CTLA4Ig基因对大鼠胰岛移植后排斥反应的治疗作用

CTLA4Ig基因对大鼠胰岛移植后排斥反应的治疗作用 C TL A4 Ig 基因对大鼠胰岛移植后排斥反应 的治疗作用 金世龙 顾红光 王亚旭 刘宝华 王代科 文亚渊 王仁云 王东 周月庆 刘萍 【摘要】 目的 研究 C TL A4 Ig 基因在糖尿病大鼠体内达及其产物对胰岛移植物存活的作用 。 方法 利用 Lipofectin 载 体 包 裹 C TL A4 Ig cDNA 质 粒 后 转 染 鼠 胰 岛 和 肌 肉 细 胞 , 检 测 移 植 后 C T2 () L A4 Ig 表达和 T 淋巴细胞转化率 。结果 胰岛移植术后 7 d T 淋巴细胞转化试验 ,实验组 A 组和对 () () ( ) 照组 B 组每分钟脉冲数 cp m分别为175 . 7 ?98 . 2 , 254 . 4 ?116 . 3 , 两组比较差异显著 P < 0 . 05。 A () 组胰岛移植第 7 d ,2 只大鼠血清 C TL A4 Ig 呈阳性 阳性率 20 %。A 、B 两组胰岛移植后血糖维持 正 ((( ) ) ) 常时间分别为 14 . 8 ?12 . 3d 和 3 . 6 ?5 . 1d ,两组比较差异显著 P < 0 . 05。A 、B 两组大鼠平均 ((( ) ) ) 存活时间分别为 24 . 0 ?10 . 8d 和 10 . 8 ?4 . 8d ,两组比较 ,差异有极显著性 P < 0 . 01。结论 脂 质体包裹的 C TL A4 Ig cDNA 转染肌细胞和胰岛细胞 ,可以在受体大鼠胰岛细胞或肌肉组织中表达 ,其表达产物可使胰岛移植物和受体鼠存活时间明显延长 , 抑制细胞免疫活性 ,发挥其治疗排斥反应 的作用 。 【关键词】 胰岛移植 ;基因治疗 ;糖尿病 Treatment of CTL A4 Ig gene f or the rejection of pancreatic islet allograf t in dia betic rats J I N S hilon g , GU Hon gg u an g , W A N G Y ax i u , et al . Depa rt men of Hepatobil i a ry S u rgery , D api ng Hos pi t al , T hi r d M il i t a ry M edical U ni verci t y , Chongqi ng , 400042 , Chi n a 【Abstract】 Objectives To st udy t he exp ressio n of C TL A4 Ig gene in diabetic rat and t he actio n ofC TL A4 Ig o n p rolo nging survival time of t he pancreatic islet . Methods The rat pancreatic islet cells and muscle cells were t ransfected wit h t he cDNA for C TL A4 Ig packaged wit h lipofectin vector . The exp ressio n ( ) levels of C TL A4 Ig gene and T lymp hocyte reactio n ML Rwere determined and t he actio n of C TL A4 Ig cDNA o n p rolo nging survival time of t he pancreatic islet allograf t in diabetic rat s observed. Results T lym2 p hocyte t ransforming test f ro m perip heral int ravenous blood at 7 t h day af ter pancreatic islet t ransplantatio n revealed t hat cp m in group A and group B were 175 . 7 ?98 . 2 , 254 . 4 ?116 . 3 , respectively , wit h t he dif2 ( ) ference bet ween t he t wo group s being significant P < 0 . 05. At 7t h day af ter pancreatic islet allograf t in group A , o nly 2 out of 10 recipient s were serum C TL A4 Ig positive wit h t heir co ncent ratio ns being 14 ng/ ml and 31 ng/ ml respectively. The average time of maintaining blood glucose normal levels in t he group A () ( ) af ter pancreatic islet allograf t , 14 . 