19 生物化学实验--乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量

19 生物化学实验--乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量 乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量 【目的】 1 (掌握乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量的实验方法。 2 (熟悉乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量的实验原理。 【原理】 血清中的甘油三酯，经正庚烷 - 异丙醇混合剂抽提后，用氢氧化钾溶液皂化水解生成甘油和脂肪酸钾。甘油被过碘酸钠试剂氧化生成甲醛。甲醛与乙酰丙酮在氨离子存在下，加热生成黄色的 3.5 一二乙酰 —1.4 一二氢二甲基吡啶衍生物。与同样处理过的三油酰甘油酯液进行比色后，求得血清中甘油三酯的含量。此法称为乙酰丙酮显色法又称为 Hantzsch 化学法，是最经典可靠的测定血清甘油三酯含量的实验方法，也是国内各实验室最多采用的方法。 其反应过程如下: 1 (皂化反应 甘油三酯 + 3KOH ? 甘油 + 3RCOOK 2 (甘油氧化反应 甘油 + HIO 4 ? HCHO + HCOOH + HIO 3 + H 2 O 过碘酸 甲醛 甲酸 碘酸 3 (显色反应 【器材】 1 (分光光度计 2 (恒温水浴 3 (微量移液器 4 (混匀器 5 (中号试管 【试剂】 1 (抽提剂 正庚烷 / 异丙醇以 2/3.5(V/V) 比例混合，即正庚烷 200ml 与异丙醇 350ml 混匀，置棕色瓶中保存。该试剂在室温下可保存两个月。 2 ( 0.04mol/L 硫酸溶液 取浓硫酸 ( 比重 1.84 ， 95%)2.24ml ，缓慢加入约 100ml 蒸馏水中，冷却后再加蒸馏水至 1000ml 。 3 (皂化剂 取氢氧化钾 ( 分析纯 ) 60g ，溶于 600ml 蒸馏水中，再加异丙醇 400ml ，混匀，置棕色瓶中保存，于室温下保存可使用两个月以上。 4 (氧化剂 称取过碘酸钠 650mg ，溶于 500ml 蒸馏水中，然后加无水醋酸铵 77g ，溶解后，再加冰醋酸 60ml 。 5 (显色剂 取 4ml 乙酰丙酮，加到 1000ml 异丙醇中，混匀，置棕色瓶中，室温保存。 6 (三油酸甘油酯标准溶液: ( 1 )贮存液 (10mg/ml) :精确称取三油酸甘油酯 1.00g ，用少量抽提剂溶解后，移入 100ml 容量瓶中，最后以抽提剂稀释至 100ml 刻度处。置冰箱中密闭保存。 ( 2 )应用液 (100mg/dl) :准确吸取上述贮存液 10ml 加到 100ml 容量瓶中，以抽提剂稀释至 100ml 刻度处，置冰箱中密闭保存。 7 (异丙醇 【操作】 1 (甘油三酯的抽提 取干燥洁净的小试管 3 支，标记，按下表操作。 试剂 (ml) 标准管 测定管 空白管 血 清 - 0.2 - 标准应用液 0.2 - - 蒸馏水 - - 0.2 0.04mol/L H 2 SO 4 0.5 0.5 0.5 抽提剂 2.5 2.5 2.5 将以上三管置混匀器上振荡 20min ，静置分成二层后，吸取各管上层液放入相应的另外 3 支已做标记的试管中，即为甘油三酯抽提液。 2 (皂化、氧化及显色 另取干燥洁净的小试管 3 支，标记，按下表操作。 试剂 (ml) 标准管 测定管 空白管 甘油三酯抽提液 0.3 0.3 0.3 异丙醇 1.0 1.0 1.0 皂化剂 0.3 0.3 0.3 充分混匀后置 65 ? 水溶中保温 3 分 氧化剂 1.0 1.0 1.0 显色剂 1.0 1.0 1.0 各管充分摇匀后，置 65 ? 水浴中保温 15min ，取出冷却后，于波长 420nm 处，以空白管调 0 ，进行比色，分别读取并记录各管吸光度值。 【计算】 血清甘油三酯的含量( mg/dl ), 血清甘油三酯的含量( mmol/L ) , 【注意事项】 1 (当吸光度高于 0.7 时，表示甘油三酯浓度过高，彼此线性关系较差，应以生理盐水将血清稀释后再进行测定。 2 (显色后 15 , 60 min 内显色较稳定，应在此时进行比色。若在 15min 内则显色不完全，若超过 60min 则显色不稳定。 3 (本法简单、快速，干扰因素少，不受溶血黄疸影响。 4 (本法测定正常值为 50mg , 150mg/dl 或 0.57 , 1.69mmol/L 。 【思考】 1 (皂化的目的是什么,抽提液的作用是什么, 2 (要得到准确的血清甘油三酯含量应注意哪些问题, 3 (血清甘油三酯的正常浓度是多少,测定其有何临床意义,