人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达

人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞达 人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间 质干细胞表达 第46卷第3期 2010年6月 青岛大学医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEQINGDAOUNIVERSITATIS Vo1.46,No.3 Jone2010 doi:10.3969/j.issn.1672—4488.2010.03.001论着 人TNF—重组慢病毒载体构建及其脐血问质 干细胞表达 马贵亮,毛伟征 (I青岛大学医学院附属医院普外科,山东青岛 .杨堇,安岗.岱震波. 266003;2潍坊市寒亭区医院;3天津肿瘤医院) [摘要]目的构建带有人TNF-~基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达. 方法通过逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)从PCDDNA—TNF-~质粒中获得人TNF-a基因,利用Infusion技术重 组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC—FU-TNF-a,在脂质体Lipofectamine2000介导下与结构质粒pHelper1.0和包膜 质粒pHelper2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒.将人脐血间质干细胞分为实验组(pGCFU-TNF-~),空载体 对照组(pGC—FU—EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒,空载慢病毒,PBS感染后,采用RT—PCR 以及ELISA方法检测TNF_a表达.结果所获TNF-~基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质 粒pGC—Fu—TNF_a经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集,浓缩病毒后 测定其滴度为2×10Tu/L,感染 脐血间质干细胞后RT-PCR,ELISA检测3组细胞均有TNF—a表达,其中实验组大 量表达TNF—a,与其余两组比较 差异有显着性(F一11.677,21.321,P<0.01).结论成功构建带有TNF—基因的慢 病毒载体并实现在脐血问质 干细胞中的表达,为脐血问质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础. [关键词]慢病毒感染;遗传载体;肿瘤坏死因子;基因;脐血;间质干细胞 [中图分类号]R318.12[文献标志码]A[文章编号]1672—4488(2010)030189,05 CoNSTRUCTIONOFLENTIVIRALVECTORCARRYINGTNF-nGENEANDITSEXPRESSIONINHUMANUMB1LICALCORD BLOODMESENCHYMALSTEMCELLSMAGUI—LIANG,MAOWEI— ZHENG,YANGKUN,etal(DepartmentofGeneral Surgery,TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266003, China) ~ABSTRACT]ObjectiveToconstructalentiviralvectorcarryinghumanTNF— agene,andobserveitsexpressioninhuman umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells(UCBMSCS).MethodsHumanTNF— agenewasobtainedwithreversetranscrip— tionpolymerasechainreaction(RT-PCR)fromPCDDNA—TNFplasmid.TheTNF— agenewasrecombinedtoconstructthe transferplasmidpGCFU— TNFabyinfusiontechnique.The293TcellswerecotransfectedwiththetransferplasmidpGC —FU— TNF,theconstructionplasmidHelper1.0andtheenvelopeplasmidHelper2.0withthehelpofl ipofectamine2000toproduce lentiviralparticles.HumanUCBMSCSweredividedintoexperimentalgroup(pGC— FUTNF-a),mockgroup(pGCFU—EGFP)and blankgroup(UCBMSCS),whichwereinfectedbyrecombinantlentiviralparticles,emptyle ntiviralparticlesandPBS,respective— ly.TheexpressionofTNFqwasobservedbyRT— PCRandELISA.ResultsTheresultsofgenesequencingshowedthatthe clonedTNF一? genewasconsistentwiththesequencereportedinGenBank.ThepGC-FU-TNF~plasmidwasidentifiedtohavecor— rectsequence.Afterthethreeplasmidsof1entiviralvectorswerecotransfectedtothe293Tcel ls.thesupernatantwascollectedand concentrated.Thetlterofthelentiviralvectorparticleswas2× 107TU/L.Aftertheconstructed1entiviralvectorsinfectedthe UCBMSCS,TNFexpressiondetectedwithRT— PCRandELISAwasfoundinallthreegroups,buttheexpressionofTNF-ain thepGC—FUTNF-agroupwassignificantlyhigherthanthatinthepGC-FU— EGFPgroupandtheUCBMSCSgroupatbothmRNA andproteinlevels(F一 11.677,21.321;P<O.O1).ConclusionLentiviralvectorcarryingTNFagenehasbeensucc essfullycon— structed.TheinfectedhumanUCBMSCScanexpressTNF-aprotein.Theresultsofpresentst udyprovidebasisforapplicationof UCBMSCSgenetransfertherapyinthetreatmentofgastriccarcinoma. [KEYWORDS~lentivirusinfection;geneticvector;tumornecrosisfactor— alpha;gene;umbilicalcordblood;mesenchymal stemee? 