8 ?12 . 3days , was significantly lo nger t han 3 . 6 ?5 . 1days of t he ( ) () ( group B P < 0 . 05. The average survival time in t he group A , 24 . 0 ?10 . 8days t he lo ngest time was ) () ( ) 45 days, was significantly lo nger t han 11 . 8 ?4 . 8days t he lo ngest time was 21 daysof t he group B ( ) P < 0 . 01. Conclusions The muscle cells and pancreatic islet s of t he recipient rat s were t ransfected wit h C TL A4 Ig cDNA packaged wit h lipofectin. C TL A4 Ig cDNA could be exp ressed in t he recipient tissues. The exp ressed p roduct could obviously p rolo ng t he survival time of t he pancreatic islet allograf t and t he re2 cipient rat s and partly inhibit t he cellular immunity to p revent rejectio n. 【 Key words】 Pancreatic islet allograf t ; Gene t herap y ; Diabetic mellit us 胰岛存活的作用 。 本实验用 Lipofectin 载体包裹 C TL A4 Ig cDNA 质粒后转染鼠胰岛和肌细胞 ,观察 C TL A4 Ig 基因在 材料与方法 受体组织表达 C TL A4 Ig 及其延长糖尿病大鼠移植 一 、实验动物和主要试剂 大白鼠体重 150,200 g ,雌雄不拘 ,本院实验动 基金项目 :全军 95 医药卫生科研基金资助项目 (962075) 作者单位 :400042 重庆 ,第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外 物中心 提 供 。细 胞 培 养 基 R PM I 1640 、DM EM 和 科 Lipofectin 载体为 Gibco 产品 , EL ISA 试剂盒为 An2 中华器官移植杂志 2000 年 7 月第 21 卷第 4 期 Chin J Organ Transplant , J uly 2000 , Vol . 21 , No . 4 ?205 ? ( ) 18 h 。取胰岛检测 : 1双硫腙 小牛血清继续培养 cell Co rpo ratio n 产品 。胶原酶 I 型 、链脲霉素为 Cig2 ( ) ma 产 品 。C TL A4 Ig cDNA 为 留 学 美 国 人 士 赠 送 , 染色法检测胰岛纯度 ; 2台盼蓝染色法检测胰岛 ( ) 活度 ; 3放射免疫法检测上清液 中 胰 岛 素 含 量 。 H3 TdR 为 上 海 原 子 能 研 究 所 产 品 , Ficoll 400 系 () 4培养法进行葡萄糖刺激胰岛素释放试验 。 ( ) Phar mco 公司产品 。肿瘤坏死因子 TN F和白细胞 ( ) 四 、胰岛移植和 EL ISA 检测血清 C TL A4 Ig介素22 IL22 药 盒 由 北 京 东 亚 免 疫 技 术 研 究 所 提 糖尿病大鼠麻醉后 ,左中腹切口 ,将胰岛细胞悬 供 。 液 1 ml 注入左肾包囊 。A 组给予胰岛 + C TL A4 Ig 二 、大鼠糖尿病模型制备和质粒肌肉注射 cDNA 移植 , B 组给予单纯胰岛移植 。移植后每隔() 大鼠 20 只称重 ,随机平均分为实验组 A 组和 3,5 d 取鼠尾血 检测血糖变化 ,血糖连续 2 次高于() 对照组 B 组。用 Lipofectin 载体将 C TL A4 Ig cD2 11 . 0 mmol/ L ,以第一时间为排斥开始 ,观察糖尿病 () μ() NA 包裹 超声法混匀,按 Lipofectin 200l与 C T2 鼠存活 时 间 。A 组 移 植 后 7 d 取 静 脉 血 离 心 后 , μ( ) L A4 Ig cDNA 200g的混匀液注入 A 组大鼠右侧 2 EL ISA 法检测血清 C TL A4 Ig 水平。 ( 大腿肌肉组织 。