AFLP共显性标记的分离、应用与AFLP技术的改良

AFLP共显性标记的分离、应用与AFLP技术的改良 AFLP共显性标记的分离、应用与AFLP技 术的改良 第1卷第2期 2005年5月 南方水产 SouthChinaFisheriesScience Vo1.1,No.2 May,2005 ? 综述? AFLP共显性标记的分离,应用与AFLP技术的改良 王小玉,一,喻达辉,龚世园 (1.华中农业大学水产学院,湖北武汉430070;2.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300) 摘要:AFLP作为新一代的分子标记,其应用越来越广泛,技术也越来越成熟.文章综述了AFLP多态带转化为 SNPs,SSR等共显性标记的研究现状及AFLP改进技术的应用发展前景. 关键词:AFLP;共显性带;分离;改进技术 中图分类号:Q75文献码:A文章编号:1673—2227一(2005)02—0067—06 IsolationandusefulnessofcodominantmarkersfromAFLPs andmodificationsofAFLPtechnique WANGXiao.yu,YUDa—hui,GONGShi—yuan (1.FisheriesCollegeofHuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China; 2.SouthChinaSeaFisheriesInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou51 0300,China) Abstract:AmplifiedFragmentLengthPolymorphism(AFLP)isanewmolecularmarkertec hniqueonthebasisofPCR.AFLPsare widelyemployedinmanyfieldsandbecomemoreandmorepopular.YetAFLPsaredominant markersandhavenaturallimitations. HowtoconvertdominantAFLPmarkersintocodominantmarkersandthemodificationsofA FLPtechniquearethemainfocusofthisre— view.TheapplicationsoftheAFLP—derivedmarkersarereviewedaswel1. Keywords:AFLP;dominantmarker;codominantmarker;conversion 扩增片段长度多态(amplifiedJttlengthpolymor- phism,AFLP)分子标记技术,最早足Ili甜,Keygene公司 Zabeau等提出,并在近年来发展起来的极具生命力的分 子生物学技术.它有效的结合了限制性内切酶片段长度多 态性(RFLP)和随机扩增多态性(RAPD)的优点,克服 了RAPD的不稳定性和RFLP技术受探针来源限制的缺点, 且在缺乏研究对象的DNA序列信息的情况下,短时间内便 可获得大量的分子标记,重复性高.因此,为不同来源和 不同复杂程度基因组的分析提供了一个有力的工具.自从 Vos等第一次报道后,AFLP技术已广泛应用于遗传多样 性,性别鉴定,遗传图谱构建,基因定位E8等各 个领域. 然而,AFLP分子标记是显性标记,无法区分纯合体与 杂合体,具有一定的局限性.与一般基于PCR实验技术的 标记相比,AFLP标记技术要求熟练的实验技巧,价格也相 对较贵.因此,这种技术的使用仍受到一定的限制.近几 年来通过克隆和测序将AFLP显性标记转化为共显性标记 的研究或通过定量检测PCR产物而获得AFLP共显性信 息的相关研究已有不少报道.本文将对AFLP共显性标 记的分离转化及其应用前景和AFLP技术的改良作一简要 综述. 收稿日期:2005-04—12 资助项目:广东省自然科学基金(037148);番禺区科技项目(2004.Z-61—1) 作者简介:王小玉(1976一),女,硕士研究生,从事海洋生物遗传育种研究.E— mail:yuerxitan@163.eom 通讯作者:喻达辉,E—mail:yudh231@21cn.eom 南方水产第1卷 1AFLP标记技术的原理 AFLP标记技术的基本原理是利用PCR技术和凝胶电 泳技术对基因组DNA的双酶切片段进行选择性扩增,电泳 分离来检测扩增的DNA片段的长度多态性.