抗虫灵对大鼠全血和人红细胞膜乙酰胆碱酯酶的抑制作用

抗虫灵对大鼠全血和人红细胞膜乙酰胆碱酯酶的抑制作用 CH IN A P UBLI C H EAL TH Vol . 17 N o. 2 Feb 2001 中国公共卫生 2001 年第 17 卷第 2 期 138 文章编号: 1001- 0580( 2001) 02-0138- 03 抗虫灵对大鼠全血和人红细胞膜乙酰胆碱酯酶的抑制作用* * 易宗春 * 蔡红梅 徐汉宫 侯铁英 程清宇 石 年 同济医科大学环境毒理教研室( 武汉 430030) 摘 要: 目 的 应用 Ellman 法 或 羟 胺法 检 测 乙 酰 胆 碱 酯 酶 基 硫 代 磷 酰 胺 酯 ( O- methy-l O- p- methio phenyl thiophospho- 研 究有机磷杀虫剂抗虫灵对大鼠全血 和 ( AChE) 活性。方法 r amidots, M M T ) , 其杀 虫效果 好, 极具 推 广价 值。本研 究旨 在 雄性 大鼠 每天 经口 给 人红细胞膜 A chE 活 性的 影响。结 果 通过观察其对大鼠全血和人红细胞膜乙酰胆碱酯酶( AChE) 的 影响探讨其毒作用机理。 以抗虫灵 61 81mg / kg 连续 5d 可 引起 全血 AChE 活 性明 显 下 降; 动物亚慢性 90d 染 毒后, 雄 性中 剂量 ( 01 25mg / kg ) 和高 剂 1 材料与方法 量( 11 00mg / kg) 组 动 物与 雌性 低 剂量 ( 01 05mg/ kg ) 和高 剂 量 11 1 实验动物 雄性 Wistar 人鼠, 体重 180~ 220g, 供急性染 ( 11 00mg / kg) 组动 物 全 血 AChE 活 性 明显 下 降; 体 外 试 验 发 毒试验用; SD 大 鼠, 体 重 100~ 130g , 供 亚 慢性 染 毒 试 验用。 两种动物均由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。 现, 抗虫灵在所试 验的 5 @ 10- 8 ~ 5 @ 10 - 8 mol/ L 的浓 度范 围 内对人红细胞膜 AChE 活性都有明显抑制作用, 并有剂量和 时 11 2 成人鲜血 由华中科技大学同济医 学院附属协和医院血 间依赖 性, 而且 这 种 抑 制 为 不 可 逆 抑 制。结 论 抗虫灵对 库提供。 A ChE 活性的抑制是其毒作用的重要 机理, 符 合有机 磷杀虫 剂 11 3 试剂 抗虫 灵, 华 中师范大学 同济医学院 农药研究 所提 毒作用的一般规律。 供, 含量大于 99% ; 碘化硫代乙酰胆碱, Fluka 公司产品; 5, 5- 二 关键词: 乙酰胆碱酯酶; 人红细胞膜; 有 虫剂 硫基 2, 2- 二硝基苯甲酸( DT NB) , 中国科学院 上海生物化 学研 机磷杀 - 究所产品; 氯化乙酰胆碱, 军事医学科学院产品; 其他试剂均为 中图分类号: R994 文献标识码: A 纯。 11 4 动物处理 Inhibitory Effect of Organophosphorus Pesticide, O- Methy-l O- p- 11 41 1急性经口染毒将雄 性 W istar 大鼠随机分为 组每 , 2 Methiophenyl Thiophosphoramidots on Acetylcholinesterase Ac- 组 6 只。 实 验 组 经 口 给 予 抗 虫 灵 61 81mg/ kg (相 当 于 1/ tivities of Rat Blood and Human Erythrocyte Membrane. YI 10LD50) ; 溶剂对 照组经 口给 予等量 植物 油。2 组 动物 每天 灌 Zong-chan, et al . Dep ar tment of Environmental T ox icology , 胃 1 次, 连续 5 天, 在动物第 1 次染毒前和每次染毒 24h 后( 下 T ongj i Medical College , H uaz hong Univ er sity of Sciene and 次染毒前) 采集尾血, 动物 在第 6 天断头 处死, 迅速剥 离全脑, T echnology ( Wuhan 430030 ) Abstract: Objective 并分离大 脑皮 层、小脑 和海马, 制 成匀 浆, 用 L owry法 测定 蛋 T o study the effect of organophos- phorus pesticide, O- methy-l O- p- methiophenyl thiophosphoramidots 白质含量112, 测定全血和各脑区 AChE 活性。 