逆转录聚合酶链式反应检测胎盘多药赖药基因与胎盘胆汁酸排泌的相关性

逆转录聚合酶链式反应检测胎盘多药赖药基因与胎盘胆汁酸排泌的相关性 逆转录聚合酶链式反应检测胎盘多药赖药 基因与胎盘胆汁酸排泌的相关性 ? 812?匹酉医至Q!Q至篁卷第8期JiangxiMedica1Joumal,Aug2010.vo1.45.No.8 逆转录聚合酶链式反应检测胎盘多药赖药 基因与胎盘胆汁酸排泌的相关性 陈新萍 【摘要】目的探讨胎盘多药赖药(MDR3)基因与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)胎盘胆汁酸排泌的相关性.方法收集妊娠晚 期ICP患者(ICP组)和正常晚孕妇女(对照组)各3O例,分别采集母体静脉血和新生儿脐静脉血及胎盘组织.采用放射免疫分 析方法检测母血及脐血中的甘胆酸(CG)含量;采用逆转录聚合酶链式反应法(RT—PCR)测定两组胎盘组织中多药赖药基因 mRNA的相对达量.结果(1)ICP组母血,脐血中CG水平均高于对照组(28.86+8.51vs2.70~2.19;19.97~8.8Ovs5.83~5.06g/ m1),以上差异均有统计学意义(P<0.001);ICP组母血CG含量高于脐血中的含量,两者之间存在正相关(r=O.588):对照组脐血 CG含量高于母血中的含量,两者之间无直线关系(r=0.212).(2)两组胎盘组织中均检测到MDR3基因的mRNA,与对照组相 比,ICP组胎盘组织中MDR3基因的mRNA水平下降(3.33+1.03vs6.85~1.26),差异有统计学意义(P<O.001);且MDR3一mRNA 相对量与脐血甘胆酸和母血甘胆酸水平呈负相关性(r==一0.627;r=-0.795).结论MDR3基因可能参与了胎盘胆汁酸的排泌. 【关键词】妊娠期肝内胆汁淤积症;甘胆酸;多药赖药基因(MDR3);逆转录聚合酶链反应(RT—PCR);放射免疫分析法 『中图分类号1R714.255 MDR3fABCB4)~[]定位于染色体7q21.1.编码 产物即MDR3蛋白.又名多药耐药蛋白.属于P型 糖蛋白(P—gp)超基因家族.主要分布于肝脏毛细胆 管膜.是肝脏毛细胆管膜磷脂输出泵,能有效地转运 磷脂进人毛细胆管.在毛细胆管内胆盐与磷脂可形 成微胶粒,从而保护胆管细胞免受胆盐损伤【1].肝细 胞具有膜极性.由生化结构和生物功能均不同的基 底膜(血窦面)和毛细胆管膜(肝内胆管面)组成,而 胎盘合体滋养细胞也和肝细胞有着相似的结构.基 底膜(胎儿面)和游离缘(母体面)质膜,是否在胎盘 组织上也存在着MDR3基因及其编码的蛋白.是否 影响胎盘胆汁酸的排泌?本研究观察了MDR3基因 在ICP和正常晚孕妇女的胎盘组织上的表达情况. 并进行了比较.旨在从基因水平阐述ICP胎盘胆汁 酸排泌异常机制.为ICP的防治提供新的思路. 1资料与方法 1.1研究对象及分组收集2008年9月,2009年 6月在南昌大学第一附属医院因胎位异常或社会因 素行剖宫产的足月妊娠妇女30例为对照组.年龄在 20,38岁,无高血压,糖尿病,心脏病和肝肾疾病史, 无其他妊娠合并症和并发症.未进入产程.终止妊娠 时间为38,41周:同期诊断ICP并因ICP行剖宫产 的晚孕妇女30例为观察组.年龄为2236岁.ICP 诊断参考1992年曹泽毅主编的《中华妇产科 学》第二版圆. 】.2方法 作者单位:330006南昌,南昌大学第一附属医院妇产科 1.2.1标本收集血标本的收集:(1)剖宫产术前抽 取两组孕妇空腹肘静脉血3ml置于干燥管.送同位 素室,置于28~C低温冰箱保存统一待测;(2)新生 儿断脐后.采集脐静脉血2ml置于干燥管.送同位素 室,置于2,8?低温冰箱保存统一待测.胎盘组织的 收集:胎盘娩出后10min内.避开蜕膜和胎膜组织. 取脐带对侧,母体面胎盘各lxlxleIn.一块生理盐水 洗涤后置一80~(2保存 1.2.2孕妇肘静脉血与胎儿脐静脉血甘胆酸的测定 正常人空腹血清甘胆酸(CG)含量为1.14+0.57g/ TIll,最大允许值为2.70Ixg/ml.