组蛋白H3的磷酸化与细胞有丝分裂的关系研究

组蛋白H3的磷酸化与细胞有丝分裂的关系研究 南开大学 博士学位组蛋白H3的磷酸化与细胞有丝分裂的关系研究 姓名:周浩 申请学位级别:博士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:黄熙泰 20080501 摘要 摘 要 细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，真核细胞有丝分裂是生物繁殖和生长发育的基础。核小体是构成真核生物细胞染色质的基本结构单位，组成核小体的组蛋白发生形式多样的翻译后修饰，包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化及,,,,核糖基化等。研究表明组蛋白共价修饰的不同种类及时间和空间的不同组合，诱导如,,,复制、转录(基因表达)、遗传重组、细胞分裂等一系列生物学过程。因而这些组蛋白的修饰及组合与它们的生物学功能的关系被称为“组蛋白密码”。 一些研究结果表明，组蛋白,,尾部(氨基末端)的磷酸化作用是发生在细胞有丝分裂过程中的特征性事件。为了研究组蛋白的氨基末端的磷酸化与有丝分裂的关系，在本学位论文的研究中，我们使用同步化、免疫印迹、免疫荧光标记、染色质免疫沉淀和激光共聚焦等技术，研究了组蛋白,,的磷酸化过程与细胞有丝分裂的关系。我们观察了,,,,,磷酸化,,在人乳腺癌细胞,,,(,和小麦根尖细胞内的动态分布，以其与染色体凝集的关系。研究结果显示，在,,,(,细胞中，组蛋白,, ,,,, ,的磷酸化作用发生在早前期细胞染色体的着丝粒处，成点状分布，继而在早中期达到最高水平，并在中期以点状集中在赤道板上，在后期开始脱磷酸化，并于末期完成脱磷酸化。这与,,,,,磷酸化,,定位于染色体的端粒区域明显不同，表明了不同的磷酸化位点在有丝分裂中可能存在着不同的功能。对于中期染色体，我们又通过染色质免疫沉淀(,,，,)实验证明,,,, ,磷酸化,,特异性的与着丝粒,,,结合，这与前面的免疫荧光结果是一致的。在胞质分裂过程中，我们又发现,,,,,磷酸化,,存在于中体区域，这表明其可能在胞质分裂中起重要作用，后来我们又分析中体复合物的成分证实它确实参与中体的组成。但是它在中体上的的定位与,,,,,磷酸化,,同样有着明显不同，,,,,,磷酸化,,在中体上呈现对称“钟状??结构，而,,,,,磷酸化,,呈一个“棒状??结构处于中央位置，连接着这两个“钟状体”，这个事实表明这两种磷酸化蛋白参与细胞的胞质分裂并有着不同的功能。 本论文研究了,,,, ,磷酸化,,在小麦根尖细胞有丝分裂过程中的动态分布。结果显示在小麦根尖细胞中，组蛋白的磷酸化与脱磷酸化也同染色体的 摘要凝集和解凝集过程存在着时间和空间的相关性。这表明，在动植物细胞之间，组蛋白,, ,,,,,的磷酸化具有一定的保守性。但是在动植物细胞之间也有区别，在,,,一,细胞中，磷酸化主要发生在着丝粒上，而在小麦根尖细胞中，磷酸化发生于整条染色体上。 另外，我们还初步研究了,,,,磷酸化,,在中国仓鼠卵巢上皮细胞(,,,)和人乳腺癌细胞(,,,(,)有丝分裂过程中的动态分布，发现其也与染色体凝集存在时间和空间上的相关性，但是它在磷酸化时定位于整个染色体臂，并且其在胞质分裂中不参与“中体”的组成，这与,,,,,磷酸化,,和,,,,,磷酸化,,是不同的。 研究结果表明，组蛋白,, ,,,, ,和,,,,的磷酸化与细胞有丝分裂染色体的凝集和解凝集过程有着时间和空间上的相关性。,,,,,和,,,,这些位点发生磷酸化作用，可使组蛋白,,氨基末端的正电荷数降低，改变了组蛋白一,,,间的相互作用。组蛋白,,的细胞内整体性磷酸化，可能是导致分裂期细胞染色质凝集的诱发因子，因此组蛋白,,的磷酸化可能导致核小体重构(,,,,,,,,,,)、变构，从而导致染色质凝集。由于发现,,,,,磷酸化 ,,在最终定位于“中体”。这些,,,, ,磷酸化,,可能来自于特化结构的核小体，可能是磷酸化导致,,的负电荷增加，因而增加与,,,的斥力，导致,,与,,,解离，为染色质重构和凝集提供了条件。