高压脉冲电场在液态蛋杀菌中的应用及其对微生物和蛋白质的作用机制

高压脉冲电场在液态蛋杀菌中的应用及其对微生物和蛋白质的作用机制 高压脉冲电场在液态蛋杀菌中的应用及其对微生物和 蛋白质的作用机制 江南大学 博士学位 高压脉冲电场在液态蛋杀菌中的应用及其对微生物和蛋白质的 作用机制 姓名:赵伟 学位级别:博士 专业:食品科学 指导教师:杨瑞金 20090801捅璺 摘 要 ,技术是一项很有前景实现工业化应用的食 高压脉冲电场 品非热杀菌技术。在接近常温下可有效杀菌钝酶,并最大限度地保持食品的 色泽、 风味和营养成分。目前,对在食品保藏中应用的研究多集中在果蔬汁的杀菌 上,对 富含蛋白质的液体食品的杀菌研究较少,人们对对蛋白质的影响和作用机理 以及 的钝酶机理尚未清楚。基于食品卫生和安全方面的考虑,很多国家己不允许食品工 厂使用带壳的禽蛋,液态蛋已成为禽蛋业的发展方向之一。由于液态蛋热杀菌非常困难, 迫切需要一种新型的杀菌技术与工艺。本文主要围绕在富含蛋白质体系一液态蛋中 的应用及其一些基础性问题开展研究,旨在获得应用于液态蛋杀菌的工艺,明确 对蛋白质的结构与功能的影响。 本文研究了对液态蛋杀菌特点,明确了工艺要点。相对于热处理?, .,温和热?与/,协同对液态蛋杀菌工艺具有更好 的杀菌效果,并且对液态蛋的品质影响较小。采用荧光标记与流式细胞仪结合技术研究 了对微生物的损伤效应,实时监测了损伤亚死细胞的存在和产生规律,发现 与温和热协同可减少产生损伤亚死细胞比例,从而提高杀菌效果。 以蛋清蛋白和卵白蛋白为研究对象,研究了对蛋白质起泡和乳化性能和结构特 性的影响,发现处理可引起蛋清蛋白分子结构展开,疏水基团和巯基外露,蛋清蛋 白的起泡和乳化功能提高;当处理强度增大到一定程度,蛋白质会发生疏水作用和 ..一交联作用形成蛋白质聚集,溶解度下降,蛋清蛋白起泡和乳化功能下降。 本文还研 究了作用下蛋白质的聚集行为及其主导作用力。 以溶菌酶为研究对象,采用圆二色谱、紫外吸收及多阶导图谱、荧光光谱和拉曼光 谱技术研究了对溶菌酶二级和三级结构的影响,得到了对溶菌酶结构影响的 更详尽信息,监测了作用下处于溶菌酶活性部位和参与底物结合的相关氨基酸残基 所处微环境的改变,反映出对溶菌酶活性区域结构的改变从而影响酶与底物结合, 最终导致了溶菌酶活性下降;发现了山梨醇对作用下的溶菌酶和胃蛋白酶结构与活 性的稳定作用以及和热钝酶机制的差异,丰富了钝酶机制的理论。 关键词:非热加工技术;高压脉冲电场技术;液态蛋:溶菌酶;杀菌;钝酶 ? ?, . . ?‘, ? ..;. . /, . ,., ..?’ ., . 舔 . , ,.. , 蜘 .. ,? . . : , , ,, , 简写对照表 简写对照表 最少程度加工食品 高压脉冲电场 曲 超高压电场强度 差示扫描量热仪 .一,’.二硫代二硝基苯甲酸盐起泡能力泡沫稳定性乳化能力乳化稳定性 扫 描电子显微镜 透射电子显微镜 羧基荧光素乙酰乙酸 碘化丙锭 羧基荧光素 流式细胞仪 一苯胺基..萘磺酸 ?表面疏水性 原子力显微镜 二硫苏糖醇圆二色性 队聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠一聚丙烯 .酰胺凝胶电泳 酪氨酸色氨酸 胱氨酸 相对残存酶活 ? 二硫键 . 巯基独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 虢二乒匪咻砷?月弓日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定: 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文, 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名:第一章绪论 第一章绪论 .高压脉冲电场技术的发展和现状 .. 食品概念及食品非热加工技术的兴起 热杀菌巴氏杀菌、常压和高压高温杀菌一直是食品工业中极为重要的杀菌钝酶 方式。传统的热杀菌方式能够有效地杀灭食品中的各种腐败微生物和病原菌,延长食品 保质期,但加热处理也不同程度地对食品营养物质如维生素、功能蛋白质、功能色素 等、挥发性风味物质、天然色泽和质构及生理活性成分等产生一些不利的影响,特别 是对于热敏性或有特殊要求的功能食品常不能达到预定的效果。