纳米文献综述

载金属离子氨基多糖纳米微粒的抗菌作用及其对大鼠免疫功能 的影响 摘要:抗生素在饲料添加剂中的长期广泛使用,导致了细菌产生耐药胜以及畜禽产品中的药物残留等问题,严重地威胁到人类的身体健康和畜牧业的可持续发展。因此,研制和开发安全无公害的新型抗生素替代品是当前面临的严峻挑战。 关键词:抗生素;耐药性;药物残留 自从1928年AlexanderFleming发现青霉素以来,人类已经开发并使用了数百种抗生素(Sarmah et al2006)。抗生素在临床上的推广和应用极大地降低了人类传染性疾病的发病率和死亡率,并对外科手术的成功实施产生了重大影响(Ammor etal.,2007)。抗生素在畜牧生产中的应用极为广泛,主要包括疾病治疗、预防用药和用作生长促进剂三个方面(Wegeneretal.,2003)。但是,抗生素在促进健康动物生长和提高饲料效率中的用量占其总产量的绝大部分(Levy,1992),例如,1997年丹麦共生产各种抗生素x5ooookg,但是其中超过100000kg被用作生长促进剂(Jensen,2001),在美国,过去四十年中用于促生长的抗生素的量增长了80倍(uSAToday,1998),2001年,抗生素总产量达到16200吨,其中的70%被用于畜牧生产(UnionofConeernedScientists,2001)。估计在过去的60中,己经有大约1百万到1千万吨的抗生素被生产、使用,最后释放到生物圈中(European Commission,2005)。本章对抗生素在畜牧生产中的应用、面临的挑战和抗生素替代品的研究进展做了综述。 1抗生素生长促进剂的历史 抗生素最初被用作人和动物细菌感染的治疗药物。但是,自从Moore etal.(1946)报道,在肉鸡饲料中添加链霉素可提高肉鸡的日增重,随后,JukeS etal.(1950)又报道了猪饲料中添加抗生素后可提高猪的生产效率,同年,美国食品与药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准抗生素用作饲料添加剂之后,世界各国均相继展开了抗生素用作饲料添加剂的相关研究,并在畜牧生产中迅速地得到推广应用。饲用抗生素在添加剂行业中一直占有较为重要的地位(Gromwell,1987),其使用历程大体可分为三个阶段:上个世纪50年代为开始阶段,这一时期,人与畜禽共用相同的抗生素,如青霉素、链霉素、四环素和杆菌肤锌等;上个世纪60年代后,随着研究的深入,发现细菌可通过质粒携带的抗性基因将耐药性进行水平和垂直传递,因此,提出饲用抗生素要与人用抗生素分开,以避免在引起人类疾病的细菌中产生对抗生素的耐药性;上个世纪80年代以来,开始研制筛选新的饲用抗生素,主要是与治疗用药分开,并且在肠道内不易吸收或根本不吸收的抗生素,以降低其在动物体内的残留,从而避免畜产品中残留的药物通过食物链对人类健康造成威胁(伶建明,1994)。 2抗生素在畜牧生产中的积极作用抗生素作为生长促进剂,在饲料添加剂中的使用,可有效的抑制或杀灭病原微生物,减少发病率。大量试验表明,抗生素可促进动物生长并改善饲料报酬,降低腹泻率,特别是幼龄动物(VandenBogaard,1996:Weldaon,1997;Kyriakis,1989:partanenetal.,2002)。Hays(1991)曾对大量试验数据进行了统计,结果显示抗生素对幼龄动物生长和饲料报酬的改善作用优于成年动物;对体增重的改善优于饲料效率;卫生状况差的养殖环境中使用抗生素对动物生长及饲料报酬的改善作用优于卫生状况好的养殖环境。 3抗生素生长促进剂引起的问题 3.1破坏肠道微生态平衡 动物消化道内存在着各种各样的微生物,正常状态下,这些微生物在种类和数量上处于平衡状态。当畜禽日粮中添加抗生素生长促进剂后,对它敏感的细菌减少甚至消失,消化道菌群之间相互制约的格局被打乱,菌群之间的生态平衡被破坏了。消化道内菌群平衡状态下固有的定植抵抗(ColonizationResistanee)能力消失,为耐一药菌趁虚而入提供了机会,从而造成外源性感染(Mamber et al,1985)。二重感染则是动物病发后的治疗过程中,由于使用大量抗生素杀灭某类细菌时,微生态平衡被破坏后,另外一种或多种内源或外源性病菌随即再次感染机体造成的(Jesus,19%)。