但是这个推测尚待进一步证实。关键词:有丝分裂;组蛋白,,的磷酸化;免疫荧光标记;激光共聚焦显微术; 中体复合物;核分裂和胞质分裂 ? ,,,,,,;, ,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ;,,,,;,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ;,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,;,,,,,,, ,,,,, ,,,,; ,仃,;,,,, ,,,, ,, ;,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,(,,;, ,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,;,,,,,;,,,,,,, ,, , ,,,,;,,,,, ,,,,,,，,,,,,;,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,—,,,,,,,,,,,, ,;,,,,,,,,,，,,,, ,,,,,,;,,,,,，,,;, ,, ,,,,,,,,,,,,， ,,,,,,,,,,,， ,,,？,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,, ,,，,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,;,,,,,, ,,,, ,,;,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,;,(,,, ,,;,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ;,,,,,,, ,,,;,,,,, ,,;, ,,;,,,,,，,,,,,;,,,,,,,(,,,, ,,,,,,,,,,)，,,,,,,; ,,;,,,,,,,,,, ,,, ;,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,(,,, ;,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,, ,,“,,,,,,, ;,,,”( ,,,, ,,,,,,;, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,, ,,,, ,, ,,, ;,,,,;,,,,,,,;;,,, ,, ,,,,,,,(，, ,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，;,,, ,,,;,,,,,,,,,,,，,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,;,,;, ,,,,,,,,，,,,,,;,,,,;,, ,,;,,,;,,, ,,, ;,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,, ,,,,,(,,,;,,,,,, ,,,,,,; 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,,,,,,, ;,,,,,,;,,,,,,,,,,,, ,,, ;,,,,,,,,,, ，, 南开大学学位论文版权使用授权 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;(学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文;学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务;学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版;在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位 论文作者签名:冈潍 汹,年,月咖 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在 年解密后适用本授权书。 