应用竞争性放射免疫 分析法对以上血标本进行检测.记录结果 1.2-3胎盘组织MDR3mRNA测定RT—PCR法(逆 转录聚合酶链式反应法)RT—PCR引物和内参:采 用引物软件Oligo6.0设计引物.以IS—aetin作为 内参.MDR3:目的基因片段长度312bp.上游引物: 5.一CTGCTGGAAAGATrGCAACAG一3.下游弓I 物:5,一GAGCAAATGAACTCGCATGTC一3,内 参IS—aetin长度:521bp.上游:5,一CACACTGTG CCCATCTACGA一3.下游:5,一TCAGGAGGA GCAATGATCTTG一3,DL一2000:DNAMarker胎盘 组织总RNA的提取,逆转录及扩增:用BIOZOL溶 液提取胎盘组织RNA.将RNA逆转录为eDNA并 进行扩增.反应结束后.取3-5IxlPCR产物进行琼 脂糖凝胶电泳.确认PCR反应产物.结果显示扩增 片段在312bp位置,以B—aetin作为内参照,采用面 积光密度值半定量分析测定胎盘组织中ABCB4一 mRNA灰度值,与相应的B—aetin灰度值相比,得出 江西医药2010年8月第45卷第8期Jiant~xiMedicaljournal,Aug2010,Vo1.,:墨 MDR3mRNA相对量. 1_3统计学方法实验数据以均数?标准差()表 示数据输入SPSS12.0版统计软件,计量资料两组 比较,用t或t'检验,计数资料用x检验. 2结果 2.1母血,脐血甘胆酸水平比较ICP组母血血清 CG(26.86_+8.51)I~g/ml,与对照组(2.70?2.19)txg/ml 相比有显着性差异(P<O.O01).ICP组中脐血CG(19.97+ 8.80)~g/ml,与对照组(5.83_+5.06)Ixg/ml相比有显着 性差异(P<0.001).见表1.ICP组母血与脐血血清甘 胆酸水平呈正相关(r=0.588).对照组母血与脐血血 清甘胆酸水平无直线相关关系(r=0.212).见附表. 2.2胎盘组织MDR3一mRNA检测及比较在ICP组 及正常晚孕组胎盘组织中均检测到MDR3一mRNA. ICP组胎盘MDR3一mRNA相对量为3.33_+1.03.正常 妊娠组为6.85+1.26.两者相比,ICP组胎盘组织中 MDR3-mRNA的水平下降.有极显着意义(<0.001). MDR3一mRNA相对量与脐血甘胆酸和母血甘胆酸 均成负相关(r=-O.795,r=一0.627). 3讨论 3.1ICP胎盘胆汁酸排泌功能下降妊娠状态下胆 汁酸的代谢包括:母体,胎儿体内的胆汁酸的合成, 生物转化,代谢以及母胎间胆汁酸经胎盘的转运. 生理状态下胆汁酸在人体肝脏胆酸的代谢途径为: f1)胆汁酸的各种成分通过肝窦基侧膜上的转运器 由肝血窦摄人肝细胞;(2)在肝细胞内与蛋白结合, 以囊泡形式转运至毛细胆管膜上;(3)经毛细胆管膜 上的转运器运送至毛细胆管.毛细胆管膜的转运器 包括:(1)胆盐输出泵(BSEP),其作用是存在于毛细 胆管膜的ATP依赖性胆盐转运器.能以ATP依赖 方式转运各种结合型胆盐.(2)多药耐药蛋白一3 (MDR3P—gP),其作用为能有效地转运磷脂进入毛 细胆管.(3)多药耐药相关蛋白(MRP2),其作用为多 特异的有机阴离子转运器.在ATP介导下能转运多 种有机阴离子结合物.有利于胆盐非依赖的胆汁转 运. 从妊娠12周起.胎儿肝脏就开始合成胆汁酸 『3】 .妊娠16周以后胎儿胆汁酸浓度明显增加.而胎 儿的肝脏分泌途径尚不成熟以及多数肝肠转运系统 在新生儿近娩出或出生后才表达.只有少部分的 胆汁酸通过胎儿'肾脏排泄至羊水中圄.为了避免胆 汁酸在体内的蓄积,胎儿内源性胆汁酸从其肝细胞 排泌至血液循环系统后.必须通过胎盘转向母体.由 附表母血,脐血甘胆酸水平比较 ? 8l3? 母体的肝肠循环及肾脏排出.而母胎间胆汁酸经胎 盘的转运是妊娠期胆汁酸代谢的关键.足月妊娠时 胎盘屏障只有一层合体滋养层.滋养层细胞朝向母 体血液侧,具有微绒毛结构的细胞膜(母体面),7】和 朝向胎儿侧的基底膜(胎儿面)[81均存在胆汁酸转运 载体.