亚慢性染毒 11 41 2 将 SD 大鼠随机分为 4 组, 即 3 个染毒剂 ( M M T ) on acetylcholinester ase( AChE) activ ities of r at blood and 量组和 1 个对 照组, 每 组 12 只, 雌雄各 半, 3 个剂 量组 分别 每 human erythrocyte membrane. Methods: Ellman method and 天喂饲抗虫灵 01 05、01 25 和 11 00mg / kg, 为时 90 天, 最后 处死 Hydrox yamine method were used to measure A ChE activity. Re- 动物收集全血, 测定 A ChE 活性。 sults After rats tr eated with M MT at the dose of 61 81mg / kg/ 11 5 人红细胞膜的 制备 使用差 速离心法122, 在 4 e 条件下, day for 5 days or treated w ith M M T at the doses from 01 05 to 成人全血 1900r/ min 离心 2min, 吸除血浆, 红细胞用 50mmol/ L 11 00mg / kg/ day for 90 days, their blood AChE activities decreased T ris- HC-l 1mmol/ L EDT A- 生理盐水( pH71 4) 等渗缓冲 液洗涤、 obviously; In vitro , M M T could irr eversibly inhibit AChE activity 离 心 3 次, 所 获 红 细 胞 加 入 20 倍 体 积 10mmol/ L T risHCl on human erythrocyte membrane in dose and t ime- dependent ( pH71 4) 低渗缓冲液溶血。8600r/ min 离心 20min, 沉淀洗涤离 manners. Conculution T hese results show that, similar to other 心 3 次, 收集红 细胞膜, 用 50mmol/ L T ris- HCl( pH71 4) 缓冲 液 or ganophosphor us pesticides, inhibiting AChE actvity is majo r tox- 悬浮, - 70 e 保存。L owry 法测定蛋白质含量。 ic mechanism o f M M T . 急性染毒 试验所得 样品和 体外试 验用 Key words: acetylcholinester ase; human ery throcyte mem- 11 6 AChE 活性测定 132 brane; org anophosphorus pesticide Ellman 法 测定 AChE 活性; 亚慢性染毒试验所采集的全血用 羟胺法142测定 A ChE 活性。 有机磷杀虫剂是目前应用最为广泛、发展 最为迅速的一类 11 7 数据处理 所获数据用 t 检验检验实验 组与对照组 之间 杀虫剂。它们具有广谱、高效的杀虫特点。有关它们的毒作 用 的差异显著性, 结果用 Š? S 示。 X 机构已有广泛深入的研究, 并已 基本明 确, 但 是一些 新的有 机 2 结果 磷杀虫剂不断涌现, 特别是那些具有推广价值 的杀虫剂需要从 21 1 整体试验抗虫灵对大鼠全血乙酰胆 碱酯酶的抑制作用 毒作用机理上得到证实, 从而为在生产使用和 日常生活中可能 21 11 1 抗虫灵经口急性染毒持续不同时间大 鼠全血 A ChE 活 出现的中毒的防治提供必 要的理 论和实 际依据。