上海:上海科学 技术出版社,2001:795—806 [5]徐叔云.药理实验方法学fM】.第3版.北京:人民卫生出版社, 20o2:231-233 [6]周海钧.药品生物检定【M】.北京:人民卫生出版社,2005:533—539 [7]石岩,梅世昌.医学动物实验实用手册[M】.jE京:中国农业出版 社,2002:l3—43 [8]巫向前.临床检验结果的评价[M】.北京:人民卫生出版社,2002: 256,360 (2OLO-O6—30收稿) (上接第183页) 中药血清药理学是指将中药或中药复方经口 给动物灌服一定时间后采集动物血液,分离血清, 用含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验 技术[.该方法可以在某种程度上克服中药本身理 化性质的不确定因素对实验结果的影响.以上的实 验结果证明,在一定范围内,随着血药浓度的增加, 其对细胞的毒性作用增强.通过比较同一浓度梯度 下,不同时间段含药血清的抑制作用可知,清咽滴 丸在大鼠体内药物浓度的峰值在65,105min之间. 同时发现,病毒灵对于CVB3和CVB5的抑制作 用及治疗作用均很显着.而清咽滴丸与病毒灵的抑 制作用及治疗作用几乎没有差别,但最适血清浓度 测定中CPE结果表明一定浓度的清咽滴丸对Vero 细胞的毒性远小于病毒灵,提示用安全有效的中药 代替病毒灵治疗病毒具有可行性,拥有美好的前景. 参考文献: ,李端.中国常用药品集【M】.上海:上海交通大学出版 [1]张瑶华 社,2006:1628—1628 [2]李亚玲,葛煅羲,郭长源.国产8种口含片(丸)杀菌率试验研 究.国际东西方优秀成果经典(中国卷)【M】.德国:德国英特哈 特出版社,1999:1176-1176 [3]齐伟,郭长源.中药清咽滴丸的研制和疗效观察【J】.华夏医药, 2006(2):ll0 [4]McmanusBM,ChowLH,WilsonJE,eta1.Directedmyocaridialin- jurybyenterovirus:Acentralroleintheevolutionofmurinemy. oearditis明.ClinImmunolImmunopathol,1993,68(2):159 [5]SatoS,TsntsumiR,BurneA,eta1.Persistenceofreplicatingc0x- sackieviIllsB3intheathrnf~cmufineheartisassociatedwilhde- velopmentofmyocardidslesion[J].JGenViml,1994,75(11):2911 [6]KandogR,l(inK,Zell11,或a1.Molecularmechanismsinll1e pathogenesisofenterovirusheartdisease:acuteallpersistentin— feetion[J].ClinImmunolImmunopathol,1993,68(2):153 [7]AndrolettiL,HoberD,BocguartP,eta1.ExperimentalCVB3-in— ducedChronicmyocarditisintworoutinestrains:evidenceofin— terrelationshipsbetweenvirusreplicationandmyocardialdamage inpersistentcardiacinfection[J].JMedVirol.1997,52(2):206 [8]贾文祥.医学微生物学【M】.北京_人民卫生出版社,2005:338-339 [9]王亚峰,张美英,郝静,等.苦丁茶水提物体外抗柯萨奇病毒B3 活性的实验研究[J].中华中医药杂志,2008,23(11):976 [1O]郝静,王一飞,张美英,等.地不容粗提物体外抗柯萨奇B3病毒 活性作用的实验研究叽.江苏中医药,2008,40(9):83 [11]王小燕,张美英,王亚峰,等.穿心莲水提取物体外抗柯萨奇病 毒B3作用的研究册.江苏中医药,2009,41(5】:7 [12]唐方.中医学嗍晾dB京大学医学出版社,2010:l,125,156,162 [13]贾波,石含秀,沈涛,等.中药血清药理学研究方法探讨与思考 fJ】.浙江中西医结合杂志,2009,19(5):319 (201o-o7—12收稿)