一般用EcoRl 和MseI限制性内切酶将基因组DNA进行双酶切,然后将 酶切片段和接头(adapter)连接,连接产物作为预扩增反 应的模板,接头序列加1个选择性碱基作为预扩增引物进 行预扩增,其扩增产物作为模板,用含2-3个选择性碱基 的引物进行选择性扩增.扩增片段经过变性聚丙烯酰胺电 泳分离,银染或自显影检测,即可获得大量的DNA谱 带.对同一基因组DNA而言,引物的选择性碱基数目越 多,扩增出来的带就越少;反之,扩增出来的带就多. 2AFLP共显性标记的分离转化 2.1单核苷酸多态(singlenucleaotidepolymor— phism,SNP)标记的转化与分离 SNP是指基因组内特定核苷酸位置上存在的单个碱基 的突变所引起的DNA序列多态性.在基因组DNA中任何 碱基均有可能发生变异,非编码序列的变异较多.SNP大 多为转换(transition)突变,即由一种嘧啶或嘌呤碱基转 换为另一种嘧啶或嘌呤.SNP在大多数基因组中存在较高 的频率,人类基因组具有大量的SNP,平均每1.3kb就 有一个SNP存在.因此SNP具有很高的信息含量. 从AFLP标记中分离SNP的包括多态带选择和再 扩增,测序,对测序结果首先进行序列比对(alignment) 分析,然后进行BLAST同源分析,并用过滤软件去除重复 序列SINEs和VNTRs(小卫星和微卫星),初步筛选出可 能含有SNP的序列.再用肉眼逐条检查可能存在SNP的序 列电泳图谱(electropherogram),同一位点有重叠峰出现 (两个碱基在同一位置出现),表明来源于父母本的两条染 色体其中1条发生了单核苷酸突变,初步鉴定出SNPs.为 了进一步验证SNPs,可以通过克隆测序,如果发现造成重 叠峰的2个碱基在不同克隆中出现,表明确实为SNP;也 可利用初步鉴定出的含有SNPs的序列特异引物,对基 因组DNA进行PCR扩增,直接测序,如果在同一位点仍 为重叠峰,表明该位点确实为SNP….其流程图见图1. Nicod等?"利用上述方法从鳟鱼中分离SNPs,结果在 29条序列带中的1O条发现了24个候选SNPs,29条带共 11.11kb的DNA序列,平均463个碱基就有1个SNP.19 个候选SNPs以杂合形式在个体内检测到,剩下5个候选 SNPs是通过将同一种群不同个体问的带对比得到.通过克 隆方法鉴定出6个SNPs,用特异引物法鉴定出l2个SNPs. 表明AFLP指纹技术是分离SNPs快速,简便而又廉价的方 法.Brugmans等也建立了从AFLP多态片段(100,400 bp)分离SNP标记的方法. AFLP多态带 PCR再扩增【用原来AFLP多态带的引物】 ,l~blast等确定候选SNPs. 肉眼检测初步鉴定SNt's l 上隆,物基 多\/ 图1AFLP显性标记转化为SNP标记 Fig.1Conve~ingdominantAFLPmarkersintoSNP 2.2微卫星(simplesequencerepeats.SSR)标 记的转化分离 微卫星(simplesequencerepeats,SSR)是指以几个核 苷酸(2,6)为单位以首尾相连的方式重复出现多次而组 成的一段DNA序列,重复次数一般为1O,5O,在基因组中 含量丰富,是共显性标记.由于基本单元重复次数的不同, 而形成SSR座位的多态性.用AFLP标记技术分离微卫星, 主要是利用AFLP的扩增原理将可能含有微卫星的酶切片 段大量扩增,从而有利于利用磁珠进行富集,大大提高了 微卫星分离的效率.主要包括双酶切预扩增产物富集和 单酶切产物扩增富集14]2种方法.从磁珠上洗脱下来的 DNA用相应的AFLP引物和扩增条件扩增,再克隆测序, 从所得的序列中找出重复片段位于中间部分,长度适宜的 序列,设计引物进行扩增筛选验证(图2). 高国庆等?用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星 DNA标记,回收纯化14个片段,测序后发现都含简单重 复序列,其中5个是简并序列,其他9个特异序列中,7 个含有GA重复序列.