另外,抗生素在杀灭或抑制病原微生物的同时,也杀灭和抑制了一些有益菌的生长与繁殖。而存在于胃肠道的有益微生物,能帮助动物分解一些自身不能消化的营养物质,从而帮助动物利用其自身不能利用的养分,同时,某些有益微生物还起着刺激动物免疫系统并提高动物的免疫功能、合成维生素等营养物质供动物利用等作用。大量使用抗生素后,导致动物消化道内的菌群失调,引起消化功能紊乱,诱发各种消化道疾病,如慢性肠炎等。 3.2抑制机体免疫功能 动物长时间使用抗生素后,可直接对动物机体产生毒副作用,使动物免疫机能下降,因而更容易遭受病原的侵袭而感染疾病。抗生素对免疫系统的作用主要表现为对吞噬细胞功能的抑制:一是抗生素直接影响吞噬细胞的功能;二是通过影响微生物而影响吞噬细胞对微生物识别、摄取和杀灭等功能;Rikersetal.(1980)研究了土霉素对鲤鱼免疫系统的影响,结果表明,无论是饲喂还是腹腔注射土霉素均可引起体液免疫抑制,血清中免疫球蛋白含量降低。由于滥用抗生素,机体免疫减弱,动物慢性病例的数量明显增多。特别是幼龄患病动物的复发率明显升高。此外,抗生素在免疫中的抑制作用还对疫苗的预防接种产生不良影响,这些不仅同抗菌作用有关,而且与导致的抗原量降低以及直接影响免疫成熟过程中的某些环节有关。 3.3药物残留 由于耐药菌株的产生,抗生素在饲料中的添加剂量日趋增加,抗生素被动物吸收到体内后,可在各个部分沉积,因而,抗生素在动物产品如肉、蛋、奶中的含量量不断升高,即药物残留。药物残留是指给动物用药物后,药物的原形及其代谢物不能被完全排出体外,而是在动物的细胞、组织或器官内的储存、蓄积。生产中所用的大多数饲用抗生素都会有残留,只是残留量大小不同而已。抗生素的代谢途径多种多样,但大多以肝脏代谢为主。此外,一些性质稳定的抗生素被排泄到环境中后,仍能稳定地存在一段时间,影响到环境中的生态平衡。1987年,美国加利福尼亚州查处了1166例药物残留超标事件。这些残留在动物体内的抗生素伴随着动物食品性最终进入人体。当消费者食用这些畜产品时,可吸收其内的药物残留,同时,残留药物在人体消化道内会进行新一轮的细菌耐药性选择,导致人类对许多细菌的耐药性增强。某些抗生素还具有致畸、致突变和致癌作用,主要通过肉、蛋、奶等动物性食品进入人体,若人经常摄入残留药物的食物,那么在超过一定时间之后,则可由于残留物在体内的逐渐蓄积而导致各种器官病变,甚至癌变(Siegeletal,1974;Sehwarzetal.,2001),如氯霉素弓I起人骨髓造血机能损伤;氨基糖普类抗生素食入过多时,会对第八对脑神经造成损害,并且对肾也有损伤,特别是对于小孩,过量时会引起耳聋;四环素类在牙齿中积累会使牙齿变黄。 3.4耐药性的产生 耐药性是病原微生物为了生存而适应环境的结果。早在1951,研究者就发现,在火鸡饲料中添加链霉素来促进生长时,细菌会产生耐药性(StarrandReynolds,1951),随后,其他类似的研究也发现了对四环素的耐药性(Barnes,1958;ElliottAnd Bames,1959)。1969年,英国Swarm委员会(SwannCommittee,1969)发表的调查中指出,抗生素在畜牧业中的广泛使用会导致细菌产生耐药性。研究发现,在抗生素发现之前,采集的菌种很少表现出对抗生素的耐药性(HughesandDatta,1983)。抗生素的大量使用,对抗药菌株产生施加了很强的筛选压力,并直接导致耐药性菌株的快速出现(Bronzwaer et al.,2002),即每当一种新抗生素应用后,针对它的耐药性菌也很快就出现了(Levy,1997)。动物病原菌产生的耐药性可通过质粒水平传递给引起人类疾病的致病菌,导致用药效果降低甚至无效,给人疾病的预防和治疗带来威胁。例如,青霉素在临床应用初期,对金黄色葡萄球菌杀菌率达90%以上,疗效显著,但目前杀菌率只有50%(Jaeobsetal.,1999);1972年,墨西哥有l万多人被抗氯霉素的伤寒杆菌感染,导致1400多人死亡。由于致病菌耐药性的不断增加,使抗生素的药效越来越低,使用标准的给药剂量已经不能起到防病治病的作用,必须不断加大剂量才可能有效,有时甚至完全无效。这使得抗菌药物的使用寿命也逐渐缩短,要求不断开发新的品种以克服细菌的耐药性。