有关抗原修复若干问题的探讨

有关抗原修复若干问的探讨 第lO卷第3期 2001年9月 中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESEJOURNALOFHISTOCHEM璃TRYANDCYTOCHEMISTRY VoIl0.NO.3 Sep.2OOl 有关抗原修复若干问题的探讨 蔡俊杰陈源赵菲陆药丹 (第一军医大学南方医院病理科,广州510515) 在免疫组织化学反应过程中,组织由于固定等 或者假性.为了解决 方面的问题常导致达不佳, 这些问题,需要做抗原修复.目前抗原修复的方法 较多.有真空负压抗原修复法,微波辐射抗原修复 法.高压抗原修复法,隔水热抗原修复法和电炉加 热抗原修复法.本文根据上述各种方法.在实际操 作中常可发生的一些问题如pH的应用范围的选 择;抗原修复最佳温度的选择;有效温度所需要持 续的时间;抗原修复液必须遵循自然降温的规律,否 则将达不到抗原修复的目的;尽量使用足量的抗原 修复液;切片必须附贴牢固等.并详细介绍了各种 方法的使用过程 在免疫组织化学方法过程中,常可碰到许多问 题,比如抗原表达不好,或者出现假阴性或者切片 显示的阳性物颜色深浅不一.这是因为组织经含甲 醛的固定液固定后,其醛键封闭了抗原的决定簇.或 者甲醛中的甲基封闭了抗原,或者甲醛与组织中的 蛋自发生交联,形成了醛交联蛋白.由于这些现象 的存在,严重地影响了抗原的表达.因此,要想获 得最佳的免疫组织化学显色效果,就必须解决上述 所出现的问题,解决的方法是:应用抗原修复 (Antigenretrieval,AR)法来重新暴露抗原.由于 AR法种类较多,方法各异,在操作过程中常可碰到 若干技术性的问题.下面将对常见的问题提出来进 行讨论. 材料和方法 1.材料:各种活检需做免疫组织化学的切片包 括:各种类型的癌,平滑肌瘤(肉瘤),横纹肌肉瘤, 各种类型的淋巴瘤,恶性神经鞘瘤,胶胶质瘤等. 2.所用的抗体 2.1单克隆抗体:CK(广普性)CK(低分子 量)EMA,CEA,LCA,L25,UcHI一1,CD34,CD30, C15,Mac387,NSE,Actin(S),ActintM),Desmin, Myoglobin,HMB45,F8.S一100,AFP.GFAP. PCNA.Er.Pr,CerbB一2. 2.2多克隆抗体{CgA,Syn,PSA,AAT, Iysoeme,Bel一2. 以上各种抗体及试剂盒均购于福州迈新生物技 术开发公司. 3.方法 3.1单纯化学AR法 这种方法操作比较简单,对某些较易修复的抗 原有效,对于某些较复杂的抗原,其效果不佳,如 和等.该法可用许多物质来对抗原进行修复. 有胰蛋白酶,胃蛋白酶,链霉蛋白酶,无花果蛋白 酶和菠萝蛋白酶等.最常用的是胰蛋白酶.虽然这 些物质用于AR操作简单,但效果不理想,而且很容 易导致切片的脱落,造成染色的失败. 3.2物理化学联台AR法 该法利用目前现有的仪器如微波炉.真空负压 干燥箱.高压锅.水浴锅,电炉等,应用AR液的联 合作用来完成,是目前最广泛使用和效果最好的方 法,根据本试验证明,它适台于临床目前常用的大 部分抗体,只要方法应用得当,就能获得最佳效果. 方法包括: 3.2.1真空负压AR法"].这是一种操作简 单,效果特佳,温度恒定,能一次性处理大量切片 的方法,切片脱蜡经阻断剂处理后.切片放^ 0.OIM柠檬酸缓冲液中(pH6.0),放^温度预先调 至95?的真空恒温干燥箱中处理10rain.该法的最 大特点有三,一是各物质的分子在失重的情况下四 处飘游,增加各分子问的碰撞机会i二是有恒定的 温度,既能使甲醛固定的蛋自发生变性,又不需要 AR液达到沸腾,不使切片因沸腾而容易离开载片. 第3期蔡俊杰等.有关抗原修复若干问题的探讨 保证了染色的成功率;三是不受条件限制,不管是 金属性的还是非金属性的.都可以进行操作. 3+2.2微波辐射AR法 该法在切片脱蜡后经甲醇双氧水的处理后,放 人AR液中.于微波炉内进行.利用微波每秒24亿 5千万次的快速运动产生瞬间热.当然如果仅靠微 波的辐射来达到修复抗原的目的,是远远不够的,还 必须靠热的作用因此.应用该法就必须靠其双重 的作用,微波使各分子作极性运动,促进抗原的修 复,产生的瞬间热,达到有效温度后,可导致经甲 醛固定后的蛋白变性.该法的特点有二.一是产热 迅速,容易引起AR液的沸腾;二是微波炉内不能使 用金属性的器皿. 3.2.3高压加热AR液 该法切片经脱蜡及双氧水处理后放人AR液 中,当加热到开锅后.加上高压阀,待喷出汽后维 持l,4分钟.这也是一种双重作用的方法,高压易 使蛋白变性.高压的温度一般在100?,120C间, 对于较难修复的抗原.应用该法可获得较好的结果. 3.2.4隔水热(水浴式)AR法 该法在切片经脱蜡及双氧水处理后,放人AR 液中,再放人盛有水的锅中加热,当锅中的水沸后. 用温度计测内中的AR液,当温度达到95C左右 时,维持40分钟左右. 3.2.5电炉加热AR法 当切片经脱蜡及双氧水处理后,将切片放人盛 有AR液的烧杯内,于电炉上加热,用温度计测其温 度,当达95?时关闭电源,当温度下降时,重开电 源,如此反复,维持10分钟. 结果 应用上述各种不同的方法处理的结果.阳性物 棕黄色,见于细胞核,细胞膜和细胞浆,背景清晰, 没有非特异性染色.