同时,随着现代社会人 们生活水平的提高,消费者逐渐趋向于新鲜且保持原有天然风味的食品,人们对食品的 新鲜、营养、安全要求越来越高,希望食品在加工过程中能保持其原有的品质,因而导 ,概念的诞生【捌,推动了对非热加工技 致了食品 术的研究开发。国际食品加工界相继出现了一系列新的非热杀菌技术,如高压脉冲电场、强磁脉冲、脉冲强光、超声 ,、超高压 波、高能射线、膜分离和活性包装等技术。美国食品科技学会在年专门成立 了非热食品加工分会,非热食品加工主要是非热 杀菌已成为国际食品科技界最为活跃的研究领域之一和食品加工技术的一个新的增长 点【】 .. 技术的发展历程 上个世纪年代,和等学者率先对灭菌技术进行了研究,并通 过实验证明了的非热效应【】。年代以后,、等学者对 灭菌机理做了进一步探讨,并研制出型试验设备‘】。年代后,华盛顿州立大学 研制出了较为成熟的设备,并获得了专利。等人还对指数衰减脉冲波、振 荡脉冲波和矩形脉冲波的灭菌效果做了对比研究,发现矩形脉冲波的作用效果最好【】。 目前较为成熟的是华盛顿州立大学食品非热研究中心利用脉冲电容储能,触发放电产生 指数衰减型高压脉冲研制的处理实验系统,以及随后利用脉冲成型网络研 制的高压方波处理实验系统。年美国公司为俄亥俄州立大学食品技术系 设计制造了第一台商用处理系统,该系统是利用半桥型拓扑结构,通过两个完全独 立的固态开关成型的双极性高压脉冲。技术是近年来研究最多的食品非热处理技术 之一。目前,设备已经发展到接近商业化阶段,很多研究机构先后开发出带有 无菌 包装体系的中试规模处理系统,如美国华盛顿州立大学食品非热处理中心拥有~套 处理量为/的连续的处理体系,可处理浓缩或新鲜的苹果汁、豌豆汤、牛乳 等产品;俄亥俄州立大学的无菌技术研究中心开发出整套的处理系统和无菌包装系 统,此系统处理产品流速为...讹;另外,俄亥俄州立大学还开发出系列小 型实验用设备;位于美国加利福尼亚洲的 公司也开发了处江南大学博士学位论文 理量/和/的“”处理体系。脉冲电场食品非热处理技术己经成为 】。 近年来最有前途实现工业化应用的非热灭菌技术之一 .. 技术的国内外发展现状 目前,国外在非热加工实验设备、中试设备方面取得了很大突破,为技 术的相关基础研究和应用研究提供了硬件保障,近年来国外每年都有大量关于非热 加工技术的研究报道。作为一种新型的食品非热杀菌技术,一直受到美国、德国、 法国、加拿大等发达国家政府、企业和研究单位的广泛重视。目前在设备研究和制造方 面俄亥俄州立大学处于国际领先地位,该大学已建成一条处理能力达到/的 准工 业化生产线,进行了包括橙汁、苹果汁、酸奶等产品在内的一系列产品的杀菌试验,并 取得了良好的成果。该生产线加工的果汁产品的色泽、风味、营养等质量指标明显好于 传统的热杀菌的产品,目前设备开发和某些产品如酸性果汁的加工工艺均已发展到 公司利用技术生产的果汁已通过了食品 准工业化阶段。美国俄勒冈州 药品管理局认证,并在波特兰市场上正式销售,其产品有苹果汁、草莓汁等,所用 系统为型,处理速率约/,货架保存期为周【?以。在美国,俄亥俄州立 大学、华盛顿州立大学、明尼苏达州立大学、国家食品安全与技术中心和 公司等多家单位都在进行技术的研究,近几年内美国申请杀菌设 备和技术方面的专利近项。目前欧盟成立了高强度电场项目研究委员会,德国柏林 理工大学、加拿大圭尔夫大学、英国和荷兰的实验室、日本的公司 和科技大学都在杀菌效果的研究方面取得了一定的进展。总之,国际上 杀菌技术正进入实用阶段,随着一些关键问题的解决,该非热杀菌技术将得到进一 步推广。 与国外相比,国内有关非热加工技术的研究起步晚、研究少。国内在上世纪 年 代后期开始进行杀菌方面的研究,目前主要有江南大学、中国农业大学、清华大学、 华南理工大学、吉林大学、浙江大学和大连理工大学等高校在开展技术的相关研究, 江南大学从美国俄亥俄州立大学购置一套型杀菌设备,并进行了较为基础 性的研究和设备改造。中国农业大学、吉林大学和华南理工大学等机构对对果蔬汁 中杀菌钝酶效果及机理研究做了许多基础工作。浙江大学、清华大学在设备和处理 腔设计方面取得了一定成果。近年来,我国学术期刊上出现少量关于在食品保藏中 应用的报导【拍】,但远没有国外研究的深入。可以说,我国对技术的研究方兴未艾, 但与国外相比尚存在较大差距。 . 杀菌机理及杀菌效果 .. 杀菌机理 目前对微生物的作用机理尚不完全清楚,多数学者认为是通过外部电场 与微生物细胞膜直接作用,从而破坏细胞膜的结构,形成“电穿孔”而导致微生物灭活。 