然而一种新药的研制并非易事,据估计,一种新抗生素从开始研制到临床应用需上亿美元的费用。对于致病性细菌的耐药性若不采取有效,在不久的将来,人和动物的细菌性疾病将面临无药可用的可怕局面,即后抗生素时代(PostAntibioticEra)。细菌耐药性的机制涉及较多方面,如对药物进行水解,酞化磷酸化及核普化,改变修饰药物的靶位,通过改变细胞膜的通透性或用/泵0把药物排到体外的方法来降低细胞体内的药物浓度等等。细菌对各内酞胺类抗生素的耐药性是通过合成p一内酞胺酶,在该酶作用下p一内酞胺发生开环而失效;耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药性机制主要涉及改变参与细菌细胞壁合成的蛋白酶的分子结构,从而大大降低该蛋白酶对抗生素的亲和性(Visse:。tal.,1995)。细菌对四环素类抗生素的耐药机制主要有两点(Roberts,1996):一是由转座子编码的排出泵系统,二是由质粒或转座子编码的核糖体保护因子的表达。已分离出由不同四环素耐药因子编码的一组分子量为42kD的细胞膜内蛋白,称为Tet泵蛋白。菌体表达Tet蛋白(A一E类存在于肠球菌中,K和L类存在于革兰氏阳性细菌中)后,可将药物排除细菌体外,从而获得耐药性。细菌不仅可通过自身基因突变产生耐药性,还可将带有抗药性基因的质粒(R-因子)通过细胞接触,进行水平传递(HorizontalTransmission),从而加快耐药性在不同菌种中的产生速度(Wangotal.,1999;Tenover,1996)。 4抗生素生长促进剂面临的挑战 随着人类社会的经济发展,物质生活水平不断提高,人类的健康和食品安全问题越来越受到重视,并己成为全世界共同关注的焦点问题。鉴于上述抗生素生长促进剂对人类的健康和生态环境带来的威胁,世界各国均已经开始采取措施限制甚至禁止抗生素生长促进剂的使用。瑞典从1986年1月1日开始,全面禁止在饲料中使用抗生素生长促进剂。欧盟于1976年开始禁止在饲料中使用四环素和青霉素,1997年开始,禁止使用螺旋霉素、维吉尼霉素、杆菌肚锌和泰乐菌素,并已>8浙江大学博士学位论文第一章饲用抗生素面临的挑战及替代品的研究进展于2006年1月前全部停止了饲用抗生素的使用。美国不允许使用阿维菌素和喳乙醇,但允许使用四环素和青霉素。我国农业部在1997年颁布的5允许作饲料药物添加剂兽药品种及使用规定6中,允许将巧种抗生素用作饲料添加剂,但是对 适用动物、最高用量及停药期等均作了严格的规定。由于饲用抗生素带来的威胁,它将不可避免退出养殖业,因此,开发安全无公害的饲用抗生素替代品是目前面临的严峻挑战。 5抗生素替代品的研究进展 5.1益生元(Probiotics) 益元素,又称益生菌、活菌制剂或微生态制剂,是指含有取代或平衡微生态菌群作用一种或多种活菌的制剂。益生元的概念是Parker最早提出的,指的是经过培养的、活的微生物,进入动物体内可改善消化道菌群的平衡,并对宿主产生有益作用的培养物(LillyandStillwell,1965;Radecki,1991)。一989年Fuller明确提出益生元是/一种活的微生物饲料添加剂,通过改善肠道内微生物的平衡而起作用0。现在的观念认为,益生元是进入动物消化道内并存活在那里,产生酶类,抑制有害菌的生长,以改善宿主的健康状况(salminen etal.,1999)。近年来,益生元在畜牧养殖中的研究与应用相继增多(Krausee et al.,1997;Jinet,al.,1998;Jin etal.,2000)。益生元的作用机理如下:有益微生物进入动物机体后,形成优势茵群,与有害菌争夺氧、附着位点和营养素等,从而竞争性地抑制有害菌的生长;代谢产生有机酸,降低肠道内pH值,杀灭不耐酸的有害菌;产生溶菌酶、过氧化氢等物质,杀灭潜在的病原菌;产生代谢物抑制肠内胺和氨的产生;产生各种消化酶,有利于养分分解;合成B族维生素、氨基酸、未知促生长因子等营养物质;直接刺激肠道免疫细胞,增加局部免疫抗体的形成,增强机体抗病力等。但是,益生元的开发和应用仍存在很多问题,如活菌制剂多为厌氧菌,生产和储运难度都很大以及产品质量标准不统一等问题,因而,其应用受到限制。此外,当前益生元的安全性也存在一定的争议。 