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: ,内部,年(最长,年，可少于,年) ,秘密,,,, (最长,, ，可少于,, ,三) ; ;机密?,,年(最长,,年，可少丁(,, 年) ; ,(，。。(。(((。。。((。((。(((((。。(((。(((((。((((。(。。 —(。(。。—。((。(一——(—。(， ———((—(((——(—((。((。(((((((。((((。(((—，(，。(。((。。。(。一 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名:闷游 加,年,月,,,日 丽吾 第一章 前言 第一节 真核生物有丝分裂的过程 细胞的有丝分裂最早是,,,,,,,,(,,,,)发现的。细胞分裂包括核分裂 (,,,,,,,,,,,,)和胞质分裂(;,,,,,,,,,,)两个过程，一般在核分裂后随之发生胞质分裂。高等真核生物中核分裂主要以有丝分裂的方式进行。增殖细胞经过间期的,,、,、,,、各期，重要的大分子，特别是载有遗传信息的,,,复制加倍，然后通过有丝分裂，被精确的分配到两个子细胞中。有丝分裂保证了细胞携带遗传信息的染色体一代代以相同的数目传递下去，从而维持了遗传的稳定性。有丝分裂是经过长期的生物进化过程而逐渐演变成的比较完善的分裂方式。在细胞分裂间期，染色质分散在整个核区，适于,,,的复制和,,,的转录，但是不利于遗传物质的均等分配。在有丝分裂过程中染色质凝集包装，成为形态与数量一定的染色体，通过有丝分裂装置及一系列复杂，精巧的过程，把染色体平均分配到两个子细胞中去。 动物细胞有丝分裂装置是指有丝分裂时产生的由微管及其结合蛋白所组成的星体(,,,,,)和纺锤体(,,,,,,,)。星体是指围绕中心粒(;,,,,,,,,)向外辐射状发射的微管。纺锤体是由大量微管纵向排列组成的中部宽阔、两极缩小的细胞器，形状像纺锤，因而得名。纺锤体由连续牵丝(;,,,,,,,,, ,,,,,,)、染色体牵丝(;,,,,,,,,,, ,,,,,,)及区间牵丝(,,,,,,,,,, ,,,,,,)三类组成。连续牵丝由一极通向另一极，但绝大多数连续牵丝并不是真正连续，而是来自两级的微管在赤道面彼此相搭，侧面结合，有的微管和两极均不接触。染色体牵丝是指一端由极部发出，另一端结合到动粒上的微管。区间牵丝是指在有丝分裂后期和末期连接已经分向两极的染色体或子核的微管。有丝分裂装置在维持染色体的平衡、运动、分配中起着重要的作用【,?,】。 真核生物细胞有丝分裂过程可以分成六个时期，分别为前期，早中期，中期，后期，末期，胞质分裂【,，,,。,(,(, 动物细胞有丝分裂的过程 前期(,,,,,,,,)?染色体复制完成后，每条染色体都由姐妹染色单体组成， , 刖吾在细胞核外，中心体己经复制完成，并开始向两极移动，有丝分裂纺锤体开始在两个中心粒之间组建(图,(,，,,,,,,, ,,,)。 早中期(,,,,,,,,,,,,)(核膜崩解，细胞进入早中期。此时细胞核周围的纺锤体侵入细胞的中心区。一部分纺锤体结合到动粒上，形成了染色体牵丝。早中期的特征是染色体剧烈的运动;个别染色体剧 烈的旋转，震荡，往返于两极之间;纺锤体微管试图“捕获??染色体，并将其排列在中期板上。最终，一侧纺锤体牵丝“捕获”住一条染色体的一侧动粒(,,,,,,;,,,,);接着另一侧的纺锤体牵丝也捕获了该染色体的另一侧动粒，这一过程是随机的。两侧相反方向的力量平衡，使染色体排列在中期的赤道板(,？,,,,,,,, ,,,,,)上。