血小板保存

血小板保存 血小板保存 2011年10月06日 血小板是血液重要的组成成分，参与机体凝血过程，发挥正常的止血功能，防止损伤后血液丢失,因此血小板输注在临床血液输注中也占有很大比例。血小板采集主要有2种方法:从全血中分离制备血小板，机器采集献血者血小板(机采血小板)。2006年8月，卫生部出台《关于限期停止有偿机采血小板的通知》，要求各地献血办不得下达指令性无偿捐献机采血小板的指标，或以发放补贴为由变相有偿机采血小板;为补充无偿机采血小板的不足，各采供血机构要充分利用已经采集的“无偿献血”血液资源，开展手工分离制备血小板工作。目前，手工分离制备血小板的方法有富含血小板血浆法(PRP法)和去白膜法(BC法)2种。由于PRP法分离制备浓缩血小板时，移走富含血小板血浆后的红细胞悬液层含有大量白细胞，这些白细胞会引起诸如发热、过敏等非溶血性输血反应，此外，红细胞悬液层中由血小板和白细胞形成的微聚物也会进一步对受血者造成危害;因此BC法分离血小板的使用越来越广泛。BC法的原理是:全血首先经重离心后分离白膜层，再将白膜层经轻离心后移走红细胞和白细胞，即得到浓缩血小板。与PRP法制备的血小板相比，BP法制备的血小板具有白细胞残留量较低、血小板膜面CD62p的表达率显著降低，以及提高ATP水平和低渗性休克反应能力等优点。对血小板功能来说，BP法制备的血小板糖分解率可降低一半，提高氧代谢率，维持二氧化碳水平，使pH保持恒定，尤其适合长期储运。这可能是由于血小板离心时是隔着红细胞和白细胞的“生理垫”，这样的分离制备过程对血小板的损伤较低，表现为反映血小板激活指标——血小板膜表面糖蛋白分子CD62p的表达率降低。因此，手工分离血小板，尤其是BC法制备的血小板首先可以使手工采集全血中的血小板得到充分利用，避免资源的浪费;其次，价格低廉，患者容易接受;第三，从全血中分离白膜再获得血小板，可以降低全血保存后微聚物的形成，降低受血者发生肺部、脑部栓塞的危险性，减少非溶血性输血反应的发生。 血小板采集后，如果不能较快用于临床，必须保存起来。血小板在新鲜血中，特别是在4?储存时，活性很快下降，6h后还有约40%的活性，12h后活性仅剩20%;<20?时，血小板会发生显著的改变,包括从静止盘形到多伪足球形的改变,丝状肌动蛋白的增加、血小板微管螺管的解聚，细胞内Ca2+的剧增、溶酶体和α颗粒的分泌和融合等，这些改变模拟生理学活性并导致血小板治疗无效。所以血小板必须有适宜的保存技术，才能既节约血液资源，又可储存血液。血小板保存技术主要有: 1 22?室温保存 由于血小板寿命短，结构和功能易受多种因素的影响，体外保存时条件要求较严格。近年来，国内外广泛开展了血小板室温保存的研究，充分肯定了22?持续振荡保存对血小板活力维持的可靠性和稳定性;已有许多国家将22?作为血小板保存的常规温度，认为保存24h的血小板具有与新鲜血小板相同的效果，血小板保存120h仍具有止血效果，而在保存过程中采用持续振荡可促进气体在血小板中的交换，防止血小板聚积，避免血小板代谢产物形成高浓度，以及利于血小板从外界环境获取营养。美国食品与药品监督管理局(FDA)规定，血小板的储存时间为3—5d，过期将予以废弃。由于室温保存血小板时间短， 长期以来，人们一直致力于血小板低温保存技术的研究，并取得较大成功。 2血小板的深低温冰冻保存 2.1 血小板深低温冰冻保存保护剂 在深低温条件下，血小板胞膜内外的水都处于固态，细胞生命代谢基本停止，血小板及凝血因子等功能活性物质可长期保存而不会衰退或功能耗竭，但血小板低温保存需要经历降复温过程中的损害而存活下来，因此在降复温过程需要添加冰冻保护剂。