抗 虫灵为 新 性的变化 实验发现实验动物每 次染毒 24 小 时后血液 AChE 研制出的有机磷杀虫剂, 化 学结构 名为 O- 甲基- O- 对 甲硫基 苯 活性并不能 完全恢复, 表现 为随着染毒 持续时间的 延长, 全血 A ChE 活性抑制逐渐累积, 第 1~ 5 次染毒后 A ChE 活性抑制率 * 本研究为国家自然科学基金资助重点项目( 项目编号 39430110) 分别为 21 42% 、41 35% 、201 53% 、281 02% 和 281 65% 。* * 北京大学医学部( 原北京医科大学) 毒理学系( 北京 100083) 中国公共卫生 2001 年第 17 卷第 2 期 CH IN A P UBLI C H EAL TH Vol . 17 N o. 2 Feb 2001 139 在急 21 11 2 整体试验抗虫灵对大鼠全血 AChE 活性的影响 21 21 3 抗虫灵对人红细胞膜 A ChE 活性抑制作用类型分 析 性经口染毒中, 抗虫灵可引起动物全血和不同脑 区 AChE 活 性 应用酶动力学方法鉴别 抗虫灵 对人红 细胞 A ChE 活 性的抑 制 152。即将不 同量人 红细胞 膜制备 物与 是可逆性还是不可逆性下降, 染毒组动物全血、大脑皮层、海马和小脑 A ChE 活性分 别 一定浓度抗虫灵 37 e 温 育, 加入 AChE 底物 碘化 硫代 乙酰 胆 为 11 22 ? 01 13Lmol/ min/ ml、281 87 ? 51 86、241 34 ? 61 10 和 碱, 测定其酶促 反 应初 速度 ( V ) , 以酶 浓 度( 即 红细 胞 膜蛋 白 91 28 ? 31 30nmol/ mg pr/ min, 与对照组( AChE 活性分别为 11 71 ? 01 05Lmol/ min/ ml、391 29 ? 61 73、391 07 ? 121 05、261 37 ? 量) 对 V 作 图。 根 据 剂 量 效 应 和 时 间 效 应 曲 线, 选 用 61 82nmol/ mg pr/ min) 比较差异有 显特 性。在亚 慢性染 毒试 验 01 25mmol/ L 的抗虫灵作 AChE 活性 抑制类 型分 析, 结果见 附 图。可见, 当反应体系中不存在抗虫灵时, 所得直线经过原点; 中, 大鼠全血 AChE 活性变化见表 1, 可 见, 中 剂量和 高剂量 抗 如果有抗虫灵存在时, 其直 线斜率不 变虫灵可引起雄性大鼠全血 AChE 活性的明显抑制, 抑制率分 别 , 但不经 过原点。表 明 为 261 84% 和 311 70% , 表现 出剂 量效应 关系; 在 雌性大 鼠中, 抗虫灵对人红细胞膜 A ChE 活性 的抑制 作用属 于不 可逆性 抑 制作用。 低剂量组和高剂量组染毒动物全血 AChE 活性有明 显下降, 分 别下降了 141 05% 和 451 28% , 中 剂 量组 动物 未 见全 血 A ChE 活性明显变化。 表 1 亚慢性整体试验抗虫灵大鼠全血 AChE 活性变化 A ChE 活性( Lmol/ 30min/ ml) 染毒剂量分组 mg/ ( kg#d) 雄性 雌性 对照组 311 04 ? 21 10 341 30 ? 3157 0105 281 57 ? 31 53 291 48 ? 31 18* * 0125 221 71 ? 31 16* 4179 341 63 ? * * * 1100 211 20 ? 11 57 181 77 ? *31 27 与对照组比较 * P< 01 05 * * P< 01 01 21 2 体外试验抗虫灵对人红细胞膜 A ChE 活性的抑制作用 21 21 1 抗虫灵对人红细胞膜 AChE 活性抑 制作用的剂量效 应 关系 将适量人红细胞 膜与不同终浓度抗 虫灵 37 e 下共 同温 育 30min, 之后测 定 红细 胞膜 AChE 的 活性 , 结果 见 表 2。 可 见, 随着抗虫灵浓度的增加, A ChE 活性 也相应 降低, 表现出 明 附图 MMT对人红细胞膜 AChE 抑制作用类型分析 显的剂量效应关系。 