在9对SSR引物中,Pm一15在44个 花生品种资源中测到4个等位位点.并比较了2种从AFLP 预扩增和选择性扩增片断中分离花生微卫星DNA的方 法?,说明从AFLP片断中分离出SSR标记的方法在研究 花生基因DNA多态性方面具有很大的应用潜力.Wong f畹 第2期王小玉等:AFLP共显性标记的分离,应用与AFLP技术的改良 等在对蜻蛉自然种群的AFLP带的特性分析时发现,大部分多态标记是共显性的, 其中部分标记包含微卫星序列. 微卫星位点 AFLP引物结合位点…一? ib?E===, 变性的AFLPDNA一 链亲和素包被的磁珠 一寡核苷酸探针 一/ \ -.—J?=,【】?==】 -- o ,, 附与探针杂tssR的片段 J l在磁场中沉淀磁珠洗涤除去无微卫星的片段 变性,洗脱SSR片段 J 田一含丰富微卫星I~DNA IPCR扩增(用AFLP相应的引物)克隆,测序 图2采用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星标记 Fig.2SchematicrepresentationofSSRisolationbymagneticbeadsfromAFLPfragments 2.3特异序列扩增(sequence-characterizedam- plifiedregion,SCAR)标记的转化与分离 SCAR标记是通过对序列未知的DNA标记进行测序, 设计特异引物转化为基于普通PCR实验技术的分子标记. 扩增产生的片段具有序列已知,遗传一致性(identityby decent)的特点.简单易用,结果稳定,重复性强,是一种 简单实用的标记.因此将AFLP标记转化为SCAR标记可以 扩大AFLP标记的用途.利用AFLP分离SCAR标记的方法 见图3. SCAR标记主要是围绕性状连锁的AFLP条带来分离筛 选的.xul1等成功地将与苹果抗真菌疤痕(Vf)基 因紧密连锁的AFLP标记转化成SCAR标记.先将与Vf紧 密连锁的AFLP标记从胶上回收,然后将其克隆到pBlue— script—KS质粒上,挑选出阳性克隆,用与原来AFLP标记相 同的引物再扩增,测序,设计SCAR标记的引物.用8个苹 果样品的预扩增产物作为模板DNA检测候选SCAR标记, 最后从15个AFLP标记中分离出11个SCAR标记. 2.4STS(sequence-taggedsite)标记的转化与分离 STS标记实质上与SCAR标记是一致的.也是将与目的 性状连锁的AFLP带进行测序,设计引物,将AFLP显性标 记转化成更简单,更可靠的基于PCR基础上的STS标记. Dussle等对与甘蔗病毒紧密连锁的抗性基因Scmv进行 了研究,将一显性AFLP标记(E35M62—1)转化成插入或 尉 挑选阳性克隆 再扩增 图3AFLP显性标记转化为SCAR标记 Fig.3ConvertingdominantAFLPmarketsintoSCAR 缺失标记,另一AFLP标记(E33M61—2)转化成CAPs (cleavedamplifiedpolymorphicsequence)标记,证实 E33M61—2在3号染色体上,E35M62—1在6号染色体上,与 原来的AFLP标记一样.Bradeen等曾用与Y2(控制胡萝1- o 70南方水产第1卷 素的富集)连锁的6个AFLP片段,通过f2图谱和集合分 离分析方法,发展了一个简单的,PCR基础上的共显性标 记的分离方法.先从AFLP片段中分离出与与Y2连锁的 标记用原引物再扩增,将产物纯化,克隆到质粒pGEM—T 中,转移到Zeta—Probe尼龙膜上Southern杂交,或从AFLP 片段序列中设计反向PCR引物,电泳检测其产物,再按上 面步骤杂交. 3AFLP共显性标记的应用 3.1种类鉴定 将AFLP标记转化为SNP标记后有助于解释个体的表 型差异,在系统进化和种群遗传学研究中具有很大的应 用潜力.而且,将AFLP标记转换为SNP后能详细描 叙等位基因的变化,有利于鉴定一些分类较模糊的种. Bensch等通过选取瑞典南北柳莺的两亚种(雄性)各15 只,用11对AFLP引物组合标记分析发现,在500个多态 AFLP标记中只有一个多态片段AFLPwwl显示明显的差异, 然后以这个片段为模板再扩增,测序,将其转换为一共显 性的SNP,从而对柳莺的两亚种进行了不同的分类j.Be— hura等对亚洲稻瘿蚊不同生物型(biotype)的AFLP分析 中,发现1个AFLP标记在生物型1,2,5有扩增带,而生 物型4则没有.