目前，血小板深低温冰冻保护剂主要使用75,或100% DMSO溶液，添加DMSO时血小板体积先缩小再恢复至等渗的体积，在此过程中血小板体积不会发生膨胀，其缩小的最低限度也只能达到64,，所以75,DMSO溶液快速添加或缓慢加入100% DMSO溶液，不会导致血小板超过安全体积范围;此外，DMSO分子量小，可透过细胞膜,可增加血液粘滞性、降低被冻细胞的变相点和延缓冷冻过程,减少冷冻过程中的蛋白质变性、延缓冰晶形成对细胞膜的损伤及减轻细胞脱水皱缩。DMSO不仅对血小板保存效果好，而且低浓度的DMSO对人体没有副作用且制作方便，输 注时不用洗涤;同时，DMSO还有具有一定的抑菌和抗血小板凝集作用，可明显防止微循环堵塞。在血小板冰冻过程中，当细胞内外产生瞬间压力差时，DMSO的分子运动可以迅速消除细胞内外的渗透压差和冰晶形成，避免细胞膜在冰冻 过程中的损伤，从而达到低温保存的目的。 2.2 血小板深低温冰冻保存技术 将制备好的FPRP或机采血小板(血小板质量和同液体血小板)，置于无菌清净台内，把预先消毒的75%或100% DMSO溶液缓慢添加到FPRP或单采血小板内，边添加边轻轻振摇，添加速度为1ml/min，DMSO终浓度为5%;把制作好的血小板用金属盒包装后放入,80?冰箱，水平摆在金属架上或梯式金属架上，冰冻血小板盒之间保持3—5cm距离，在1—2h完成冰冻降温过程，其保存有效期为1年;如需继续储存可置于液氮或,150?以下，保存3年。在保存期间低温冰箱断电不超过1h，并尽量减少打开冰箱门的次数，可延长深低温保存血小板的保存期。使用前从冰箱中取出，直接置于37?循环式水浴箱内完全融化，融化完毕后室温可放置4h， 采用普通输血器以患者可耐受的速度尽快输注。 2.3 深低温冰冻血小板功能检测 新鲜血小板降温实际过程中胞内冰晶形成温度为,15—,40?，也是血小板冷冻保存降温的关键温度段。血小板低 )无显著变化;分离的血小板平均体积 (MPV)明显温保存后，血小板计数(Plt 小于捐血者静脉血和ACD全血内的血小板，低温保存后血小板体积明显变大，但血小板体积变大控制在安全范围内，避免血小板体积膨胀，可维持血小板功能活性，提高回收率。血浆pH在整个制备和保存过程中没有明显变化，血浆内乳酸脱氢酶(LDH)在血小板低温保存后出现明显升高。在整个制备过程中，新鲜血小板的CD62p阳性率较低，,80?降温/复温保存后CD62p阳性率升高幅度较大;制备过程中血小板膜表面GP?b/?a的激活体未见明显增加;而在低温保存后，血小板膜表面CD42a(一种重要的促凝血活性分子)数量明显升高，并超过静脉血内血小板膜表面CD42a数量，提示血小板在低温保存后其促凝血活性明显提高。低温保存后血小板诱导的血浆凝固所需要的时间缩短约50,，说明低温保存后，血小板促凝血活性明显提高，优于新鲜血小板。经检测，,80?降温/复温保存后血小板计数回收率,95,。深低温保存的血小板复温后，其胞内增加了5,的DMSO，故胞内渗透压稍高于等渗溶液。采用生理盐溶液直接洗涤血小板，不但会造成血小板体积膨胀，还清除了血小板中所有的凝血因 子，势必降低血小板制品的止血效能。临床输注前避免洗涤可减少血小板的损害和丢失，保留全部的凝血因子，提高止凝血效果。 2.4 深低温冰冻保存血小板的临床应用效果 深低温保存血小板输注疗效与新鲜血小板基本相同。除了含有即刻止血功能增强的血小板外，深低温保存血小板制品内还有效保存了等体积血浆的全部凝血因子，融化后直接输注到受者外周循环血液中，可同时给患者提供血小板和全部凝血因子，特别适合战、创伤出血患者的输血救治，降低死亡率和致残率，同时可大幅度降低战时和紧急情况时血液的总需求量，将战时和紧急情况时输血救治提高到一个崭新的水平。