鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的表达及抗原性鉴定

鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的表达及抗原性鉴定 第 32 卷 第 7 期 中 国 预 防 兽 医 学 32,No.7 Vol. 报 Jul. 2010 2010 年 7 月 ChineseJ ournal of Preventive Veterinary Medicine 鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白 H 基因的表达及抗原性鉴定 11,211111*郭东春 ,孙,刘家森 ,姜 骞 ,司昌德 ,林 欢 ,曲连东 (1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 / 实验动物中心,黑龙江 哈尔滨 150001, 2. 黑龙江八一农垦大学 动物科技学院,黑龙江 大庆 163319) 摘 要 ,为了对多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H (Omp H)的免疫学活性进行鉴定 , 本研究根据已发表的 Pm 70 株序列 (AE004439)设 计了两对引物,用 PCR方法扩 增了鸭多杀性 巴 氏 杆 菌 C48-102株 的 Omp H,扩 增 片 段 为 1 180 bp (ORF 为 1 056 bp)。Omp H 与 GenBank中 登 录 的 C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroupD 的序列 比对结果表明, Omp H 在核苷酸 水平上同源性为 82.8 %:99.2 %,在 氨 基酸水平上同源性为 82.1 % : 99.1 % 。 扩 增 去 信 号 肽 的 Omp H 基因, 构建 了原核重组表达质粒 pHT-Omp H,转 化 BL21 并 诱 导 表 达 , SDS-PAGE结 果表明,表达蛋白约为 41 ku,与预期的分子量大小相符,ewstern blot 结果表明具有良好的免疫学 活性,这为以重组 Omp H 蛋白建立针对鸭 Pm的血清学检测方法 奠定了基础。 关键词 ,多杀性巴氏杆菌,OmpH ,原核表达 中图分类号 ,S852.61 文献标识码 ,A 文章编号 ,1008-0589(2010)07-0574 -03 Expre s s ion a nd a ntige nicity a na lya s is of the Om p H Ge ne of P a s te ure a m utocda llli 11,211111*GUO Dong-chun, SUN Yan, LIU Jia-sen, JIANG Qian, SI Chang-de, LIN Huan, QU Lian-dong (1. StateK ey Laboratoryof Veterinary Biotechnology, HarbinV eterinary Institute, Chinese Academyof Agricultural Sciences, Harbin 150001, China; 2. Colege of nima Scence and eternary Medicne, Heongang Bay grcultura Universty, Daqing 163319, hiCna) lAliViiiljiiAili Abs tra ct: To evaluate the immunologic competence of the recombinant Om p H protein of Pasteurella multocida (Pm) expressedin E. coli, the Omp H gene of C48-102s train was amplified by PCR uisng a setof primers basedon the sequencesof Pm70i n GenBank.The 1180 bp PCRf ragment contained an open readingfra gment of 1056 bp, which shared sequenceide ntities of 82.6 % -99.2 % at nucleotide level and 82.1% -99.1 % at amino acid level with C48-102, C44-1, P-1059, XP-5723,, PM-70 and serogroup D, respectively. The Omp H fragment with deleted signal peptide was c loned into the expression vector of pHT-Omp H and expressed in E.coli BL21. SDS-PAGE showedthat the expressed p rotein was about 41 ku and possessd ebiological activity of Omp H geneby westernb lot detection. Ke y words : Pasteurella multocida; Omp H gene; e xpression 多杀性巴氏杆 菌 (Pasteurella multocida,Pm)可 以 泛流行,在我国规模化养禽场中也时有发生。 引 起 猪 肺 疫 、牛 羊 出 败 、禽 霍 乱 等 疾 病 , 是 一 种 (Outer membranpero - 革兰阴性细菌的外 膜 蛋 白 重 要 的 致 病 菌 。鸭 Pm 是鸭霍乱的病原 , 为鸭养teins, OMPs) 在致病过程中起着重要 的 作 用 ,同 时 [1]殖业 中重要的细菌性传染病之一 。