微生物细胞和外环境之间进行着活跃的物质交换,细胞膜的完整性对保证细胞生命活动 第一章绪论 的正常进行有着极其重要的作用。的杀菌作用与其对微生物细胞膜的影响密切相 关。当微生物被置于高压脉冲电场中时,细胞膜会被破坏,从而导致细胞内容物外渗, 引起细胞死亡。关于脉冲电场杀菌机理的解释,人们提出了多种学说,其中以下两种模 型被广泛接受】。 一细胞膜的电穿孔 电穿孔现象是指细胞暴露在作用下出现的细胞膜失稳并在细胞膜上形成小孔 的现象。细胞质膜通透性大幅增加,胞内的渗透压高于细胞外,最终导致细胞膜的破损。 其基本原理如下: 设细胞为球形,其所处外电场诱导的膜电位可由下式表示: ./】“‘ ? 式中,是细胞的半径,是外加电场强度,是电场方向与指定点法线之间的夹角 如图,?是外加交流电场的角频率,是细胞膜电介质的弛豫时间常数。 当外加交流电场频率足够低,以致于?时,或者外加电场为直流电场时,则. 式可简化为: . ? 对于细胞的两个极点,或,则外加电场诱导的膜电位可进一步化简为: . 随着外加电场强度的增大,在细胞膜上诱导的膜电位也随之增大。当增大到一定程 度,即。,时,则细胞膜将出现电穿孔现象。此时的诱导膜电位,叫做临界膜电位, ,叫做临界外加电场。于是,公式.变为: ./】“二 ? 公式.变为: ‰;.。 ? 公式.变为: 哳.慨 ? 由公式.~?可以看出以下几点: ?当外加电场为交流电场时,在细胞膜上诱导的膜电位随着电场频率的增加而增 加,也就是说,对于同样的诱导膜电位,所要求的高频电场的强度比低频电场和直流电 场强度高。进一步讲,对于同等程度的电穿孔,高频电场要比低频电场或直流电场的强 度高。 ?诱导膜电位随细胞尺寸的大小而改变,在同样强度的外加电场作用下,大细胞的 诱导膜电位高。随着外加电场强度的增加,电穿孔现象首先出现在那些大细胞上。进一 步讲,对于同等程度的电穿孔,大细胞所需要的外电场强度低。 ?随着电场强度的增大,电穿孔将首先出现在为或的细胞的两个极点。然后, 随着电场强度的进一步增大,电穿孔的出现~般按值由大到小顺序进行扩展。但是, 不管外电场强度怎么增大,细胞赤道上的诱导膜电位永远等于零,即不会有电穿孔现象。 进一步讲,随着外加电场强度的增大,细胞膜上的电致孔洞增多、孔径增大。当外加电 江南大学博七学位论文 场强度过大,细胞膜孔过多、过大而难予封闭,将导致细胞内外物质泄漏甚至死亡。 图.是电穿孔机制的模式图。图.是外电场等于临界值时在细胞两极点呈现膜孔 的情况;图一是外加电场大于临界值时在细胞上呈现膜孔的情况。 ; 极点 ; ? ? 囝 圈 极点 图外加电场下细胞电穿孔的形成 【为外电场强度等于临界值,孔在细胞两极点形成 为外电场强度大于临界值,细胞上膜孔形成范围增加,孔数增多,按分布 .二细胞膜的电崩溃 机制与模型 微生物细胞膜由镶嵌蛋白质的磷脂双分子层构成,它有一定的电荷,具有一定的 通透性,也有一定的强度。.膜的内外表面间具有一定的电势差,当细胞膜上外加 一个电场时,这个电场将使膜内外的电势差增大。由于细胞膜两表面堆积的异号 电荷相互吸引,引起膜的挤压;当电场强度增大到一个临界值时,细胞膜的通透性剧增, 腹上出现许多小孔,使膜的强度降低;进一步的作用使细胞膜产生不可修复的大穿孔, 使细胞组织破裂、崩溃,导致微生物失活。 . ‘幽 /: /: 囫 啼沙卅 咖. /卅 九 // 叼// 网 /刀’ 图可逆与不可逆电崩溃示意图 . 目前,穿孔效应假说被大多数学者所接受,但电穿孔特性的研究在国内仍处 于早期 阶段,国外研究时间较长,但至今仍然有许多现象无法解释,而新的现象又不 断地被报 ’ 埴 .. 杀菌效果 早期的研究主要集中在对微生物的杀菌效果方面,人们已就对多种腐败 第~章绪论 菌和致病菌的杀菌效果进行了大量而系统地研究。目前,人们已经对的杀菌 效果 有了深入的认识和掌握。杀菌实验的指示微生物包括枯草芽抱杆菌.、德 氏乳杆菌?.、单核细胞增生李斯特氏菌厶、荧光假单孢菌 .、啤酒酵母.、金黄色葡萄球菌.、嗜热链球菌 .、大肠杆菌倔、大肠杆菌. :、霉菌和酵母等, 研究结果表明处理对这些微生物的营养体细胞均有较好的杀灭作用,但芽孢 表现 出较强的耐受性。对各种微生物的杀菌效果见表.。 最近,国际学者对关系食品安全和处理食品货架期的损伤亚死微生物的 ”特征, 研究产生浓厚兴趣。等【】和等【】提出杀菌具有“ 即不存在损伤亚死细胞‘ ’。