是构成胎盘屏障的关键结构. 生理妊娠情况下.胎儿胆汁酸水平高于母血中 的水平[9Ilq.母胎间的胆汁酸浓度差有利于胎儿胆汁 酸通过胎盘由母体排泄.使母胎胆汁酸处于动态平 衡.ICP时,由于母体胆汁淤积,母体肝细胞内的胆 汁酸蓄积并逆流人体循环.母血胆汁酸水平升高.使 得母胎间的胆汁酸浓度梯度不存在.胎盘的胆汁酸 转运系统可能同时收到损害.导致胎儿方向胆汁酸 的排泌受阻.导致胎儿胆汁酸淤积.本研究结果表 明ICP组母血及脐血胆汁酸水平均明显升高.且呈 正相关. 3.2MDR3的ICP胎盘表达特点及其与ICP胎盘胆 汁酸转运功能受损的关系在本实验中.我们发现 影响胆汁酸代谢的三种基因之一ABCB4基因在胎 盘组织中有着一定的表达.与正常组相比,ICP组 MDR3蛋白和mRNA较正常晚孕组的表达明显下 降.并且MDR3一mRNA与脐血和母血甘胆酸呈负相 关性.从而推断ICP胎盘MDR3一mRNA表达下降可 能影响胎盘排泌功能. 参考文献 【1】LinekeCR,SmintJJ,vanderVelde—KoertsT,eta1.Structureofthe humanMDR3geneandphysicalmappingofthehumanMDRlocus. JBiolChem.1991,266(8):5303 『21戴钟英.妊娠期肝内胆汁淤积症.见:曹泽毅主编.中华妇产科学.第 2版.北京:人民卫生出版社.2004.468 【3】C~omoC,ZulianiG,RonchiM,eta1.Biliarybileacidcompositionof thehumanfetusinearlygestation.PediatrRes,1987,21(2):197 [4】SuchyFJ,BueuvalasJC,NovakDA.Determinantsofbileformation duringdevelopment:Ontogenyofhepaticbileacidmetabolismand transport.SeminLiverDis,1987,7q,2):77 [5】NakagawaM,SetcheUKD.Bileacidmetabolisminearlylife:Studies ofanmiotiefluid.JLipidRes,1990,31(6):1089 【6】MarinJJG,SerranoMA,E1-MirMY,ElenoN,aoyaCA.Bileacid transportbybasalmembranevesiclesofhumanterraplacentaltro. phoblast.Gastroenterology,1990,99(5):1431 ? 814?江西医药2010年8月第45卷第8期 Jiang)(iMedicalJoumaI.Aug2010.Vo1.45.N0.8 子宫切口妊娠临床治疗分析 易韵涂灵 【摘要]目的探讨剖宫产术后子宫切口妊娠的临床表现及治疗方法.方法回顾性分 析江西省妇幼保健院2009年1月, 2010年5月收治的子宫下段剖宫产后子宫切口妊娠共60例患者的临床资料结果 32例患者行子宫动脉栓塞+腹部B超引导 下清官术.15例患者行Mrx+腹部B超引导下清宫术.6例患者行阴道B超引导下 抽吸减胎术+局部MTX注射术.5例患者直 接B超下清宫,1例患者病灶切除+子宫修补,1例患者行全子宫切除.所有病例均好 转或痊愈出院.结论随着对切口妊娠的认 识及超声技术的飞速发展,切口妊娠可以得到早期诊断:子宫动脉栓塞介入治疗明 显降低了其并发症的发生. 【关键词】切口妊娠;治疗方法;剖宫产 【中图分类号】R714.22 剖宫产后子宫切13妊娠(CSP)指胚胎着床于剖 宫产手术后子宫切13瘢痕处.是少见的异位妊娠.随 着剖宫产率的增加,CSP的发生率也相应呈上升趋 势.它是剖宫产的远期并发症之一.本病早期诊断 较困难.常被误诊为宫内早孕或流产,盲目行药物流 产,人工流产术,常造成术中大出血,子宫穿孔,甚至 导致子宫切除危及患者生命.