通过测序将其转换为SCAR标记,通过 PCR扩增得到与AFLP同样的结果.生物型1,2,5对含有 Gm2抗性基因的稻无毒,而生物型4有毒.通过交配遗传 实验,进一步发现该SCAR标记与性别相连锁,结合RAPD 分离的SCAR标记通过套式PCR可将各个生物型分开". 3.2标记辅助选育 分子标记辅助选育(Molecularmarker—assistedselection, MAS)通过检测与目标基因紧密连锁的分子标记,对育种 材料从DNA水平上直接对基因型进行选择,可以大大提高 育种中选择的准确性和效率,从而达到遗传改良的目的. 它是现代分子生物学与传统遗传育种的结合.近几年来 AFLP标记已用于各个研究领域的遗传图谱构建,但却不能 提供高通量的基因型数据.SNP已用于候选基因鉴定和基 因型的高通量筛选,因此,从AFLP标记中分离出SNP会 提高AFLP标记的应用范围,适于标记辅助选育.已有 AFLP标记与RAPD转化成SCAR标记用于植物标记辅助选 育的报道[2.并且利用AFLP转化成SCAR标记将更有利 于分子标记在选育中的应用. 3.3基因定位克隆 Meksem等将经过AFLP分析的目的片段克隆转换,从 2个大豆品种的1O个AFLP标记中分离出6个长960bp的 STS(sequence.taggedsite)标记,这些STS标记包含8个插 入或缺失,2个微卫星,8个SNP,并与大豆的抗性基因有 关,1在连锁群G上,Rhg4在连锁群A上,克隆的 AFLP带用于PCR再扩增,作为探针筛选大豆的BAC文 库].这种方法为未知基因的定位克隆,提供了一种有效 的工具.xu等将分离出的与苹果抗真菌疤痕(0基因紧 密连锁的15个AFLP标记中的1】个成功转化成SCAR标 记,这些SCAR标记的精细作图显示其中7个SCAR标记位 于基因的右侧,3个SCAR标记位于其左侧,1个位于其 中.因此SCAR标记可以很快地定位苹果的BAC文库,最 终获得基因. 4AFLP改良技术的发展与分离共显性标记 的前景展望 AFLP技术作为新一代的分子标记技术,自从其诞生以 来,已有大量文章开始发表,但它与其它分子标记一样也 存在许多不足之处.近几年来,AFLP技术有了很大改善与 发展,如采用单酶切或三酶切等. 4.1单酶切AFLP技术 这种方法是在传统的AFLP技术基础上以改进.采用 一 种酶,一个接头,酶切连接反应在一个反应内进行,使 用琼脂糖凝胶电泳代替变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.这种单 酶切的方法能增加扩增带的特异性,减少弱带,每个引物 多态位点数多,所需时间短,实验过程较传统的AFLP技术 简单.可用于DNA指纹图谱构建.Suazo等用这种改进 的方法研究非洲蜜蜂与欧洲蜜蜂,优化PCR条件,带出现 的强度随DNA浓度增加,DNA浓度在2.0和2.5mM间时 结果具有重现性,引物浓度增加也会形成更多的带.对非 洲蜜蜂和欧洲蜜蜂的DNA样品采用3种引物进行AFLP分 析,结果所有引物都出现大量的多态带,而且每个样品都 有唯一的特异带,从而显示很大的遗传变异性.Rana— mukhaarachchi等用这种改进的AFLP技术与RAPD技术比 较研究植物的遗传特征,1O个RAPD引物共产生99条带, 其中49个是多态,筛选出的8对AFLP引物共产生95条 带,52条是多态,RAPD每个引物的平均带数为9.9, AFLP的平均带数为11.9,RAPD每个引物的平均多态带是 4.9,AFLP的平均多态带是6.6,说明改进的单酶切AFLP 技术的重复性,可靠性,应用性都大大加强,且能用于 病原菌的快速鉴定. 4.2SAMPL(selectiveamplificationofmicrosat- ellitepolymorphicloci)指纹技术 是在AFLP基础上发展起来的一种指纹技术.利用与 AFLP相同的模板并经过双酶切,对应接头连接和预扩增. 