然而,最近的研究结果否定了 这一理论,等【】和掣报道对大肠杆菌和沙门氏菌的致死作用是由于 对微生物细胞的损伤积累所致,处理后存在损伤亚死细胞;等【】 研究表明损伤亚死酵母细胞经一定条件培养可修复,且受环境因素影响;等 【】证明了处理绿茶后损伤亚死微生物的存在,并提出处理后经一定时间 冷激 处理,可以使损伤亚死细胞进一步失活,从而大大延长处 理食品在常温下的货架期。等【研究表明损伤亚死微生物的产生与 电场强度和体系相关。这些重要的研究结果不得不使人们对的杀菌机制重新 认 识。 ? ? ? ?.鲻《懈簌踞‘ ?葛.爝鳆僻瓢吕丰.? ?匿 匣 匿 匣 .鲻嬉髅籁昌丰. ?.鲻堪懈暴葛丰.? 。赫媳剐文 宣/人 ?.鲻蟮僻籁吕丰‘.量 冷.鲻.?忑.骞。/冷.台 .、? .捻 崎.鲻鼙癸.?价..,人卫.各.【 .。葛乙 .啪/立.?认 .昌/互.? ?.鲻《髅疑丰‘吾.是鸶七.骞/人苦 寸价.. ? 鼋 韬 蘑 垂晷 叫匿 叫匿 匣 匣 蜡 韬蜜匣 铽寒叵. 凰 .邋尉文旺遐 懈零叵?. 佰暴匠碘蜡酉 昌 ? ?..懈暴匣一目昏. ..佰暴匠吼. 吮。勺.鼙誓辎?牛暑寸.? 寸 寸 吮锶 仪秘牮貅书琏扑怔心. 可. 粲靛趁卜 眯荣嵌霉州蓦匣恃靛函瞄厶.僻 叫叵 匣 口。口曩翟爵盘州一磊一.一?置葺?盎州?昭.豳厶?星?一一. 匿 烬旧器 捌窿餐 钼篷聱 嘲韵罄 辞州廿 辞鎏鼙 潮剞甏 辞磐鬻 辞普墨 疑疑定骤 璐辫是嚣 峰畚熏辎 一盂爵.. 毽,譬譬 匾 粗监 套 ,一一葛一垂一 粼熏霉删器 姐冀壕卅狮限 糨甓珥鬻骚曝 粗宴忡鼙装弑 粗浆壕糌仲限 糖浆壕熏啦趣 扭婆壕熏岖 登【耄心葛.? 扭暂婶掘卸搬删 尊葛譬譬? 避墨 避毪 躯岖念葚霉辕 姐呕雩粗慑粼蠡 ?蓬饕毒莲 恩粗靶恩敞擗批 ‘ 砷器’葛心田葛一奎札是? 吣蕊?盒葛譬蓬?~马目通 器基君各?誉?歪盘 %譬?彗譬??莲&盈? 吨?芒?毽魄毽?譬盒专? ?譬???啦的?惫?们氏 ? 勺 壹 芝一 蚕巴 梅状奄 。 要啃雹 勺 『.巷专。弓鼋 『鲁。吧磊 乜?咎?一;雹 母 基若。屯暮口 器号髓分?器们 砖口一呼日磊函 矗暑一。至.怼勺磊器阻 屯磊至.嚣 ,嚣弓墨时口?盘 罂。暑。勺缸护咎秀雹 印重窆.喜 鲁。它钻护咎嚼.【拿墨 勺鼹护??雹? ? ? ? 啦占寸 ?寸 :‘ .? 叫匿 \?【. ?.蜒鼙癸.\, ?嶂寸【卫.吩心.、,?卜.?.崎 且.?田寸. ?毒互价.心 ?占业.爆鳝样纂颦‘宣/ ?寸.??一.塔娶哥./人岭一 .矮爨癸.岛。/人【”. ”.也.鲻《髅纂踞.?吾.。,人若.。 ‘?拈.鲻蟮髅纂靼.?苦..王迢若.。 匿 叫匿 匿 匿 叫匿 .【. 。.口.翅 爨手辎姆牛.? 卜 僻熟 .鼙哥辚鼯牛占.【.? 星冷.一.鼙面辚始.? 剐文,宕?.?寸.【.岔岔.”.?寸.? 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增加,可见使过氧化物酶失活与其二级结构中.螺旋的减少和荧光强度的增加有 关。等【】等研究了胃蛋白酶在作用下的失活情况,实验结果表明胃蛋白酶 在作用下的失活与电场强度、酶溶液电导率、值有关,且符合一级动力学模型。 圆二色谱显示胃蛋白酶的失活与其二级结构中.折叠的减少密切有关,随着导致 胃蛋白酶活力不断下降,其.折叠结构也相应下降。钟葵等【】同样发现过氧化物酶和多 酚氧化酶在作用下的失活都与其二级结构的改变有关,可见无论是以.螺旋或. 折叠结构为主导的酶在作用下的失活都与其二级结构的改变有关。孙沈鲁等研究了 对多聚半乳糖醛酸酶活性及构象的影响。研究结果显示的活性随电场强 度和脉冲个数的增加而降低。荧光光谱分析表明:处理后蛋白的荧光发生不同 程度的荧光淬灭和荧光峰的位秽】。曾新安等报道木瓜蛋白酶在 /作用 个脉冲处理后,其活性降低了.%。荧光偏光光谱分析表明处理后荧光强度 增加且发生红移,推断木瓜蛋白酶的伐.螺旋结构松散拉伸,分子内部的氨基酸残基暴露 于分子表面,最终导致酶失活【。钟葵等应用圆二色谱和荧光光谱研究了对脂肪 氧化酶的结构的影响效果。研究结果表明处理后二级结构中一螺旋 含量显著降低.,发射光谱中的荧光强度显著增大.,表明破坏 了二级和三级结构【不。张若兵等研究了对活性的影响,同样得到类似 的结果。这些研究表明人们已经注意到了作用下酶蛋白分子结构的变化,特别 是二级结构的改变,但此方面的研究尚未得到完全阐述,并且还未真正涉及到作用 下蛋白质分子三级结构的改变。装。崞篷卜 慕譬垃卜 装进卜 装。崎逝卜 摹盐卜 锹蜉溢 装瓮鞋卜 零厶趁卜 装。