【doc】 六神丸对鼠S180生长的抑制作用与抑制血管生成的关系

【doc】 六神丸对鼠S180生长的抑制作用与抑制血管生成的关系 六神丸对鼠S180生长的抑制作用与抑制血 管生成的关系 中国预防医学杂志2005年8月第6卷第4期ChinPreyMed,August2005,Vo1.6No.4 六神丸对鼠Sis0生长的抑制作用 与抑制血管生成的关系 张春荣,姜伟,齐元富 【论着】 【摘要】目的探讨六神丸对肿瘤血管形成抑制作用.方法通过建立动物肿瘤模型,运用六神丸实验治疗, 检测其抑瘤率和肿瘤内血管密度,以及瘤体VECF达的改变.结果六神丸具有明显的抑制S.80肉瘤生长作用.实 验组的S,s0瘤体内微血管密度均明显低于对照组,免疫组化显示六神丸大,中剂量组均可下调S.80瘤体内VEGF的表 达.结论六神丸对肿瘤血管形成均有明显抑制作用,降低VEGF的表达可能是其抑制肿瘤血管形成的主要机制 之一. 【关键词】中成药,六神丸;微血管密度;血管内皮生长因子 EffectofLiushenPillOnGrowthInhibitionandTllmorAn#ogensisinMAces l舳ZHANGChwn—rong,JL4NGWei,Yuan 一 . Departmemofb~ernalMedicine,Shandong切? CompanyHospital,Shandong255069,Ctfina 【Abstract】 ObjectiveTostudythemechanisnlofLiushenpillininhibitingtheangiogenesisoftumor.MethordsThetu. nlori~fibitoryrateandthevasculardensityweretestedinanimaltumormodelbyexperinaentaltreatment.TileexpressionofVEGFwere n~asuredbyimmuno—tfistochemistry.ResultsLiuslienpilltmsinhibitoryeffectonS180sarcomawtfichwaslowertitanthecontrol group.TileexpressionofVEGFweredownregulatedwhenthelowerandtfighwereused.OmdusionLiuslienpillhasinhibitoryef- fectsonangiogenesisoftumor.ReducingtheexpressionofVEGFarefileimportantmeetmnismsofLiushenpillinintfibifingtheangiogen- esisoftumor. 【Keywords】 Ctfinesepatentmedicine;Liushenpill;Miemvessetdensity(MVD):Vascularendothelialgrowthfactor (VEGr) 肿瘤转移是肿瘤恶性行为的特征表现,亦是临床 治疗失败的主要原因.新生血管生成是肿瘤生长和转 移的必要条件之一,寻找新的高效低毒血管生成抑制 剂已经成为当前抗转移药物研究的热点,而中药治疗 肿瘤具有很大的潜力.六神丸具有明显的抗肿瘤活 性,但是否具有抗肿瘤血管生成的作用,目前未见有 关报道.我们就此进行了研究. 1材料和方法 1.1实验动物及瘤株 实验选用昆明种小鼠,雄性,50只,分5组. 体重(20?2)g,山东中医药大学动物中心提供.小 鼠肉瘤S80山东中医药大学肿瘤实验室提供. 1.2药品 六神丸:雷允上药业有限公司苏州雷允上制药厂 出品,产品批号040508,规格30粒/瓶(每1000粒 重3.125g).配制浓度为5粒/rnl. 顺铂(DDP):由济南齐鲁制药厂生产,批号: 作者单位:1.山东铝业公司医院肿瘤科,山东255069;2.山东 省中医院 040203,规格:20m支.配制成2mg/kg溶液. 1.3方法 1.3.1瘤鼠模型的建立:小鼠肉瘤Sl8o瘤株,腹腔 传代接种.待腹水生长良好时,抽出腹水,细胞计 数,调整细胞浓度为2×107个细胞/ml,在小鼠腋下 皮下注射Sl80肉瘤细胞,每只接种0.2ml,于第lI 天观察局部肿瘤生长情况. 1.3.2治疗及分组:5O只小鼠于接种当天随机分为 5组.六神丸小剂量组(简称六小组):灌服六神丸 溶液0.4ml/只,1次/d.