所用引物对中一个是AFLP选择性引物,一个是包含一段 复杂微卫星序列的SAMPL引物,由于微卫星座位是基因组 高变区,从而再对遗传变异低的样本进行分析时,SAMPL 分析就显得更加灵敏,高效,能有效的显示关系较近的基 因组高变异区微卫星位点的不同,评估种群内遗传变 异].Singh等对印度楝树采用EcoRI/MseI共1O对引物组 合进行AFLP分析,产生422个扩增片段,E—ACG×M—crITI' 这对引物扩增出54个片段,多态带占44%,但排除外来添 加种后只发现22%的多态片段,而(GA).TAT/M—CTA的 第2期王小玉等:AFLP共显性标记的分离,应用与AFLP技术的改良71 这对SAMPL引物组合共有61个扩增产物,89%的扩增片 段是多态,因此其检测出的多态百分数比AFLP技术的 高. 4.3TE.AFLP TE—AFLP(threeendonuclease—AFLP)即三内切酶扩增 的限制性长度多态性,是由荷兰科学家derWurff在AFLP 技术基础上发展起来的一种新的指纹技术.用两种低频 率切点内切酶(通常为6碱基位点识别酶)和1种高频率 切点内切酶(通常为4碱基位点识别酶)代替了AFLP技 术的双酶切,但仍用两个接头连接,产生的片段只与低频 率切点内切酶所切片段末端有共同粘性末端的2个人工接 头连接,选择性扩增的引物末端加上1,2个选择性核苷 酸,使既能与接头粘性末端配对又能与引物的选择性核苷 酸配对的限制性片段得到扩增.这种方法可以减少传统 AFLP技术中带的数量,提高复杂基因组的分辨能力.肖兴 国根据自己的理解和与发明人的个人通信讨论认为:TE— AFLP经济,快速和操作简单方便的特性将会比常规AFLP 的应用更广泛,更普及.Lindstedt等采用BsrGI和XbaI 两种罕见限制酶与HinP1I或MseI常见酶酶切,将XbaI— MseI和XbaI—HinP1I组合,BsrGI酶作为第二种罕见酶酶切, 当采用XbaI—MseI时,扩增片段数由14增加到20,增 加了AFLP标记的分辨能力. AFLP标记的多态是通过限制位点的选择性碱基数来检 测,对于大基因组物种而言,增加选择性碱基数可以减少 带的复杂程度,但是一些小基因组的物种若采用传统的 AFLP分析将限制大量数据的产生.James等利用选择性碱 基数减少到1或0的改进技术,对草莓黑斑病进行AFLP分 析,当EcoRI+1碱基与MseI+3碱基组合时可产生足够的 带,E+2与M—C组合产生带最多,在44和101之间. 这种方法为小基因组的物种研究拓开了一条新的道路.万 春玲等在上述单酶切技术的基础上对AFLP技术从限制性 内切酶水解,扩增条件,检测方法3方面又作了一些改进, 采用PstI单酶水解基因组DNA,高温退火经过一次PCR扩 增,扩增片段大多在100,2500bp问,小面积变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳即可获得丰富的多态性带,使得AFLP标记 更简单,经济,适于一般实验室研究. 4.4AFLP分离共显性标记的前景展望 AFLP分子标记技术已经在农业,林业,畜牧业,水产 等诸多领域广泛应用,从其显性带中分离出的共显性带具 有更加广泛的用途.尽管AFLP技术存在对模板质量要求 较高,谱带有可能发生错配和缺失,成本较高,实验操作 技术较复杂等缺点,但在这种技术基础上演变出的改进方 法已越来越多,使AFLP技术逐步完善,应用也更加灵活, 相关方面的研究文献呈现逐年上升趋势.AFLP技术的不断 改良和发展,将在遗传图谱的构建,重要经济性状的定位, 基因表达,微生物鉴定等方面有更广泛的用途. 参考文献: f1]ZebeauM,VosPSelectiverestrictionfragmentamplification:A generalmethodforDNAfingerpriting[P].EuropeanPatentAppli— cati0nNutuber:94202629.7(PublicationNo.0534858a1).Par— is:EuropeanPatentOffice,1993. [2]VosP,HogersR,BleekerM,eta1.AFLP:newtechniqueforDNA fingerpringting[J].NucleicAcidsRes,1995,23(21):4407_ 4414. 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