卜逝卜 装寸.逝卜 零.?啦卜 装?逝卜 零葛逝卜 零??逝卜 装??盐卜 零 .”?逝卜 暴数卜 摹鳗卜 式叭笈卜 更%蛰卜 摹窝篷卜的暑。寸疗 ??. 心. 生?. ??. ? ?. ?. ?昌蚤昌 ? ?. 望岭. 。籁弧凶固厶 .量 .卜一.? 生。‘兰一.善 .?.? .一 寸.量?? 寸互.封 ./ .暑菪 ..】?墨 望?.鹭一乜.暑。/ .配 ?吨.生。峪【.晷/人?.【.是鸶楚懈释霉.? /函。导删罐簿躜出.?.岍..跫垂《僻瓤昌丰.? .臭蓬楚懈籁导丰.? 《函寸栅耀簿珀配.配.迢艺..走蕾繁懈搽靼.? .。/???.是鋈堪髅赫靼.? ./盈 . .凳羞鳝懈搽耳丰.? .【.是錾《懈籁杂.? 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要神?著 溢摹骞禽娥 垦莒尉议一毯很走蕾一毯骥辫翘?癸淤是鹭?蹦文臀避熟湖.一剐文韵槛.?懈钕剐议. 。锹限,。?:蹄器张:酲第~章绪论 . 对食品组分的影响 随着杀菌设备和应用技术的不断进步,国际上对对食品组分的影响和安 全性问题越来越关心,近年来这方面的研究报道有增多的趋势。 .. 对食品蛋白质组分的影响 酶是一种具有催化活力的特殊蛋白质,处理可以钝化酶活和改变酶的结构,那 么也必然会对食品蛋白质组分的结构与功能产生影响。而且从原理上讲,脉冲电场 会影响蛋白质基团问的静电相互作用和带电基团的定位,扰乱蛋白质氨基酸残基间的电 场分布和静电相互作用,导致电荷分离,从而影响蛋白质的结构二级和三级。另外, 电极周围的电化学反应也可能会对包括蛋白质在内的食品组分产生一定的影响。 等报道,处理不会引起卵球蛋白的明显变性,而处理过的蛋清蛋白的热凝 胶性能稍有下降,但还是明显好于热处理的蛋清;等【】报道,在使微生物数目减少 .个对数值的作用强度下,对牛奶免疫球蛋白的活性和结构的影响不显著; .等用./左右的指数衰减脉冲电场处理卵清溶液,发现处 理后卵清蛋白与,’.二硫代二硝基苯甲酸盐反应性增强,说明可使卵清 蛋白部分展开或提高解离成易反应.的离子化程度。等【】用./的指 数衰减脉冲电场静态处理卵清蛋白和.乳球蛋白浓缩液,发现两种蛋白都有不同程度 .%的变性,差示扫描量熟仪测定显示处理后的.乳球蛋白浓缩液 热变性温度下降.?,而卵清蛋白的热稳定性有所增强,电泳分析有共价键参与的凝 聚生成。等佟】报道可抑制胰岛素分子柔性,从而影响底物与活性位点的接触。 /作用个脉冲可引起牛乳中%蛋白变性。“等【】研究 等【】发现 了对大豆分离蛋白结构与功能性质的影响,结果表明随着脉冲强度和脉冲处理时间 的延长,大豆分离蛋白的溶解度、乳化性、起泡性及疏水性增加,当脉冲强度或处理时 间大于一定程度,蛋白质分子变性程度增加,功能性质下降。张铁华等】研究了 对蛋清蛋白功能性质的影响。研究结果表明蛋清蛋白的溶解度在脉冲电场强度大于 /时下降;蛋清蛋白的乳化性、起泡能力、泡沫稳定性及疏水性先随脉冲电场强 度增加而增大,但当脉冲电场强度大于/后逐渐下降。卢蓉蓉等【】研究了 对乳铁蛋白结合铁能力的影响,发现的铁结合能力大体随电场强度、处理时 间和脉冲宽度增加而降低。曾新安等】和刘燕燕等】研究了对大豆分离蛋白溶液 的表面性质和粒径分布,研究结果表明一定强度的可影响氨基酸的极性和电负性, 进而影响了蛋白质分子间的相互作用,从而影响蛋白质胶体体系的毛电位、稳定性,改 变胶束的粒径分布。 .. 对食品脂质组分的影响 一些研究者已经提出了处理食品过程中的电化学问题和电极腐蚀问题。 等【叼发现处理过程中的电化学反应引起的电极腐蚀问题。等【】 的研究显示,在处理食品过程中,电极中的铁、铬、镍、锰等金属物质会少量释放江南大学博士学位论文 到食品中。这些因素决定处理食品过程中,电化学反应必然发生,电化学反应的产 物,例如一些自由基、活性氯、活性氧等很可能引发脂质由单重态氧、自由 基和其他氧 化性物质引发氧化反应链式反应,产生一系列复杂的氧化产物。 最近,处理过程中脂肪酸、油脂等发生变化的现象开始受到研究者的关注, .等【】发现处理杀菌可引起葡萄汁中脂肪酸总量的减少,其中月桂 酸的变化最为明显;等一应用辅助提取油菜籽中的油脂来提高出油率, 】和曾新安 发现辅助提取的油菜籽油的酸值显著高于未用处理的。资智洪等【 等【叫报道处理油酸和花生油会导致一定程度的脂质氧化,过氧化值升高以及不饱 和脂肪酸含量下降。梁琦等眇研究了处理对油酸理化性质的影响及处理过的 油酸在贮藏过程中理化性质的变化。