应用LSAB法(S—P)法和EV 二步法均能获得满意的结果. 讨论 要做好临床病理诊断,就必须灵活应用免疫组 织化学技术,使之成为诊断的有力工具.要做好免 疫组织化学染色,就必须灵活地使用AR技术,因为 只有靠这项技术才能使各项免疫组织化学的表达活 龙活现地展示出来.在实际检测中,从目前临床常 用的三十几种抗体中.基本上都适合于AR.那么在 什么样的情况下需要做AR?如何做好AR?做AR 时需要注意什么样的问题? 在临床活检中.组织块经甲醛固定后.由于甲 醛的作用,产生了对免疫组织化学反应不利的副作 用,如醛链封闭抗原的决定簇,甲基封闭抗原,发 生醛交联蛋白等.在免疫组织化学反应时.如果对 上述问题不进行处理.将难获得理想的结果.因此. 从目前的情况看,凡做免疫组织化学的,最好都做 AR,除极个别特殊者外.做AR时要根据不同的种 类和方法.认真细心地进行操作.操作时必须注意 以下问题: 1.pH值的应用范围及选择 但至目前为止,被 应用于抗原修复的物质很多, 大家公认的AR液为柠檬酸盐缓冲液pH6.0最好, 根据实验表明,它适合于大多数的抗原,经它处理 后许多抗原表达增强,效果理想.最近也有报道用 pH8.0来进行AR,在碱性的范围内结果也很理想. 2.AR时选择最佳温度 据Mason等研究表明:70C,90C对没有固 定的蛋白可发生变性,但对经福尔马林固定后的组 织要获得更好的检测结果,就必须使用适当的高温. 根据我们的实验,物理化学联合AR的最合适温度 在92C,98c,尤其是恒定95C.这是因为:?这 种温度未达沸腾,不容易导致切片脱离载片;?能 够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等;?处理时 间可以随意选择与确定. 3.AR时有效温度所需持续的时闻 根据各单位的设备条件以及使用的仪器不同, AR时在有效的温度范围内所持续的时问也不一 样.例如:真空负压AR法,当达到预定的温度和负 压后,可持续5,10rain.微波AR法温度不好控制. AR液容易沸腾,如果切片附贴牢固,任凭其沸腾达 5,10rain,如果切片为排出物,血凝块等组织,由 于组织的问题,切片较容易脱离载片,尤其在沸腾 的AR液中,因此,一经发现AR液沸腾.即可关掉 电源,待温度下降,又可重开电源.如此反复达5, 10rain.应用高压AR法,当发现AR液沸腾后.加 上压力阀,出现喷气后,持续时间达2,4rain.隔 水热AR法,要特别注意内外液体的温度,内指AR 中屋组织化学与细胞化学杂志第l0卷 如果需要可用温度计 液.外指浸泡AR液容器的水, 测之,使之保持在有效温度的范围内.该法较常用 于检测和Pf的切片的处理,持续时间应达40 min.电炉加热AR法,是在投有上述方法的情况下 使用,根据实验证明,该法为所有方法中最差的一 种,若无其它方法,方可用之,持续时间在5,10 111113.. 4.AR液必须遵循自然降温的规律,否则将达 不到AR的目的 AR持续时间过后,取出放于室温中让其慢慢 降温,决不能为了争取时间,强行用冷水将其降温. 这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的 束缚,自然放松.随着温度的降低而慢慢地恢复原 来的构型.如果用物理降温,松开后的蛋白分子链 突遇降温而固定下来.恢复不了原有的构型,达不 到预想的效果. 5.尽量使用足量的AR液 AR液的用量应根据不同的方法和不同的切片 而有所不同,载玻片裱的切片.用液量较大可在250 , 500ml,或者5..,1000ml,应用大量的AR液, 当用微波AR时,由于AR液量大,延缓了液体的沸 腾时间,增加了切片受微波辐射的量,当染色有好 处.应用盖玻片裱切片时.AR液的量可以较少,在 lO0,200ml的范围.当然量大一些也适合.切片修 复时,切片一定要完全浸在AR液中,不能让其露在 外面.否则抗原将遭受不可逆的破坏.应特别注意 的是,微波AR时,液体容易沸腾,如果使用的容量 过小,液体易被蒸发.甚至可至干涸,如此将会使 AR失败. 6.切片必须附贴牢固 用于AR的切片,必须附贴牢固,否则会使切片 脱离载片,造成AR的失败. ?切片的烘烤时同根据实验,切片的烘烤时 间于60C的烤箱中烘烤2小时以上,这对于抗原是 投有什么损害的. ?载玻片必须用玻璃洗液浸泡过.洗干净后烤 干,上胶,最好用多聚赖氨酸或3一氨丙基一三乙氧基 硅烷(3一AminopropylTriethoxy—Silane)处理10 rain后.经丙酮洗两次后风干即可,经反复使用证 明,该试剂处理切片.微波AR连续煮沸5min以上 均不掉片. 收稿2001—03修日2001—06 参考文献 1蔡俊杰.邱红明.真空负压微波辐射和电炉三种不同处 理方法对抗原修复的比较研究.中国组织化学与细胞化 学杂志.1999;8(1):91—92 2MasonJT-OlearyTJ.Effectsofformaldehydefixation 0protei~sec0ndarystructure:acalorimetricandln— fraredspectroscopicinvestigation.JHistoehemCy— tochem1991I39{225