该 菌 在 世 界 各 作 为 细 胞膜中的一种重要成分具有良好的免疫原 国 广 Corresponding author* 收稿日期,2009-10-29 基金项目,黑龙江省科技攻关项目PC(09S02),兽医生物技术国家重点实验室项目(KNLVB-27) 作者简介,郭东春(1979-),男,河南南阳人,助理研究员,主要从事实验动物疾病的研. 究 * 通信作者,E-mail,qld@hvri.ac.cn 1 . 4 分 离 株 间 的 OMPs 具有共同抗原成分 , 可以产生 交 原核表达载体的 构 建 及 鉴 定 用 BamH ? 和 叉 保 护 作 用 。Omp H 是 Pm 的主要外膜蛋白 , 可以 Xho?酶切回收P HF2和 PHR2扩增的去信号 肽 OmpH , 同 时 用 BamH ? 和 Xho ? 酶 切 pPRO-EX-htb质 粒 。 诱导 产生高水平的保 护 性 抗 体 。 Chevalier 等 认 为 Omp H 位于菌体表面,是一种孔道形成蛋白 ,属于 将双酶切的载体与 Omp H 基 因 片 段 连 接 , 将 连 接 产 [2]非 特 异 性 细 菌 外 膜 脂 蛋 白 超 家 族 。 Luo 等 研 究 表 物转化大肠杆菌 DH5α,挑 取 转 化 子 提 取 质 粒 , 明纯化的天然 Omp H 诱导的保护率与全菌的保护率 用 BamH ? 和 Xho ?酶切鉴定正确的重组质粒 [3]相当,OmpH 和全菌都能诱导高水平的 ELISA 抗体。 pHT- Omp H 送上海 invitrogen 公司测序。 本研究设计两对引物扩增了鸭 Pm C48-102株 的 1 . 5 Omp H 基 因 在 BL221 中的诱导表达及 S DS - Omp H 基因, 同时 实现了去信号肽的 Omp H 基 因 P AGE 分 析 取 测 序 正 确 的 pHT-OmpH 转 化 在大肠杆菌中的表达。 BL21 ( DE3 ) 感受态细胞, 挑取单个菌落, 37 ? 振 荡 培 养 至 OD值 0 . 4 : 0 . 6 , 加 入 IPTG 至 终 浓 度 为 1 mmol/ L, 诱 导 表 达 5 h, 同 时 设 空 白 载 体 对 1 材料和方法 600nm 照 。 用 12 % SDS-PAGE进行电泳 检测。 1 . 6 We s te rn blot 分 析 按常规方法转膜 , 转移后 1 . 1 菌 株 和 质 粒 鸭 源 Pm 株 C48-102购 自 中 国 兽 的 NC 膜 在 5 % 脱 脂 乳 中 封 闭 过 夜 , 以 1 ?50 用 医 药 品 监 察 所 , 大 肠 杆 菌 DH5α、 BL21 (DE3)、 5 % 脱脂乳稀释的鸭抗 Pm 阳 性 血 清 为 一 抗 , 37 ?质 粒 pPRO-EX-htb由 本 实 验 室 保 存 , pMD18-T 购 孵 育 自 宝 生物工程(大连)有限公司。 1 h , 以 1?2 500 倍稀释的 HRP 标记 的 羊 抗 鸭 IgG 1 . 2 酶 及 主 要 试 剂 EX-Taq DNA 聚 合 酶 、 T4 为 二 抗 , 37 ?孵 育 1 h, 采用二氨基联苯氨为底物DNA 连接酶和限制性内切酶 购自宝生物工程 (大 连 ) 显 色,观察结果。 有 限 公 司 , DNA 凝 胶 回 收 试剂 盒 购自上海华舜公 司 , 鸭 抗 Pm 阳性血清由本实验 室 制 备 , HRP 标 记 2 结果与讨论 的羊抗鸭 IgG 购自 KPL 公司。 1 . 3 Omp H 基因的扩增和克隆2 . 1 Omp H 基因的扩增与克隆 利 用 PHF1 和 1.3.1 引物设计 参考已发表的 Pm 70 株的 Omp HPHR1 扩 增 鸭 Pm C48-102 株 Omp H 基 因 , 与 序 列 设 计 两 对 引 物 , PHF1, 5'-CAAGGTAGTGATA pMD18-T 载体连接,转化 DH5α 感受态细胞,阳 CTATG-3', PHR1, 5'-GCCAGTGTTTAACACTGGC 性重 组 质 粒 测 序 结 果 显 示 , Omp H 片 段 为 1 180 bp, -3', PHF2, 5'-GCGGGATCCGCAACAGTTTACAAT包 含 完 整 的 ORF (1 056 bp), 编 码 351 个 氨 基 酸 , CAAGAC-3' ( 下 划 线 为 BamH ? 位 点 ), PHR2, 5'-G 其 中 N' 端 20 位 氨 基 酸 为 信 号 肽 序 列 。同 时 , 利 用 GGCTCGAGTTAGAAGTGTACGCGTAAAC-3( '下 划 PHF2 和 PHR2 扩 增 去 掉 N' 端 20 位 氨 基 酸 信 号 肽 的 线 为 Xho ? 位 点 ) 引 物 由 上 海 invitrogen 公 司 合 成 , Omp H 基因。 PHF2 和 PHR2 用于扩增去信号 Omp H 基因片段。 2 . 2 Omp H 的 序 列 分 析 C48-102株 Omp H 基 因1.3.2 PCR扩 增 PCR为煮沸 菌 体 上 清 , PCR 与 GenBank中 登 录 的 C44-1、 P-1059、 P52、 X-73、 反应体系 (50 μL),反应条件 ,94 ? 4 min,然后进 PM-70、 serogroupD 序 列 比 对 结 果 表 明 , 在 核 苷 酸 入 32 个 循 环 , 94 ? 30 s, 52 ? 30 s, 72 ? 1 min 水平上同源性为 82.8 % :99.2 % , 在 氨 基 酸 水 平 上 30 s, 最 后 72 ? 延 伸 10 min。1 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 同 源 性 为 82.1 % :99.1 % 。 对 推 导 的 C48-102 株 检测 PCR产物 。 