5 d 后再给 A 、B 两组大鼠肌注 左 五 、T 淋巴细胞转化试验 ) () 腿10 g/ L 链脲霉素 p H 4 . 2,4 . 5 ,75 mg/ kg,24 h 移植后第 7 d ,A 、B 组分别取0 . 1 ml 静脉血 ,作后大鼠血糖达到 20 mmol/ L , 5 d 测定血糖 1 次 ,维 T 淋巴细 胞 转 化 试 验 , 用 刀 豆 蛋 白 A 刺 激 剂 , H32持 10 d 为稳定的糖尿病鼠模型 。 3 TdR 掺入滤膜法,液体闪烁计数仪检测 T 淋巴细 三 、胰岛消化分离 、纯化和转染 () 胞转化后每分钟脉冲数 cp m。 ( ) 10 g/ L 戊巴比妥钠 30 mg/ kg腹腔内注射麻 六 、TN F 和 IL22 检测醉后 ,立即切开腹腔显露胰腺和胆总管 ,胆总管中段 两组移植后第 7 d ,取鼠静脉血离心后置 - 20 ? 1 4 针头 ,结扎十二指肠远近端形成闭向远侧插入 2 冰箱保存 , 用常规放射免疫法测定血清中 TN F 和 2 + 袢 。将 含 有 5 g/ L 胶 原 酶 和 7 . 5 mmol/ L Ca的4 IL22 浓度。 () Hanks 液 6 ml p H 7 . 8,自胆总管注入十二指肠袢 , 七 、统计学处理胰腺膨胀后 ,迅速摘取胰腺 ,置入 50 ml 三角烧瓶加 ( ) 实验数据用均数 ?差 x? ?s表示 ,所有数 据上述 Hanks 液 8 ml ,38 ?水浴轻轻摇动 8,12 min , 3 3 均用 t 检验方差 。 然后用眼科小剪刀将胰腺剪成0 . 5 mm,1 mm碎 块 ,再置 50 ml 三角烧瓶中 ,加上述 Hanks 液 6 ml , 结果 38 ?水浴振摇消化 5,8 min ,加入 4 ?的 Hanks 液 6 ml 终止消化 。静置 3 , 5 min ,待组织块沉淀后 ,吸 一 、移植后两组 T 淋巴细胞功能状态 取上清消化物经1 000 r/ min 离心 5 min ,弃上清液 , 胰岛移植术后 7 d ,A 组 10 只大鼠全部存活 ,B沉淀物用含 200 g/ L 小牛血清的 R PM I 1640 培养 组 8 只大鼠存活 ,其 cp m 均值 A 、B 组分别为175 . 7液保存 。沉淀物重复上述消化过程 4,5 次 ,直到胰 1 腺组织碎块全部消化。 ( ?98 . 2和254 . 4 ?116 . 3 , 两组比较 ,差异显著 P < ) 0 . 05,A 组 T 淋巴细胞功能状态不如 B 组活跃 。 消化后的胰岛用含 200 g/ L 小牛血清的 R PM I () 1640 培养液 10 ml p H 7 . 2,置细胞培养箱 ,在体积 二 、移植后血清 TN F 和 IL22 浓度 胰岛移植术浓度为 95 %空气 、5 % CO,37 ?恒温培养 48 h 。吸 2 后第 7 d ,A 、B 两组血清 TN F 浓度 出悬浮细胞团用 Hanks 液清洗后 ,加入密度梯度为 (μ( μ)) 分别为 1 . 087 ?0 . 765g/ L 和 1 . 132 ?0 . 429g/25 % 、20 % 、15 % 和 10 % 的 Ficoll 液 经 4 ? 3 000 ( ) L , 两组差异不显著 P > 0 . 05。A 、B 两 组血清( r/ min 离 心 15 min , 胰 岛 细 胞 在 第 2 层 20 % , ( ( μ) IL22 浓 度 分 别 为 1 . 43 ?0 . 43 g/ L 和 0 . 97 ?(() ) ) 25 %、第 3 层 15 %,20 %及第四层 10 %,15 %μ( )) 0 . 51g/ L , 两组比较 ,差异不显著 P > 0 . 05。 收集 ,用 Hanks 液清洗 2 次待用 。将 C TL A4 Ig cD2() 三 、糖尿病大鼠胰岛移植后血糖变化 表 1糖尿μμNA 50g 和 Lipofectin 100l 经超声混悬液与纯化 病大鼠进食减少 ,尿量增多 ,体重减轻 ,胰岛 胰岛混匀后 ,加 DM EM 培养液 4 ml ,在体积浓度为 移植血糖正常后尿量开始减少 ,体重恢复到用药前水 95 %空气 、5 % CO,37 ? 培养 6 h ,再加入 100 g/ L 2 平则需要 10,20 d 。对照组维持血糖正常时间平均 () 为 3. 6 ?5. 1d ,实验组维持血糖正常时间平均为 (( ) ) 14. 8 ?12. 3d ,两组比较 ,差异显著 P < 0. 05。 血糖维持正常的时间 好效果 。我们利用脂质体包裹 C TL A4 Ig cDNA 后 ( )组别 例数 各只大鼠血糖维持正常时间 d 直接肌肉注射转染肌细胞和 DM EM 液培养转染胰 A 组 10 34 , 29 , 26 , 19 , 17 , 13 , 7 , 3 , 0 , 0 岛细胞 , 提高 C TL A4 Ig 基因表达 。