临床基层应用结果显示:没有发生严重的输血反应，其安全性高，止血疗效显著。 3血小板的冰冻干燥保存 3.1 血小板冰冻干燥保存保护剂 目前，血小板冰冻干燥保存保护剂主 。负载海要是海藻糖，海藻糖在37?可以快速地被血小板吸收，负载效率>50%藻糖的血小板冻干后保存了血小板的完整性,同时，通过蒸汽后的血小板再水化存活率达到85%;再水化冻干血小板对凝血酶(1U/ml)、胶原蛋白(2μg/ml)、ADP(20μmol)和瑞斯托菌素(1.6mg/ml)的反应与新鲜血小板(对照组)几乎完全相同。通过傅立叶变换红外光谱学分析表明，这种再水化冻干血小板的膜以及膜蛋白成分与新鲜血小板极其相似。海藻糖能与血小板形成氢键，代替空间结构所必需的水分子,即生物体内的蛋白质、核酸、糖类、脂质类及其它生物大分子周围均包着一层水膜，这层水膜是维持生物大分子的结构、功能必不可少的物质基础，当干燥、冷冻等条件下失去水膜时，海藻糖分子能在失水部位与血小板以氢键连接，形成一层保护膜以代替失去的结构水膜，而不至于使血小板丧失活性;另外，干燥时海藻糖紧密地包住相邻近的血小板，形成一种糖玻璃体，使其扩散系数很低，分子运动和分子变性非常微弱，从而能够使血小板维持一定的空间结构。 3.2 血小板冷冻干燥保存技术 1) 37?条件下，负载冻干保护液4h，冻干保护液中，血小板20%—50%、海藻糖0.5%—2%、白蛋白0.5%—2%，干燥体积厚度,1cm、最佳,0.5cm。2)冷冻:?自由降温至,15?;?由,15?降至,40?，降温速度(,1—,5)?/min(最佳,1?/min);?,60?以下维 持1h以上。3) 干燥:?一级干燥，,35?，10—100mT;?二级干燥，18?，10—100mT;?一级干燥和二级干燥之间采用快速直接升温，避免梯度升温。4) 真空干燥完毕后，充入保护气氮后封装保存，需要时复水后使用。 3.3 冰冻干燥保存血小板功能检测 使用CD62p、PAC-1、GP?b、GP?b /?a等指标均可作为冻干血小板功能检测的指标。应用流式细胞仪检测加入可逆性激活抑制剂后血小板的功能，结果显示:血小板负载海藻糖4h后CD62p表达率高于负载前，加入可逆性激活抑制剂后，其表达率显著下降，与负载前比较，没有显著性差别;而PAC-1的表达率在血小板负载海藻糖前后、添加和未添加可逆性激活抑制剂的条件下，均未发生显著性改变。因而CD62p被认为是反映血小板激活后期1个最为灵敏的指标，而PAC-1(活化的GP?b /?a复合物)是反映血小板激活早期的1个灵敏度较低的指标。冻干血小板可以准确的粘附在剥脱的内皮下组织上，而与完整的血管壁不发生粘附，即使经过固定和脱水处理后，血小板表面的GP?b还是完整的，并在粘附过程中承担着控制因子的作用;且冻干血小板中的GP?b依然保持着粘附控制的作用。在GP?b /?a的表达上，通过单克隆抗体和流式细胞术分析，再水化冻干血小板中很少(<5%)表现出GP?b /?a阴性，但是阳性细胞荧光密度的峰值比固定新鲜血小板低，仅是后者的42%。 3.4 冰冻干燥保存血小板的临床应用与新鲜血小板和低温冰冻血小板相比，冻干血小板最大的优势在于由液态变为了固态粉剂，延长了血小板的储存时间，克服了传统的室温保存血小板和深低温保存血小板的缺点，便于长期保存，方便运输，不受气温影响，在运输及储存过程中可节省空间、节约资源，但目前冻干血小板的研究还处于动物实验阶段，临床应用还有待进一步研究。 作者:刘景汉 车辑 (解放军总医院输血科全军临床输血中心，北京100853) 摘自《中国输血杂志》网站