六神丸大剂量组(简称六 大组):灌服六神丸溶液0.6ml/只,1次/d.DDP 组:按照1mg/kg体重隔日1次腹腔注射DDP0.2 ml/只,共2次.DDP+六神小组:中药灌服方法同 六神小组.对照组:灌服生理盐水0.4ml/只,1次/ d.用药10d,末次灌胃后60rain,处死各组小鼠, 剥取瘤块,称重,瘤块作病理组织切片.按公式计算 抑瘤率:抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤 重)寸照组平均瘤重×100%. 1.3.3微血管染色:免疫组化SABC法染色血管, 即用型微血管染色试剂盒(CD31)为武汉博士德生 物公司产品.小,大剂量六神丸组:DDP+六小组; ? 328?中国预防医学杂志2005年8月第6卷第4期 ChinPTevMed,August2005,Vo1.6No.4 DDP组;各组和对照组瘤体剥离后,切取标本,固 定,包埋,切片.经染色后的切片,内皮细胞褐染, 血管呈黄褐色,易于辨认. MVD的测定:MVD按照Weidner等…的方法及 判断进行,计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血 管,即在低倍镜视野下扫视整个肿瘤组织切片,选择 最密集的微血管标记区,凡呈现黄褐色标记清晰的单 个内皮细胞或内皮细胞串均作为一个可计数的微血 管,有较厚肌壁的大血管及管腔面积大于8个红细胞 直径的血管不计数.计数方法:先在低倍镜(10× l0)视野下扫视整个组织切片,在肿瘤浸润区选择最 密集的3个微血管标记区视野,即所谓的”新生血 管热点区”,然后在相同的背底,背体条件下,以高 倍镜(2o×20)视野(0.72mm2)为标准计数所有染 色的微血管数,取其平均值作为该样本的测定值. 1.3.4VEGF免疫组化:VEGF免疫组化检测试剂盒 (即用型)购自武汉博士德生物公司,光学显微镜下 观察:VEGF阳性染色以肿瘤细胞及其附近的血管内 皮细胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达.然后每 张染色切片通过MPIAS一1000高清晰度彩色病理图 像分析系统进行吸光度(面密度)和强度(灰度) 测定. 1.3.5统计方法:运用SPSS统计软件,采用q检 验.P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1一般情况比较 与正常小鼠比较,荷瘤鼠各组均逐渐出现毛发稀 疏,聚集,不活泼,行动迟缓和进食减少等现象.以 六小组表现最轻,六大组,六小组+DDP组表现介 于中间,DDP组和对照组小鼠表现最差. 2.2小鼠的体重变化 与空白组比较,各处理组较接种前体重增加情 况:以六小组增加最多,与空白组之间差异无统计学 意义,六大组与对照组差异无统计学意义,但优于 DDP组,DDP组单用优于六小组+DDP组,表明小 剂量六神丸溶液有改善一般状况,增加荷瘤鼠体重的 作用,大剂量六神丸溶液或与DDP联用则表现出明 显的毒副作用. 2.3SI踟各组小鼠移植瘤重变化比较 瘤重的变化:各治疗组瘤重均显着低于对照组, 与对照组比较,六小组,六大组,DDP组,六小组 +DDP组,差异有统计学意义(P<0.01),实验结 果表明六神丸溶液对s?移植瘤有明显抑制作用,六 大组抑瘤率>30%,优于六小组,六神丸溶液与DDP 合用有明显增效作用,见表1. 表1六神丸对S1鲫肉瘤的抑制作用(元?s,%) 注:q检验,与DDP组比,P<O.05. 2.4六神丸对S.80瘤体微血管密度的影响 各组肿瘤病理标本经CD31染色,肿瘤组织间质 血管均有着色,以内皮细胞被染成黄褐色为阳性表 达,微血管的大小,形态差异较大,有的仅为单个内 皮细胞和内皮细胞族,有的管腔不明显或形态不规 则,肿瘤边缘组织的MVD高于中央.对照组肿瘤内 见大量的新生毛细胞血管,阳性目标为位于肿瘤组织 及间质成片状或团块状分布的黄褐色颗粒,各用药组 阳性表达细胞颗粒减少,见表2. 表2Slso肿瘤组织平均微血管密度(?s) 注:q检验,与生理盐水比,P<O.05,P<O.01;与DDP组 比一P<0.01. 2.5六神丸对小鼠Sl80肉瘤组织VEGF表达的影响 免疫组化结果显示,光学显微镜下观察对照组肿 瘤组织及其间质见大量呈片状或团块状分布的棕黄色 颗粒,各用药组阳性表达细胞明显减少.对VEGF表 达平均面积密度和平均灰度结果见表3. 