5.2中草药饲料添加剂 中草药饲料添加剂,是我国特有的中医理论在动物生产实践中应用的结晶,它是一类兼有营养与药用双重作用,具备直接杀灭或抑制细菌、增强动物免疫能力、并能促进营养物质消化吸收的无残留无耐药性的天然药物,其有效成分主要是多糖、生物碱、蛋白质、氨基酸、油脂、蜡、树脂类、植物色素、矿物元素和维生素等生物活性物质。其中,生物碱能明显增强体液与细胞免疫功能,促进抗原抗体反应和淋巴细胞转化;挥发油类有增强机体免疫和巨噬能力的作用;有机酸、蹂质等也有促进机体免疫力的作用。而多糖不仅可被动物消化吸收利用,而且能提动物的高免疫功能。有机酸类则能增强吞噬细胞的特异吞噬功能,破坏癌细胞染色体,增强机体免疫功能。现代药理学分析表明,中草药添加剂具有调节机体免疫功能和非特异性抗菌的作用(牛廷献等,1998)。中草药作为佐剂、添加剂常用于猪病的防治中,主要用于防治仔猪黄白痢、腹泻等。对于仔猪,生产上常采用给母猪喂服中草药添加剂,使仔猪通过吸吮母乳而达到防病治病的功效(赵四喜,1994)。中草药作为添加剂开发尚处起步阶段,还存在诸多问题,比如,生产技术不完善,产品成分及其效果不稳定,成本较高等。 5.3寡聚糖 寡聚糖,又称低聚糖或寡糖,是指2一10个单糖通过糖营键连接形成的一类物质。目前研究较多的功能性低聚糖主要有大豆低聚糖、低聚果糖、半乳寡糖、果寡糖(F0S)、甘露寡糖(MOS)等。寡聚糖不能被畜禽自身吸收和利用,又不能被肠道大部分有害菌所利用,只能唯一被肠道有益菌选择利用并促使其增殖。因此,只要选择好特殊的短链带分支的糖类物质,就能基本做到肠道有益菌唯一选择吸收的目的,并通过这种唯一选择吸收来刺激肠道有益菌的增殖,形成最佳的微生 态区系,提高z)J物健康水平咬Bailey etal.,1992;xu etal.,2002)。Spenceretal.(1997)研究表明,早期断奶仔猪日粮中添加0.1%FOS时,生长性能无变化,但试验组的小肠绒毛比对照组长。研究发现,FOS能促进机体肠道内有益菌的增殖(Howard,1993),提高a)J物的抗病能力(Morgan,1992)。此外,寡聚糖还可以结合病原细胞的外源凝集素,避免病菌在肠道壁上附着,从而阻断了病菌附着一繁殖一致病的感染途径,并携带病原菌排出体外,起到/冲刷0肠道的作用(Baileyet al.,1991)。与益生素相比,寡聚糖更稳定,对制粒、膨化、氧化和储运等恶劣环境条件都具有很高的耐受性,能承受胃酸的破坏作用,克服了活菌制剂在肠道定植难的缺陷,但寡聚糖的生产难度大,生产效率低,成本高,限制了其生产中的推广应用。 5.4其它抗生素替代品 有机酸添加剂是指由一种或多种不同短链脂肪酸制成的添加剂。早在上个世纪60年代英国就将有机酸添加到仔猪饲料中,以减少有害菌和克服仔猪断奶期间的消化障碍,促进仔猪生长。有机酸能降低动物肠道内pH值,抑制病原菌的生长与繁殖,减少腹泻的发生,增进动物的健康(Roy。tal.,2002)。抗菌肤是一类具有抗菌活性的多肤。它与传统抗生素的杀菌机理不同,抗菌肤是通过插入细胞膜破坏细菌外膜,在其中形成微孔通道,使菌体内容物外流而导致细菌死亡的,所以,理论上细菌很难产生耐药性。此外,抗菌肤是动物自身基因编码的蛋白,对动物体细胞不具有损坏作用。纳米杀菌剂是近年来才出现的基于纳米技术的新型杀菌材料。纳米ZnO有极强的化学活性,能与多种有机物发生氧化反应(包括细菌内的有机物),从而把大部分细菌、病毒杀死。它的主要作用机理为:纳米ZnO在光照条件下会产生导带电子和价带空穴,后者是良好的氧化剂,具有很强的反应活性,可与表面吸附的HZO或OH一离子发生反应形成具有强氧化性的HZOZ一,从而杀死细胞。而且可穿透细胞膜,破坏膜结构,降解细菌产生的毒素。定量实验表明:在5分钟内纳米ZnO的浓度为1%时,金黄色葡萄球菌的杀菌率为98.86%,大肠杆菌的杀菌率为99.93%。浙江大学饲料研究所在纳米级杀菌剂的研制方面做了大量工作,己成功制备了一种新型的载铜纳米硅酸盐杀菌材料,在鸡、猪,甚至水产中都取得优异的应用效果(马玉龙,2004;郭彤,2004;胡彩虹,2005)。目前,国内纳米抗菌剂的研发还处在起步阶段,其应用也在不断探索,较之传统抗菌剂,纳米抗菌剂前景更广阔,有必要投入更多的力量研究。