A 组 T 淋巴细 10 16 , 10 , 4 , 3 , 3 , 0 , 0 , 0 , 0 , 0 B 组 胞转化率低 、功能状态不如 B 组活跃 , 胰岛移植后 第 7 d , A 、B 两组血清 TN F 和 IL22 浓度差异不显 著 。A 组大鼠移植后维持正常血糖的时间较 B 组明 四 、移植后两组大鼠生存时间与 C TL A4 Ig 表达 显延长 ,可能与 C TL A4 Ig cDNA 转染受体鼠后 C T2 ()表 2 L A4 Ig 基因不同程度表达 ,受体细胞免疫受到不同 表 2 A 、B 两组糖尿病大鼠胰岛移植后存活时间 程度抑制有关 。A 组移植后第 7 d 仅 2 只大鼠血清 ( )分组 例数 胰岛移植后各大鼠存活时间 d 检测 C TL A4 Ig 阳性 , 提示 C TL A4 Ig cDNA 可以在 A 组 10 45 , 36 , 31 , 29 , 25 , 19 , 17 , 15 , 12 , 9 糖尿病大鼠肌细胞或供体胰岛细胞内低水平表达 , B 组10 21 , 17 , 12 , 12 , 11 , 9 , 8 , 8 , 6 , 4 这可能与脂质体载体选择 、基因转染方法 、抽血检测 C TL A4 Ig 次数和实验技巧有 关 。结 果 提 示 , 脂 质 ( 体包裹 C TL A4 Ig cDNA 转染肌细胞和胰岛细胞 ,可 ) A 组大鼠平均存活 24 . 0 ?10 . 8 d , B 组大鼠 (以在受体鼠组织细胞中低水平表达 ,其表达产物可 ) 平均存活 10 . 8 ?4 . 8d ,两组比较 ,差异有极显著性 使胰岛移植物和受体鼠存活时间延长 , 抑制细胞免 ( ) P < 0 . 01。A 组胰岛移植第 7 d , 2 只 大 鼠 血 清 疫活性 ,发挥其治疗排斥反应的作用 。 μμC TL A4 Ig 呈阳性 ,分别为 14g/ L 和 31g/ L 。 参 考 文 献 讨论 1 沈守祥 ,董见虎 ,毕艳军 ,等. SD 大鼠胰岛细胞培养技术的研究. 随着遗传工程和基因治疗技术的发展 ,用基因 中华器官移植杂志 ,1995 ,16 :1582160 .修饰移植物 ,使移植局部释放免疫抑制剂分子 ,因此 2 Mat teo G , L evist ti , Philip A , et al . Immuno supp ressive effect s of 4 移植物不 被 排 斥 在 理 论 上 是 可 行 的。C TL A4 Ig human C TAL 4 Ig in a no n2human p rimate mo del of allogeneic pan2 creatic islet t ransplantatio n . J Immunol , 1997 ,159 :518725191 . 是一种融合蛋白 ,分子量小 , 可以扩散 , 与 CD28 配3 杨廷彬 , 尹 学 念 主 编. 实 用 免 疫 学. 长 春 : 长 春 出 版 社 , 1994 . 体 B7 有高度亲和力 ,可阻断 CD28 和 C TL A4 与其 5722594 . 配体 B7 结合 ,从而阻断 CD28 共刺激信号传递 ,使 Alf red A , Chahine , Ming YU , et al . Immuno mo dulatio n of pancre2 4 atic islet allograf t s in mice wit h C TL A4 Ig secreting muscle cells. T 细胞增殖和分化成细胞毒 T 细胞淋巴因子的作 Transplantatio n ,1995 ,59 :131321318 . 用受抑制 ,诱导对特异抗原无反应状态 ,在体内体外 5 Tho mas A , J udge , Aimin Tang , et al . The in vivo mechanism of 均有免疫抑制作用 ,不需要免疫抑制剂就可以延长 actio n of C TL A4 Ig. J Immunol . , 1996 ,156 :229422299 . 5 ( )收稿日期 :1999207228 移植物存活时间。C TL A4 Ig 是阻断 B72CD28 共 刺激信号传导最有效的制剂 ,是免疫学和移植学研 消息?? 1999 年度全国肾移植的统计 1999 年 度 全 国 已 登 记 的 108 个 单 附属长征医院 、第一军医大学附属南方 总医院 、上海市第一人民医院 、广东省东 位共实行 肾 移 植 4 265 例 次 , 年 度 移 植 医院 、浙江大学医学院附属第一医院 、同 莞市太平人民医院 、西安医科大学附属 数超过 100 例次的单位有 : 首都医科大 济医科大学器官移植研究所 、解放军总 第一医院 、第三军医大学附属大坪医院 、 学附属北京红十字朝阳医院 、首都医科 医院 、中山医科大学附属第一医院 、第一 第三军医大学附属新桥医院 。 大学附属北京友谊医院 、第二军医大学 军医大学附属珠江医院 、南京军区南京 中华医学会器官移植学 分会器官移植登记处