实验结果表明油酸的过氧化值随着处理强度和 贮藏时间的增加显著增大,羰基值在处理后的一周后迅速升高,处理过的油酸 碘价在贮藏后有下降趋势。 .. 对食品碳水化合物组分的影响 关于对碳水化合物影响的研究较少。张鹰等【咖报道处理的脱脂 牛乳中乳糖含量未发生显著变化。.等【】研究发现处理对葡萄汁中还 原糖含量几乎没有影响。等 】采用对玉米淀粉进行处理,结果表明 /处理后淀粉颗粒表面会出现明显的小孔和凹坑,射线衍射峰的强度和焓值及 糊化转变温度降低,表明淀粉在作用下发生了分子结构破坏和重排。 .. 对食品其它组分的影响 等【蚓研究发现处理对橘汁中类胡萝卜素的活力有很小的影响。等 研究了处理牛乳和橙汁及处理后的保藏期?保存内水溶性维生素维 生素、叶酸、维生素和核黄素的变化,发现/处理后样品中的维生 素可保留%以上。等【】报道花色苷一矢车菊素..葡萄糖苷在作用下可 发生降解,吡喃环断裂生成查尔酮。.等研究了处理后橙汁中维生 素以及抗氧化能力的变化,发现维生素的保留量随场强、处理时间增大而减小。 处理后橙汁中维生素的保留率在%以上。 .液态蛋及其热杀茵存在的问题 液态蛋又称液蛋 ,是禽蛋打蛋去壳后,将蛋液经杀菌等一定处理后包 装冷藏冷冻,代替鲜蛋消费的产品,能有效地解决禽蛋质量保障性、运输轻便性、 保藏安全性、使用方便性的问题。我国是世界养禽大国,禽蛋产量连续多年位居世界首 位,由于加工技术落后、加工品种单一、附加值不高,至今仍处劣势地位,尤其是蛋液 及其制品的生产几乎还属空白。目前,国内鲜蛋市场已近饱和,但液态蛋市场的开发充 满商机。在其它一些发达国家如美国、日本等液态蛋的使用量均占整体蛋量 的%以上, 使用的业者包括:养虾饲料业、烘焙业、餐饮业等,台湾目前液态蛋市场也占%,现 在我国液态蛋几乎仍处于空白。由于鸡蛋价格低廉,加上新鲜度与运输条件等因素,带 第一章绪论 壳鲜蛋不易输出,且难于化。目前,基于食品卫生和安全方面的考虑,很多国家已 不允许食品工厂使用带壳的禽蛋,液态蛋因其具有方便、卫生、便于运输等优点,已成 为蛋制品的主要发展方向之一。 液态蛋的杀菌一直是一个难题,因为蛋白热凝温度为?,蛋黄热凝温度为 .?,所以既要杀死液蛋中的微生物,又要使液态蛋不凝固非常困难?。已经 证明,受沙门氏菌污染的禽蛋,普通熟制不能达到食品安全要求,因为热量传递需要时 间,鸡蛋在沸水中煮,其内部温度仅为?,这样的煮熟时间和温度不能 杀死沙门氏菌。目前,液态蛋主要采用热巴氏杀菌美国,.,但巴氏杀菌的 温度和时间很难控制,温度过低杀菌效果差,反之不但蛋白凝固,在热交换器表面形成 粘膜堵塞管道,而且还会影响液态蛋的起泡性等功能性质‘’吲。由于巴氏杀菌所带来 的问题,液态蛋生产迫切需要一种新型的杀菌技术与工艺代替传统的热杀菌 工艺。 .立题背景及意义 目前,技术的进一步商业化及其在液态蛋等富含蛋白质食品基质中的应用尚存 在如下问题: 液态蛋等食品基质的特点决定需要特殊的加工工艺和操作要点 对在食品保藏中应用的研究多集中在果蔬汁的杀菌上,对富含蛋白质的液体食 品的杀菌研究非常少,而且其杀菌工艺研究也远没有对果蔬汁杀菌工艺研究那样透彻。 主要原因是液态蛋等富含蛋白质的液体食品具有粘度大、热敏性强、电导率高等不利于 应用的特征,以及人们对对蛋白质的影响和作用机理知之甚少,而液态蛋等热 敏性富含蛋白质液体食品又是最为迫切需要非热杀菌技术来替代热处理工艺的。 损伤亚致死微生物的存在不利于非酸性的液态蛋延长其货架期 目前,国际上对损伤亚死微生物的研究时间不长,以前的研究认为杀菌 具有“ ”特征,既一定强度的作用于微生物,要么使微生物完全失活, 要么对微生物没有作用。近期研究结果发现除杀死一部分微生物外,还会形成一定 ,这~部分损伤亚死微生物可在适宜的环 比例的损伤亚死细胞 境下进行修复,恢复其繁殖能力,对食品安全及处理食品的货架期造成很大影响, 尤其对于液态蛋等非酸性食品基质的货架期影响较大。而对于损伤亚死微生物的检 测、产生规律、控制措施及其潜在机理几乎未见报道。 人们对对食品组分蛋白质的功能与结构的影响缺乏系统认识 目前,大部分的研究主要集中在对不同致病菌和能引起食品变质的腐败菌的杀 灭效果、产品的风味变化和货架寿命等方面,对食品中的蛋白质组分和其它组分如维 生素;多糖和脂质等的影响的研究则非常少,制约了该技术的商业化应用。美国的食 品与药物管理局已经要求该技术的研究单位提交有关对食品主要组分的影 响和电极材料的泄漏等问题的。