Omp H 蛋 白 的 分 析 , 发 现 在 220-238位 氨 基 酸 区 域 1.3.3 目 的 基 因 的 克 隆 与 鉴 定 PHF1 和 PHR1 的存 在 缺 失 。 对 Pm 48-102、 C44-1、 P-1059、 P52、 PCR扩 增 产 物 与 pMD18-T 连接 , 按常规方法转化 X-73、PM-70、serogroup D 的 OmpH 蛋白分 析 表 明, DH5α 感受态细胞,筛选阳性克隆由上海 invitrogen 不 同 分 离 株 在 80 位 :110 位 和 220 位 :238 位 氨 基 公 司 测 序 , 并 与 GenBank 中 登 的录 C44-1、P-1059、 酸存在部分缺失 ,这 与 报 道 的 Pm Omp H 基 因 和 编 [5-8]P52、 X-73、 PM-70 和 serogroupD Omp H 进 行 序 列 码 的 蛋 白长度不同相一致 , 这 也 可 能 导 致 不 同 576 中 国 预 防 兽 医 学 报 2010 年 Pm 分离菌株的 Omp H 同源性低。 本研究实现了鸭 Pm C48-102株 去 信 号 肽 的 2 . 3 Omp H 基 因 在原核系统中的表达, SDS-PAGE及 原核表达重组质粒的构建 利 用 pHF2 和 western-blot 表明,表达的 Omp H 蛋白大小与预期相 pHR2 扩 增 的 去 掉 N' 端 20 位氨基酸信号肽的 Omp 符, 并具有免疫学活性 , 为下一步研制检测鸭 Pm H 基 因 , 构 建 的 重 组 质 粒 pHT-OmpH , 用 BamH ? 血清学检测方法奠定了基础。 和 ho ? 双 酶 切 得 到 1 056 bp 目 的 条 带 ( 图 1 )。 对 X pHT-Omp进行 测序,与原测序结果一致。 参考文献, [1] B.W 卡尔尼克主编,高福,苏敬良主 译. 禽 病 学 [M]. 9 版 , 北京,中国农业大学出版社, 1999,172-194 . [2] Chevalier G, Duclohier H, Thomas D, et al. Purification and characterization of protein H, the major porin of Pasteurella mul- tocida [J]. J Bacteriol, 1993, 175: 266-276. [3] Luo Y, Glisson J R. Cloning and c haracterization of the major outer membrane protein gene ( ompH) of Pasteurella multocida X-73 [J]. J Bacteriol, 1997, 179: 7856- 7864. [4] Vasfi M M, Dubreuil J D, Mittal K R. The 32 kDa major outer membrane preotn of Pasteurea mutocda capsular serumtypeD illli [J]. Microbiology, 1996, 142: 199-206. [5] Vasfi M M, Mittal K R. Role of outer membrane preiotn H (ompH) and ompA specific monoclonal antibodies from hybrido- 2 . 4 Omp H 基因的原核表 达 及 we s te rn blot 检 测 ma tumors in protection of mice against Pasteurellla multocida 将 pHT-Omp H 转 化 BL21, 用 PTG 诱 导 后 进 行 IJ ]. nfect mmun ,1997, 65: 4502-4508. [II SDS-PAGE电 泳 , 在 约 41 ku 处有一条明显的 表 达 [6] Ali H A, SawadaT , Noda K. Protectivity of an immunoaffinity- 带,与预期的分子量大小相符 (图 2A)。Western blot purified 39 kDa capsular preotin of avian Pasteurella multocida in mice[J]. J Vet Med Sci, 2004; 66: 1603-1604. 结 果 表 明 , 表 达 的 蛋 白 具 有 免 疫 学 活 性 ( 图 [7] Robert L D, Roslyn M, Baillie S, et a l. Charaterization and 2B)。 comparson of Pasteurea mutocda strans assocated with illliiiLuo 等研究表明,纯化 的菌体 Omp H 诱 导 的 保 护 率 porcine pneumonia and atrophic rhinit is [J]. Medical Microbiol, 与全菌的保护率一致,同时 Omp H 和全菌均能诱导 2003, 52: 59-67 . 高 水 平 的 ELISA 抗 体, 但利用 重组表达的蛋白质 [8] Sthitmatee N , Numee S. rot Pection of chickens from fowl Omp H 所诱导的保护率较低,这 可能与重组表达的 choleraby vaccination with recombinanta dhesive protein of Pas- 蛋白是一种变性的蛋 白,其 高 级 结 构与天然蛋白不 teurella multocida [J]. Vaccine, 2008, (26): 2398- 2407. [3,8] 同有关。(本文编辑,陈立群 )