本研究旨在对江西省 妇幼保健院2009年1月,2010年5月收治的子宫 下段剖宫产后子宫切口妊娠共6O例患者的临床资 料进行回顾性分析.对切口妊娠的发病机理以及临 床处理中出现的问题等进行探讨.以提高临床医师 对CSP的认识和诊治水平. 1资料与方法 1.1一般资料2009年1月2010年5月.江西省 妇幼保健院共收治子宫下段剖宫产后子宫切口妊娠 患者60例.年龄21,42岁,平均年龄(31.80+6.O1) 岁.其中1次剖宫产史者52例.2次剖宫产史者7 例.3次以上剖宫产史者1例.剖宫产方式均为子宫 下段横切口距前次剖宫产的时间最短6个月.最 长17年,平均(4.42~2.40)年.其中49例在前次剖 宫产后5年内发生切El妊娠,占81.7%:距前次剖宫 产时间大于5年者11例,占18.3%.住院时间最短 2d,最长52d,平均(13.8~10.3o)a. 1.2临床表现多数患者因停经后阴道不规则出血 来院就诊.其中3例伴有下腹疼痛不适.停经时间 为40,79d,平均56d.22例在外院误诊为早孕,先兆 流产或难免流产.行清官术后阴道不规则出血.来院 后行阴式彩色B超检查见子宫下段切口处杂乱回 声光团,提示子宫切口妊娠:8例外院药流或清宫时 发生大出血来院,其中5例发生失血性休克. 1-3辅助检查60例患者均行阴道彩色B超检查. 其中41例子宫下段切口处见不均质团块提示子宫 切13妊娠.12例在子宫切口处见孕囊明确诊断为子 宫切口妊娠:人院前误诊为宫颈妊娠1例,宫内残留 6例.人院后通过全面检查,结合病史再次行彩色阴 道超声检查.发现剖宫产切口处见不均质团块考虑 切口妊娠.大部分患者可见丰富血流,患者血B— HCG值为298,71808miu/ml 1.4统计学处理数据经SPSS13.0统计软件包处 理.平均数采用(~一----.S)表示,组间差异采用校正t检 验.P<0.05有统计学意义. 2结果 根据病史,阴道彩超与血B—HCG明确诊断为 子宫切口妊娠后.32例患者行双侧子宫动脉栓塞术 治疗.具体方法:右股动脉穿刺成功后,置5F导管 经左髂总入髂内进入子宫动脉.推注MTX50mg, 头孢孟多酯2.Og,明胶海绵1.5g栓塞.48h后行腹部 B超引导下清宫术.术中出血少.但有1例因腹部B 作者单位:330006南昌,南昌大学研究生院医学部2008级(易韵);江西省妇幼保健 院生殖健康科(涂灵) '通讯作者 [7]BrizO,SerranoMA,MaciasRI,Gonzalez-GallegoJ,MarinJJG.Roleof Cand organicanion—transportingpolypeptides,OATP-A,OATP— OATP—-8inthehumanplacenta—-maternallivertandemexcretory pathwayforfoetalbilirubin.BiochemJ,2003,371(3):897 【8】DumaswalaR,SetehellKD,MoyerMS,eta1.Ananionexchangerme— diatesbileacidtransportacrosstheplacentalmicrovillousmembrane. AmJPhysiol,1993,264(6):G1016 [9】ColomboC,RodaA,RodaE,eta1.Correlationbetweenfetalandma— temalserumbileacidconcentrations.PediatrRes,1995,38(2):227 [10]MomeMJ,Rodriguez-BravoT,MaciasRI,eta1.Relationshipbetween bileacidtransplacentalgradientsandtransportacrossthefetal—-fac-- ingplasmamembraneofthehumantrophoblast.PediatrRes,1995,38 (2):156 (收稿日期2010—07—23)