表3Slso肿瘤组织VEGF表达平均密度和平均灰度(元4-s) 注:q检验,与生理盐水组,P<O.01;与DDP组比 P<0.05..P<0.01. 中国预防医学杂志2005年8月第6卷第4期 ChinPrevMed,August2005,Vo1.6No.4 3讨论 3.1肿瘤血管生成和六神丸的作用 侵袭性生长和转移潜能是恶性肿瘤的基本特征, 也是恶性肿瘤患者致死的主要原因,有确切证据表 明,90%以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移和复 发,而且转移通常早期发生,在临床诊断出原发瘤时 约50%的患者已产生远处转移…1.对于快速增殖, 极少凋亡,多灶性分布,异质性生长的转移瘤,目前 的手术,放疗,化疗等常规治疗手段常遭失败,最终 患者死亡.转移实乃恶性肿瘤顽固性和难治性的根本 原因.研究表明:在实体瘤的生长,浸润和转移中, 持续的血管生成是一个关键因素.当瘤细胞分裂增值 到一定的体积时(一般不超过1,2nml2),如果仍无 血管长入提供必须的营养物质和氧以及增殖所需要的 各种因子,其死亡的细胞数和增生的细胞数大致相 等,瘤细胞团停止扩张达到相对稳定的状态.当肿瘤 诱发宿主为血管增殖,一些新生血管长入肿瘤组织 后,肿瘤细胞群迅速增加,体积增大,向周围组织浸 润,并具有转移倾向. 本实验结果,用六神丸治疗组MVD,VEGF与对 照组比均明显降低,特别是4,~tl量六神丸与顺铂联合 治疗组MVD,VEGF值降低更明显,这表明六神丸和 顺铂都可能通过抑制VEGF而阻止肿瘤组织血管增 生,发挥抗癌疗效,在此机制中,而药起协同作用, 提高了抗癌效果. 3.2六神丸治疗肿瘤的机制分析 六神丸的组成及方药分析:方剂组成有人工牛 黄,珍珠(豆腐制),麝香,冰片,蟾酥,雄黄 (飞).方药分析:牛黄,麝香为君,牛黄清热解毒, 豁痰开窍,以解恶性肿瘤之痰凝,瘀血和癌毒,伍以 蟾酥,珍珠,雄黄,以加强解毒之力.麝香活血散 结,伍以冰片,雄黄加强了散结作用;牛黄,雄黄长 于化痰;麝香,冰片,珍珠能开窍醒神而辟秽浊,预 防减轻或延缓肿瘤患者恶病质得出现.六味药物均能 主治一切恶疮,痈疽.尤其蟾酥,雄黄,此二味药物 目前研究证明抗肿瘤作用明显,机理为诱导细胞凋 亡,诱导细胞分化,抑制核酸合成,作为血管内皮细 胞抑制剂和直接细胞毒作用,抑制肿瘤血管生 成L?引,还可以提高细胞免疫功能[?引.总之,六神 丸具有清热解毒,化痰散结,疗痈除疮,芳香辟秽, 止痛之功效,按”以毒攻毒”的原则,是治肿瘤之当 选.关于六神丸抗肿瘤作用的机制,包括三个方面, 一 是直接抑制肿瘤细胞的生长;二是提高机体的抗肿 瘤的免疫;三是抑制肿瘤血管生成.有文献报道用六 神丸治疗白血病,上消化道晚期肿瘤,脘部痞块,脘 腹胀满,均有一定的疗效J. 3.3实验研究结果分析 3.3.1瘤重的变化:各治疗组瘤重均显着低于对照 组,与对照组比较,六小组,六大组,DDP组,六 小组+DDP组,差异均有统计学意义,P<0.01.实 验结果表明六神丸溶液对Sl80移植瘤有明显抑制作 用,六大组抑瘤率>30%,优于六小组,六神丸溶液 与DDP合用有明显增效作用. 3.3.2免疫组化方法测定肿瘤组织及其间质MVD: 结果显示,对照组比其他各组,S80小鼠肿瘤及问质 微血管密度(MVD)均高,各用药组MVD值均显着 低于对照组P<0.01,以六小+DDP组抑制作用最明 显,与DDP组比,六大组,六小+DDP组MVD值显 着低于DDP组,P<0.O1.实验表明:六神丸能明显 抑制肿瘤血管生长,减少肿瘤组织及间质微血管密 度,从而切断肿瘤营养来源和转移途径,抑制肿瘤细 胞的生长和转移. 3.3.3对血管内皮生长因子VEGF表达的影响: VEGF是一种特异的血管内皮细胞刺激因子,可与血 管内皮细胞相应受体结合,刺激血管内皮细胞增殖, 促进血管生成,同时还可增强血管通透性,为血管内 皮细胞迁移及肿瘤细胞转移提供基础】.研究表明, 多数肿瘤细胞都表达高水平的VEGF,抑制VEGF可 有效抑制肿瘤的生长及转移【引.结果显示:S80肿瘤 组织VEGF表达平均面密度和平均灰度均较高,各用 药组阳性细胞面密度值,平均灰度值均显着低于对照 组,P<0.01;各组与DDP组比,六大组,六小+ DDP组显着低于DDP组,P<0.05,P<0.01.结果 表明:六大组,六小组,DDP组均能显着减少肿瘤 细胞VEGF表达,以六大组抑制作用明显,六小与 DDP合用,抑制VEGF表达作用明显增强.