近年来,国际上已经开始重视对包括酶和蛋白 质在内的食品组分的影响以及在富含蛋白质食品中应用的研究,对对一些酶的活力江南大学博十学位论文 的影响进行了一系列的研究,并对对免疫球蛋白、卵清蛋白等极少数生物活性蛋白 的结构与活性的影响作了初步研究,对处理过程当中的电化学反应和电极材料泄漏 等问题进行了一定的讨论。然而,这些研究绝大部分都还局限在宏观水平上,而且不同 研究者报道的研究结果很不一致,甚至相互矛盾,因此没有、也不可能回答其中的机理 问题和得到对复杂食品体系具有普遍指导意义的结论。另外,目前更加缺乏对食品 中的重要功能组分一蛋白质等大分子的其他重要功能性质,例如溶解度、乳化性能、胶 凝性能、起泡性能和组织化作用等的了解。而这些信息对于该技术在富含蛋白质的食品 复杂体系中应用是至关重要的。 钝酶机理还远未清楚,需要对酶结构与功能影响的大量信息 主要用于食品的杀菌钝酶,目前钝酶机理尚不清楚,阻碍了其工业化进程。 虽然已经有少量此方面的研究报道,而且研究者已经注意到了作用下酶蛋白分子结 构的变化,特别是二级结构的改变,但此方面的研究尚未得到完全阐述,并且还未真正 涉及到作用下蛋白质分子三级结构的改变。因此从分子水平上研究对酶的结 构和功能的影响十分必要。 本课题围绕上述问题展开研究, 随着在液态蛋加工中应用的一些基础问题的 解决,可为增添新的理论,加快的工业化进程。并且利用获得的理论来指导 在液态蛋及其它富含蛋白质食品体系的应用,获得液态蛋非热/.新工艺和优质产 品,是对新型液态蛋工艺的开拓性研究,对于我国禽蛋产业发展具有重要的现实意义。 .本课题的主要研究内容 应用于液态蛋杀菌的工艺 研究对液态蛋中常检出微生物的杀灭效果和可行性工艺,并与传统热处理在杀 菌效果、货架寿命和对产品品质的影响方面进行对比。 损伤亚死微生物的存在、产生规律和控制措施 本课题拟通过荧光标记和流式细胞仪结合技术研究损伤亚死细胞的存在、产生 规律以及与其它手段协同减少损伤亚死细胞比例的措施,为应用于液态 蛋杀菌、延长货架期提供指导和理论支持。 对蛋清蛋白功能性质与结构的影响 研究不同参数对蛋清蛋白溶解度、起泡和乳化功能性质的影响及潜在机理,重 点研究导致作用下蛋白质的聚集行为,分析作用下蛋白质聚集形成的主导作 用力。 对溶菌酶结构与活力的影响 以液态蛋中主要活性蛋白质一溶菌酶为研究对象,研究不同参数对溶菌酶活力 的影响和溶菌酶二级、三级结构的变化,建立作用下溶菌酶的构效关系,比较 与热钝酶机理的异同,为的钝酶机理提供新的理论。 第一章绪论 参考文献 . . : 【】.,,:. . . .: .,,:. . . . .:. . . , .. 【】. ,,:?. . . ./ , 【. : . , , .. , , 【】. ,,:. . .【】. ,,:?. . . 【】.,,:. . . : . .,..., : :.. 】. .曾新安,称勇.脉冲电场非热灭菌技术【】.北京:中国轻工业出版社,,. . , , . , 【】. ,:. . . , ,川. ,,:.. . , , , .【】. ,,:. .廖小军,钟葵等.高压脉冲电场对酵母和大肠杆菌的杀灭效果】.食品与发酵 工业,, :?. .史梓男,廖小军,等.脉冲电场中西瓜汁杀菌钝酶效果分析【】.高电压技 术,,:.. .祖国仁,孔繁东,等.高压方波脉冲电场对微生物的致死作用【】.高电压技术.,: . .钟葵,吴继红,廖小军,胡小松.高压脉冲电场对植物乳杆菌的杀菌效果及三种模型的比较分析 阴.农业工程学报,, :.. .殷涌光,闫琳娜,李玉娟.用高压脉冲电场对桃汁非热杀菌的研究【】.农业机械学报,, :?. .胡珂文,王剑平,盖铃,田红萍.高压脉冲电场在食品加工中的应用前景【】.食品工业科技, .:.. 江南大学博十学位论文 .崔晓美,杨瑞金,赵伟,孙中国,郁全丰.高压脉冲电场对石榴汁杀菌的研究【】.农业工程学报, ,:?. .赵瑾,杨瑞金,赵伟,马松杉,王艳芳.高压脉冲电场对鲜榨梨汁的杀菌效果及其对产品品质的 影响】.农业工程学报,,:. .方婷,严志明,王仁丽,陈锦权.高压脉冲电场处理时间对啤酒酵母火肠杆菌和青霉的致死动力 ?. 学【】.研究食品与机械,,: .王维琴,王剑平.高压脉冲电场在食品灭菌方面的应用】.农机化研究,,:. .但果,陈思平,汪天富,张新宇.脉冲电场对微生物细胞作用机理的研究【】. 深圳大学学报, ,:?. .张若兵,罗炜,程伦,王黎明,关志成.