前中期在哺乳细胞中持续,,,,,分钟(图,(,，,,,,,,,, ,,,)。 中期(,,,,,,,,,):染色体排列在赤道板上，动粒微管与姐妹染色单体结合 (图,(,，,,,,,,,,, ,,,)。 后期(,,,,,,,,):姐妹染色单体同时分开形成两套子代染色体。两套姐妹染色单体开始缓慢的向两极移动，动粒微管变得越来越短，纺锤体的两极开始向两边移动，这两个过程都有利于子代染色体向两极移动(图,(,，, ,,,,,,,,,,,,)。 末期(,,,,,,,,,):两套子代染色体到达纺锤体的两极，并开始解凝集，新核膜开始组建。两个子代细胞核的形成标志着有丝分裂的结束。压缩环 (;,,,,,;,,,, ,,,,)的形成标志着胞质分裂的开始(图,(, ,，,,,,,,,, ,,,)。 胞质分裂(;,,,,,,,,,,):在胞质分裂过程中，由肌动蛋白和肌球蛋白组成的压缩环将细胞质平均分成两份，形成两个子代细胞(图,(,，,，,,,,,,,, ,,,)。 ,(,(,植物细胞有丝分裂的过程 前期(,,,,,,,,):核内染色体开始凝集(图,(, ,，,,,,,, ,,,)。 早中期(,,,,,,,,,,,,):核膜崩解，染色体与对应的两极发射出来的微管结合，植物细胞中没有中心粒，但是它的纺锤体两极的组建成份与动物细胞中组建中心粒的成份相似(图,(, , ,,,,,,,，,, ,,,)。 中期(,,,,,,,,,):染色体排列在赤道板上(图,(, , ,,,,,,, ,,,,)。 后期(,,,,,,,,):姐妹染色单体同时分开形成两套子代染色体并开始向两极移动(图,(, , ,,,,,,, ,,,)。 末期(,,,,,,,,,):两套子代染色体开始解凝集，新核膜开始组建(图,(, , , 前言,,,;,,,, ,,,,)。 胞质分裂(;,,,,,,,,,,):在胞质分裂过程【,,，新的细胞壁不始形成,图,,,,,,,,,，,,,,,,,)。 ,,， , ,,, ;,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,;,,,,,,;;(;,,,,,,, ,,,;,,,;,,, ,,,,,, ,,, ;,,, ,,,,,,,，,,,,,, ,,,,,,,, ;,,,, , ,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,, ;,,, ,:由,,,,,,,; ,,,;,,, ,,,,,,;;,,, , ,胞质分裂 前矗 住有丝分裂后期，,始厉，动物细胞构建了一个肌动蛋白收缩环(,;,,,,,,,,;,,,,,;,,,, ,,,)压缩细胞膜形成两个由细胞质桥(;,,,,,,,,,;,,,,,,)连接的予代细胞。这个细胞质桥办助胞质分裂顺利完成。目前有很多技术,?以用来牲定参与真核生物胞质分裂的蛋白质。有大约,,种保守的核心蛋白质参与绝大多数动物细胞的胞质分裂。这牡核心蛋白质存在压缩环上，昂后参与组建细胞质桥。还有其它硼:多蛋白质也参与胞质分裂，但是这些蛋白质在动物细胞中并不是保守的。 细胞增嫡包括细胞牛长和一系列有序发生的事件:基冈组的复制(染色体的分离和细胞分裂。虽然我们对于细胞生长、细胞周期调控、染色体复制与分离在分子水平上有一定程度的了解，但是我们对于细胞的胞质分裂 却了解的很少。动物细胞利用压缩环(;,,,,,;,,,,,,,,)使细胞膜收缩产牛分裂沟(;,,,,,,,,,,,,,)最终使细胞分裂成两个子代细胞(,,, , ,)。压缩环是山肌动蛋白和肌球蛋白微丝构成的网络，肌球蛋白的移动活性改变了肌动蛋白微教的位置从而促进了肌动蛋白收缩。压缩环的组建足受,,,,鸟嘿呤核苷二磷酸激酶 (,,,,,,)调控的，压缩环组建的位置是由细胞分裂后期纺锤体的位置决定的。垭缩目,和巾心纺锤体可能在空间上阻碍细胞膜的融合吲。 , 。,口,情？々,，,口, ,尸一,,二，;—, 旒 ,,(。?,, ,, ?一 ,喧恤,,,,, ,州，,口 ,————, ,,啦?,,,,;?,?蛾,,, ,,,”,,,,,?, 削,(,胞质分裂示意蚓。 ,,, , ,,,, ,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,, 前言 在不同的动物物种中(例如:脊椎动物、线虫和昆虫)对于胞质分裂起重要作用的核心蛋白质，了解比较清楚的胞质分裂调控机制被分成五类:(,)中心纺锤体的成分，(,,),,,,、它的调控因子和效应因子，(,,,)非肌肉的肌球蛋白，，，(,,)肌动蛋白和肌动蛋白组装成微丝的直接调控子，(,)运输和融合囊泡的必需因子。,(,(,(, 中心纺锤体的构建 后期的启动标志着胞质分裂的开始。蛋白水解破坏细胞周期蛋白使有丝分裂激酶失活，激活一些组建中心纺锤体的必需蛋白，在后期一系列反平行的微管成束的分布在分离的染色体中间，它们的作用是富集胞质分裂的关键因子。 ,,,,蛋白是中心纺锤体的一种成分，它是一种微管结合蛋白(,,,)并具有使微管结成束的活性。,,,,最早定位在中心纺锤体位置，在大多数动物细胞中,,,,的功能是协助中心纺锤体组建和胞质分裂的进行【,】。激酶,家族的成员,，,,，与,,,,相互作用，并将,,,,的定位限制在分裂后期纺锤体中心的狭窄区埘,,。在有丝分裂中期，,,,,的;,,,位点被磷酸化，这种磷酸化作用抑制,,,,与微管结合。,,,,,;,;,,, ,也可以通过中心纺锤体复合物抑制微管的成束。中心体纺锤体微丝的定位依靠另一个复合物…一浓缩在中心体纺锤体处的,,,,,, ,激酶复合物。,,,,,, ,执行功能需要，,,,,,，,,,,,,,,和不十分保守的亚基,,,(,相互作用〔,,。抑制,,,,,, ,活性导致胞质分裂失败，这与敲除,,,,,,的现象是一致的。也许,,,,,, ,的核心功能并不是定位中心纺锤体微丝。 在早后期激活中心纺锤体的构建意味着形成压缩环(;,,,,,;,,,, ,,,,)。例如在果蝇中，如果细胞缺乏中心纺锤体微丝的,,,,,亚基，那么细胞就不能形成压缩环【,】。这种表型可能反映中心纺锤体微丝的成份与调控,,,,活性的因子之间存在相互作用。,(,(,(, ,,,,途径 ,,,,途径是转向胞质分裂的关键步骤。在压缩环组建的过程中，,,,,,,,,,,复合物起了核心作用。与绝大多数,,,(相关的,,,,,,一样，,,,,受到促进核苷酸转换的因子〔鸟嘌呤核苷酸转换因子(,,,,)〕以及核苷酸水解因子 (,,,,)的调控。,,,,是对胞质分裂中,,,,途径起关键作用的因子。尽管在体外,,,,并不是,,,,途径的一种因子，但是敲除,,,,的效果与敲除,,,,的效果相同，都可以阻断卵裂沟的形成【,,。也许,,,,在中心纺锤体上的定位并不是活化,,,,所必需的条件，因为在敲除,,,,,的细胞中仍然可以检测到有活性的,,,,〔引。但是,,,,在中心纺锤体上的定位对于活化,,,,是有帮助的。,,,,是一种参与调控,,,,的蛋白质，因 为在胞质分裂的后期，这种蛋白质定位在中体上，在,,,,定位的地方必需要有非活化的,,,,来协助完成胞质分裂的最后步骤。,(,(,(, ,,,,,,:有丝分裂的发动机 ,,,,?,,,激活下游途径可以导致肌动蛋白(,;,,,)聚合和肌球蛋(,,,,,,)，，活化。非肌肉中的肌球蛋白，，是胞质分裂的核心机制的成份，因为卵裂沟的形成需要这种蛋白质的活性【,】。这种摩托蛋白由平行的重链二聚体构成，每种蛋白都具有一条基本的轻链和一条调控的轻链(,,,;)组成。这些蛋白质组装成肌动蛋白微丝驱动压缩环的紧缩。在动物细胞中，非肌肉的肌球蛋白，，受磷酸化的,,,;调控。磷酸化的,,,;可以将肌球蛋白，，从自抑制的状态释放出来，激活他们的肌动蛋白刺激的腺苷酸三磷酸化酶活性(,,,,,,)。,,,,可以通过几个途径来调控,,,;的磷酸化状态。,,,,激活,,,激酶(,,,,)，这种激酶可以负责磷酸化,,,;并调控细胞的有丝分裂【, ,?,,】。另外,,,,激酶还可以磷酸化肌球蛋白的磷酸化的靶位点(,,,,)，因此抑制肌球蛋白的磷酸化作用可以间接促进,,,; 的磷酸化作用。遗传学相互作用实验表明:虽然,,,;是,,,,的.