本研究结 果表明用药组均能降低VEGF的表达水平,抑制其刺 激内皮细胞增殖,从而达到抑制肿瘤血管形成,防止 肿瘤细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织 基质扩散,是其发挥抗肿瘤,抗转移作用的重要机制 之一. 综上所述,实验研究证实,六神丸具有显着的抗 肿瘤,其作用可通过多途径,多机制实验.本研究结 果证实,六神丸抗肿瘤生长和转移的作用与其抑制肿 瘤血管生成,降低肿瘤MVD,切断肿瘤营养来源和 转移途径,密切相关,其确切机制很可能是通过抑制 VEGF的表达来实现的.以上研究为六神丸的临床应 用提供了可靠的临床实验依据. 参考文献 [1]WeidnerN,SempleJP,WelchWR.eta1.Tumorangiogene~isand . 330?中国预防医学杂志2005年8月第6卷第4期ChinPrevMed,August2005,Vo1.6No.4 4406名高考学生HBsAg和ALT检测结果调查分析 王玉明 为了解曲沃县高考学生HBsAg携带和ALT异常情况,我 们对1999—2003年参加高考的44O6名学生(18,22岁)血清 中HBsAg和ALT进行了检则和分析,并提出了对策,现将结 果报告如下. 1材料和方法 试剂由山东3v集团公司提供,HBsAg检测用ELISA法, 仪器用第四军医大学和国营华东电子管厂联合研制的酶联免 疫检测仪BD3022型.ALT检测用改良赖氏法(>25U者为异 常).统计学方法用检验.P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 对44O6例HBsAg检测阳性率和ALT异常率:不同年份检 测结果.见表1. 表11999—2003年曲沃县对44O6例 HBsAg和ALT检测结果 在44O6例中HBsAg携带(阳性)率男性为8.66%(196/ 2264),女性为4.30%(92/2142);城区学生为5.37%(81/ 1507),农村学生为7.14%(207/2899);应届毕业生为6.92% (266/3844),往届毕业生为3.91%(22/562).ALT异常率,男 性为2.3_4%(53/2264),女性为0.70%(15/2142). 作者单位:曲沃县疾病预防控制中心,山西043400 【临床报道】 3讨论 (1)由表1可见:连续5年44O6名高考学生中:HBsAg 携带率为6.54%,呈逐年下降趋势,差异有统计学意义 (=12.16,P<0.05),说明曲沃县已采取了有效措施ALT 的异常率为1.54%,可由多种原因导致,但5年间,差异无 统计学意义(Y=1.08,P>0.05). (2)在性别上HBsAg的阳性率,男性(8.66%),高于女 性(4.30%),差异有统计学意义(=34.28,P<0.005),其 原因:?男性感染机会多于女性;?男性细胞中具有和HBsAg 相类似的抗原,而女性则无.ALT的异常率:男性(2.34%), 高于女性(0.70%),两者相比,差异有统计学意义(Y= l9.50,P<0.OO5),其原因有待进一步探寻. (3)HBsAg的携带率:农村(7.14%)高于城市 (5.37%),差异有统计学意义(Y=5.06,P<0.005),其原 因:?农村医疗卫生条件较差;?农村的卫生保健意识淡薄. (4)HBsAg的阳性率:应届毕业生(6.92%)高于往届毕 业生(3.91%),差异有统计学意义(=7.25,P<0.05), 其原因:?往届生已检测过暴露阳性后经治疗后痊愈或HBV 受到抑制,处于检测水平以下;?抽血时由替身代替;?阳 性暴露后,产生精神心理压力,悲观失望,影响学习成绩, 不再参加高考;?往届生比应届生卫生保健意识淡薄. 通过检测调查分析,可反映出曲沃县高考学生的HBsAg 的携带率和ALT的异常率,不同人群的分布特征以及动态变 化趋势.为高考录取工作中限报的院校及专业提供了技术支 撑,也可为有关部门提供信息,我们应与婚检,卫生监督和 疾病控制等部门密切配合,对查出阳性或异常者应进一步和 定期检查.建议能得到此信息资料的有关部门,个人及其他 部门,各负其责,采取更有效的措施,加强对公民的健康教 育,早预防,早发现,早诊断和早治疗,从根本上消除病毒 性肝炎,乙肝病毒的危害,切实提高我国人民的健康水平. 志谢:向所有支持和参与检测,调查分析的领导和同志 们表示衷心的感谢(收稿日期:2OO4—06—14)