脉冲电场对脂肪氧化酶活性及构象的 影响【】.高电压技 术,,:. .梁国珍,孙沈鲁,陈梅英,陈锦权.高压脉冲电场对辣根过氧化物酶活性及构 象影响【】.食品与 机械,,:?. .李汴生,阮征编.非热杀菌技术与应用【碉.化学工业出版社,.. . , .. , :. . / ., . ,,:. . .. . 【】. ,. . .. , , , , 哪., ,:. . , , , .【】. ,,:. . .【】. , ,,.. . 】. . , ,,:. . , , ,矗 .【】. ,,:?. . . , 忉. ... , , : 【】. . , , .,:. .. . ,, ,【】. ,:. 第~章绪论 ../ , , 】. ,,:?. . . ,【】. ,..., ,,,. . . . 一 .【. ,: . . , 【】. . , ,?. . . , ,【】. ,,:?. ? ., , . 【】.. , ,: . .【】. ,,:? . . & , , , . 【】. . ,,: . . , , , 【】. ,,:. . , ,?矗 , . , 艮【】. , :?. . . , , , ‘’【】. ,:. .‘ . & , ’,【】. ,,. ., , , , 【】. ,:?. . ., , , , 【】. ,:. ., , ,氏 . 【】. ,:?. . ., ,. . .: . . ,&, 阴.江南大学博士学位论文 :.. . . , , , , , . 吼, 【】. ,,:. . ., , 【】 :. 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.. ,凡】. ,,: .. ., , , . . ; 】. ,,:. . . , , , .;,,:?. 【】. . . ,: ? , , :. ,, 【】. , , . . 【】. ,,:. .资智洪,曾新安,杨连生.强脉冲电场处理对脂质性质及组分的影响【】.食 品科技,,: . . .曾新安,资智洪,杨连生.强脉冲电场处理对花生油品质的影响【】.华南理 工大学学报自然科 学版,,:.. .梁琦,杨瑞金,赵伟,张文斌,王艳芳.高压脉冲电场对油酸的影响】.食品工 业科技,,: .. .张鹰,曾新安,朱思明.高强脉冲电场处理对脱脂乳游离氨基酸和乳糖的影 响研究【】.食品科技, ,:. . .,, , . .,:?. . , , , , . 【】. . ,:. . , , ,, ,【】. :..第一章绪论 . , , , , . , 一 . ,,:?. . 。 , , 【】. ,:. . , . 【】. ,,:. . ., .. ,: 【】. .? . , 【】. ,,:. . . , 】. ,,:. 第二章应用于液态蛋杀菌的工艺研究 第二章应用于液态蛋杀菌的工艺研究 .前言 液态蛋产品的杀菌一直是一个难题,很多研究表明?加热数分钟可使蛋清的 功能 性质下降?,所以既要杀死液态蛋中的微生物,又要较好保持液态蛋的功能性 质是非常 困难的。人们日益注重最大限度保留营养的现代烹饪方法和追求快餐、便餐的消费理念, 鸡蛋常常得不到充分熟制,给食品安全带来隐患。已经证明,受沙门氏菌污染的禽蛋, 普通熟制不能达到食品安全要求,因为热量传递需要时间,鸡蛋在沸水中煮~, 其内部温度仅为,这样的煮熟时间和温度不能杀死沙门氏菌【。目前,液态 蛋产品主要采用巴氏杀菌美国,?.中国,.。引,但温度和时间很难 控制,温度过低杀菌效果差,反之不但蛋白凝固,在热交换器表面形成粘膜堵塞管道, 而且还会严重影响液态蛋产品的起泡性等功能性质【】。 由于巴氏杀菌所带来的问题,液态蛋生产迫切需要一种新型的杀菌技术和工艺。 技术是对传统巴氏杀菌工艺的很好的替代和补充。目前,对在食品保藏中应用的研 究多集中在果蔬汁的杀菌上,对液态蛋等富含蛋白质食品的杀菌研究较少,且存在诸多 问题,如液态蛋具有粘度大、电导率高等不利于应用的特征,以及人们对对 蛋白质的影响和作用机理知之甚少等。 .材料与设备 ..菌种 单增性李斯特菌购于广东省微生物研究所菌种保藏中心;沙门氏菌、金黄色 葡萄球 菌、大肠杆菌为本实验室保存 ..主要仪器和设备 高速 高压脉冲电场设备美国俄亥俄州立大学;. 分散器德国&公司;.色差计上海精密科学仪器有限公司; .差示扫描量热仪英国 公司; 激光粒度分析仪 英国马尔文;扫描电子显微镜日本日立公司。 .实验方法 ..液态蛋的制备 新鲜鸡蛋购自本