3 讨论 表 2 不同浓度抗虫灵对人红细胞膜 AChE 活性抑制作用 整体实验表明, 无论 是急性 染毒还 是亚慢性 90 天喂养 试 验, 抗虫灵对大鼠全血 A ChE 都有明显的抑制作用; 而且, 在体 M M T 浓度( mol/ L) AChE活性 Lmol/ ( mgpr#m in) 外实验中, 也证实抗虫灵对人红 细胞膜 AChE 活性有明显 抑制 0 11 57 ? 01 05 作有, 并表现出明 显的剂量 和时间依赖 性, 其 作用为不可 逆性 * 5 @ 10 - 8 *11 00 ? 01 04抑制。因而, 抗虫灵作为有机磷杀虫剂其 毒作用机理符合一般 - 7 * * 5 @ 10 01 98 ? 01 02 162。 有机磷化合物毒作用规律* 5 @ 10 - 6 *01 96 ? 01 04整体试验还表明抗虫灵 对大 鼠全血 AChE 活性 的抑制 有 * 5 @ 10 - 5 *01 86 ? 01 02蓄积性, 表现为 5 天连续染毒中随着染毒时间 的延长 A ChE 活 * 5 @ 10 - 4 *01 51 ? 01 03 性受抑制程度也不断 增强, 到第 5 天抑 制率 达 281 65% ; 90 天 与对照组比较, * * P< 01 01 喂养试验中, 高剂量组雌雄两性 别动物全血 AChE 活性分 别抑 21 21 2 抗虫灵对人红细胞膜 AChE 活性抑 制作用的时间效 应 制 451 28% 和 371 70% 。 推 测 其 原 因 为: ( 1) 由 于 抗 虫 灵 对 关系 将 适 量 人 红 细 胞 膜 分 别 与 终 浓 度 为 01 05mmol/ L、 A ChE 活性产生不可逆抑制, 其活 性恢复有 赖于 A ChE 的 重新 01 25mmol/ L 及 01 50mmol/ L 的抗虫 灵于 37 e 温 育不同 时间, 合成, 而 重新合成是 一个复杂 的过程, 需要一定 的时间; ( 2) 我 测定红细胞膜 AChE 酶活性, 结果见表 3。可见, 3 个不同剂 量 们的试验已证实抗虫灵对肝脏生物转化酶系有抑制作用( 结果 抗虫灵对人 红细胞膜 AChE 活性 的抑制作 用随 着温育 时间 延 待发表) , 这样会造成抗虫灵 代谢失活 缓慢; ( 3) 抗 虫灵具 有亲 长而加强, 其中 01 5mmol/ L 剂量在 作用 60min 时, A ChE 活 性 脂性, 可在含脂肪量多的组织蓄 积。 被完全抑制, 时间效应关系明显。 A ChE 为有机磷杀虫剂的特异靶 分子, 本实验 证实抗 虫灵 表 3 抗虫灵处理不同时间人红细胞膜 AChE 活性 作为有机磷杀虫剂也具 有同样 的特 点。在实 验观 察中, AChE MM T 处理时间 AChE 活性 Lmol/ ( mg pr#min) 活性是抗虫灵中毒动物 较为敏 感的指 标。从整体 实验结 果来 - 5 - 4 - 3 ( m in) 5 @ 10 21 5 @ 10 mol/ L mo l/ L 5 @ 10 看, 血液 AChE 活性变化 与脑组 织 AChE 活性 变化相 一致, 而 m ol/ L 0 11 57 ? 01 05 且体外实验中, 抗虫灵对人红细 胞膜 AChE 活性与大鼠脑 突触 * * 5 11 25 ? 01 01 * 11 27 ? 01 02* 11 40 ? 01 04 * * 体 AChE 活性抑制的机理都为不可逆抑制 172, 并有剂量和 时间 * * 10 11 38 ? 01 06 * * 11 23 ? 01 05 * 11 06 ? 01 04* * * 15 依赖性, 因而, 用全血 AChE 活性变 化可 有效反 映抗 虫灵中 毒 11 34 ? 01 04 * * 11 09 ? 01 03 * 01 81 ? 01 06* * * 30 11 16 ? 01 01 * * 11 00 ? 01 03 * 01 20 ? 01 03* 引起的脑组织 AChE 活性变化情况, 可作为抗虫灵神经毒 作用 * ) 45 11 14 ? 01 03 * * 01 81 ? 01 05 * * 的效应标志物; 亚慢性毒性试 验抗虫灵 可引起 大鼠全血 AChE 60 11 00 ? 01 03 * * 01 57 ? 01 01 * ND 的明显 抑制 , 这 种全 血AChE活性 抑制 的积 累, 可 反应 抗虫 灵与对照组比较* * P< 01 01 CH IN A P UBLI C H EAL TH Vol . 17 N o. 2 Feb 2001 中国公共卫生 2001 年第 17 卷第 2 期 140 得的马拉硫磷含量, Lg; V0 ) 状况下的采样 体积, L ; D ) 解 文章编号: 1001- 0580( 2001) 02-0140- 01 吸效率。 结果与讨论 ( 1) 精密度 和检测限: 分别取 适量马拉 硫磷 气相色谱法测定空气中的马拉硫磷 贮备液, 配成 10, 20, 40Lg/ ml 的标准液, 每个 浓度 6 个样品, 相 对标准 偏 差为 51 7% , 51 0% , 21 3% ; 回 归 方 程 Y = 3351 5X - 辽宁省劳动卫生职业病防治所( 沈阳 110005) 5111 1, 相关系数 r= 01 9999; 检测 限为 21 1 @ 10 - 3Lg / 2Ll, 最 低 李玉杰 于秀兰 3( 采气 10L ) 。( 2) 解吸 效率: 取 18 支 硅 检出浓度为 01 1mg/ m营口市跋鱼圈区卫生防疫站 张文杰 胶管分为 3 组, 每组 6 支, 各组分别加入 10, 20, 40Lg 的马 拉硫 文献标识码: A 中图分类号: R134 + 1 4 磷贮备液, 放置过夜, 然后按样品分析处理, 结果见表 1。 解吸效率 马拉硫磷是一种有机磷杀虫剂, 广泛用于 农作物害虫的防 表 1 治。我国车 间空气中马拉硫磷 最高容 许浓度为 2mg / m 3, 采 用 加入量( Lg) 测定值( Š? S, Lg) 解吸效率( % ) X 的分析方法比色法112。该法操作繁琐, 且样品不便于运输和贮 10 91 8 ? 01 4 981 0 存。为此, 根据5车间 空气中有毒 物质监 测研究 6 112( 下 称 20 181 7 ? 01 4 931 5 / 规范0 ) 的要 求, 建 立了 硅胶 管 采样, 丙酮 解 吸; OV - 1 柱 分 离, 氢火焰离子化检测器( FID ) 检 测的气 相色谱 法。现 如 40 361 3 ? 11 8 901 8 下。 表 1 结 果显 示, 解 吸效 率 在 901 8% 以 上, 符 合/ 规范0 要 实验方法 ( 1) 仪器: G C- 9A 型气相色 谱仪及 FI D; T M P 求。( 3) 样品贮存稳定性: 取 12 支硅胶管, 分别加入 20Lg 马拉 - 1500 型 采 样器 ; 硅 胶 采样 管: 长 14cm, 内 径 4mm; 前 段 装 硫磷, 当日分析 6 支, 其余在室温下存放 7 天后分析, 测定 平均 200mg, 后段装 100mg 硅胶, 中间和两端用玻璃棉固 定, 熔封 备 值分别为 181 8Lg 和 181 2Lg, 回收 率分 别为 941 0% 和 911 0% 。 用。( 2) 试剂: O V- 1, 色谱 固定液; Chromosorb WA W 担体, 60 因此马拉硫磷在硅胶上 比较稳 定, 至 少可保 存 1 周。( 4) 穿 透 ~ 80 目; 马拉硫 磷, 色谱纯; 丙 酮, 分析 纯; 硅胶 40 ~ 60 目; 马 容量: 用 抽 气 蒸 发 法122 试 验 穿 透 容 量, 当 马 拉 硫 磷 浓 度 为 拉硫磷贮 备液 : 取 811 3Ll的马 拉 硫磷 标 准品 于 10ml容 量 瓶 3 40mg / m ,相对湿度大干 80% ,以 01 5L / min流量采 气 60L ,测 中, 加丙酮至刻度, 此溶液 1ml= 10mg 马拉硫磷。( 3) 采样: 对 得马拉硫磷穿透容量大于 21 4mg / 200mg 硅胶。( 5) 干扰试验: 照试验为: 将硅胶管带至采样点, 除不采集空气外, 其余操作 同 在本实验条件下, 生产 过程中 共存的 化合物, 如甲 醇、乙醇、苯 样品。样品 采集: 在采样地点打开硅胶管, 100mg 端接采样器, 等不干 扰马 拉硫磷 的测 定, 它们的 保留 时间 不超过 1min30s, 于工人呼吸带垂 直放 置, 以 01 5L/ min 的 流量 采气 10L 后, 两 解吸 溶 剂 丙 酮 保 留 时 间 为 50s, 马 拉 硫 磷 的 保 留 时 间 为 端套上塑料帽待分析。( 4) 分析: ? 样品处理: 将样品和空白 管 8min15s。( 6) 现场验证: 应用本方法对某生产 马拉硫磷的 农药 前后两段硅 胶 分别 倒入 5m1 解 吸 瓶中, 各加 1ml 丙 酮, 解 吸 厂进 行 了 现 场 监 测, 共 测 定 了 32 个 样 品, 结 果 为 01 1 ~ 30min, 解吸 液 供 测 定。 º 色 谱 条 件: 色 谱 柱 为 长 2m, 内 径 251 2mg / m 3, 与现场情况相符。 3mm 不锈钢柱; 柱填料: OV - 1: Chromosorb WAW = 2B100; 柱 作者简介: 李玉杰( 1960- ) , 男, 辽宁法库 县人, 理 学学士, 主 要从 温: 190 e ;汽化 室、检测 室温 度: 250 e ;载 气( N 2) 流量: 50ml/ 事应用气相色谱仪进行劳动卫生现场监测和分析方法的研究。 min。 ? 标准曲 线绘 制: 取 贮 备液 用 丙 酮稀 释 成含 0, 10, 20, 参 考 文 献 40Lg/ ml 马拉硫 磷标 准 系列, 各取 2Ll 进样, 每个 浓 度重 复 3 次, 以峰面积对马拉硫磷含量作图, 绘制标准曲线。 ?测定: 各 中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所主编 1 车间 空气监 11 取 2Ll 样品和 空白对照的解吸液进样; 用测得的 样品峰面积 减 测检验方法 1 第 3 版 1 北京: 人民卫生出版社, 1990: 464, 499. 去空白对照的峰面积, 由标准曲线上查得马拉硫磷的含 量。 ? 于秀兰. 一种测定固体吸附剂穿 透容量的 简便方法 1 工业卫 生与 21 C 职业病, 1989, 15( 6) : 369. 计算: X= DV0 ( 2000-09- 26 收稿 2000-11- 09 修回 李溪莹编辑 任旭红校对) 式中: X ) 空气中 马拉 硫磷 浓度, mg/ m 3; C ) 由 标准 曲线 上 查 物理学进展, 1983, 3: 31. 长期接触情况, 因而, 测定 全血 AChE 活性 变化 可作为 抗虫 灵 31 Ellman G L, et al. A new and rapid Colorimet ric det erminat ion of 长期低剂量接触的接触标志物。不过, 动物与人 血液 AChE 都 acet ylcholinesterase act ivit y. Biochem Pharmacol, 1961, 7: 88. 存在变异, 有研究表明欧洲人 127 人中就有 5 人 AChE 活性 低 马谭庚, 等 1 15 种硫代磷酰胺酯 类化合物 与红细胞 乙酰胆碱 酯酶 41 于正常值, 其中 4 人属 AChE 基因 缺陷型 杂合 子182。因 此, 用 作用的双分子速率常数 1 卫生毒理学杂志, 1988, 2( 2) : 208. 血液 A ChE 活性作为抗虫 灵接触 与中毒的 生物 标志物 尚需 进 陈惠黎( 主编) 1 分子酶学 1 北京: 人民卫生出版社, 1983; p228. 51 一步研究。 江藤永总( 著) 1 有 机磷农药 的有机化 学与生 物化学 1 北京: 化学 61 作者简介: 易宗春( 1971- ) , 男, 湖南恩 施籍, 博士。 研究方向: 神 工业出版社, 1981: 104. 经毒理, 分子毒理学。 71 易宗春, 等 1 抗虫灵对大鼠脑组 织乙酰胆 碱酯酶的 抑制作用 1 卫 参 考 文 献 生毒理学杂志, 1999, 13( 2) : 127. 81 K renneth R. Prevalence of Congent ial def iciency in serumCholinest erase. 11 Low ry OH, et al. Protein measurement w it h t he Folin phenol reagent . Arch Environ Healt h, 1997, 52( 1) : 43. J Biol Chem, 1951, 193: 265. 宋艳萍编辑 21 董伟, 等 1 人红细胞 ( Na + , K + )-A TP 酶的研究 1 生物化学 与生物 ( 1999-12- 28 收稿 2000-06- 20 修回 任旭红校对)