肿瘤坏死因子一a(TNF—a)是一种重要的免疫 [收稿日期] [基金项目] [作者简介] [通讯作者] 2009,10—22;[修订日期]2010—02—17 国家自然科学基金资助项目(30772542) 马贵亮(1983一),男,硕士. 毛伟征(1962),男,博士,主任医师,硕士生导师. 调节因子,具有杀伤和抑制肿瘤的作用.体外研 究表明,TNF—a是目前发现最有效的肿瘤杀伤因子 之一,但全身给药难以达到体外实验中有效的抗肿 瘤效果.脐血间质干细胞具有多向分化潜能及定向 肿瘤部位迁移并构成肿瘤间质的特性引.本实验通 青岛大学医学院46卷 过构建人TNF—a重组慢病毒感染脐血间质干细胞 使其成为TNF—a基因的载体,观察TNF—a在脐血 间质干细胞中的表达. 1材料和方法 1.1实验材料 细胞和质粒:慢病毒表达载体穿梭质粒pGC— FUVector(含有EGFP基因)和慢病毒结构质粒 pHelper1.0及慢病毒包膜蛋白质粒pHelper2.0, 购自Genechem公司;感受态大肠埃希菌DH5a, TNF_a基因表达质粒PCDDNA—TNF—a,来自我院 中心实验室;人胚肾上皮细胞系293T细胞,人脐血 间质干细胞,来自我院中美于细胞中心.试剂和引 物:限制性内切酶AgeI,NEB公司;In—Fusionkit, BD公司;Taqpolymerase,Takara公司;Primer,上 海吉凯基因技术有限公司;BSA,上海捷倍思基因技 术有限公司;Lipofectamine2000,Invitrogen公司; Plasmid抽提Kit,QIAGEN公司;PCR提取Kit,宝 生物(大连)有限公司. 1.2方法 1.2.1引物设计与合成根据pGC-FUVector的 要求在引物中加入AgeI酶切位点ACCGGT,用 于PCR扩增TNF—a基因,F:5一CAGGATCCCC GGA0CGGTCGoCACCATGAGCACTGAAAG(,- ATGATC-3;R:5一TCACCATGGTGGCGACCG— GTACCAGGGCAATGATCCCAAAG一3,产物大 小为527bp.PCR鉴定目的基因重组连接的阳性 克隆菌落,其中F:5一TGACAAGCCTGTAGCCCA— T一3,R:5一CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG一3, 产物大小为527bp.TNF—a基因引物,F:5,_TGA— CAAGCCTGTAGCCCAT一3,R:5一CGTCGCCGT— CCAGCTCGACCAG一3.内参GAPDH基因引物, F:5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA一3,R: 5一GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA一3.上述 引物设计与合成均由上海生工生物工程技术服务有 限公司完成. 1.2.2重组慢病毒载体质粒的构建采用PCR技 术从PCDDNA—TNF—a中扩增目的基因(TNF—a), PCR反应条件:94?变性30S后,94?变性30s, 55?退火30s,72?延伸2rain,共20个循环,最后 再于72?延伸10min.用Age工酶分别酶切载体 pGC_FUVector和上述PCR产物,琼脂糖电泳分离 纯化.将酶切回收载体DNA,酶切回收的PCR产 物,In—Fusion交换酶及buffer与ddHO加入反应 体系,于23?反应15rain,再于42?反应15rain 制备克隆交换液,转化DHSa.PCR鉴定细菌阳性 克隆,命名为pGC—FU—TNF—a,送往上海生工基因 公司测序. 1.2.3病毒的包装,收集用LB培养液扩增转化 菌DH5a,Plasmid抽提Kit提取骨架质粒pGC— FU—TNF—a,包装质粒pHelper1.0,pHelper2.0. 转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T 细胞,以含体积分数0.10血清的培养基调整细胞密 度为6.0×10/L,重新接种于15cm细胞培养皿, 37?,体积分数0.05CO培养箱内培养24h,待细 胞达70%,8O融合时即可用于转染.转染前24 h将细胞培养基更换为无血清培养基.应用慢病毒 穿梭质粒,结构质粒和包膜蛋白质粒,按Invitrogen 公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染包装 细胞293T细胞,细胞转染后8h更换为完全培养 基,培养48,72h后观察,出现强绿色荧光并有细 胞融合现象时,收集含慢病毒颗粒的细胞上清液,对 其浓缩后得到高浓度的慢病毒浓缩液,分装后保存 在病毒管中,一80?保存. 1.2.4病毒滴度测定?逐孔稀释滴度测定法检 测病毒滴度:分别取10倍比稀释的病毒液100L, ,换为新鲜培养基.4d后,观 加入96孔板,8h后 察细胞荧光及生长状况,并收取细胞进行后续滴度 测定.?实时荧光定量PCR检测病毒滴度:抽提细 胞总RNA,逆转录获cDNA.以GFP基因引物(F: 5一TGCTTCAGCCGCTACCC一3,R:5一AGTTCA— CCTTGATGCCGTTC一3),Actin基因引物(F:5L GTGGACATCCGCAAAGAC-3,R:5一AAAGGG- TGTAACGCAACTA一3)两步法行实时荧光定量, 95?预变性15S;95?变性5S,60?退火延伸 30S,共4O个循环,制作熔解曲线. 1.2.5重组慢病毒pGC—FU-TNF—a在脐血间质干 细胞中的表达检测?脐血间质干细胞的培养与感 染:脐血间质干细胞加入含体积分数0.10胎牛血清 的低糖DMEM细胞培养基(Gibco)中,置37?,体 积分数0.05的CO饱和湿度的孵箱中培养.当细 胞长到8O融合时,用2.5g/L胰酶消化,将脐血 间质于细胞分3组接种于6孑L板,实验组为带有 TNF-a基因慢病毒感染的脐血间质干细胞(pGC— FU—TNF—a组),空载体对照组为未携带任何目的 基因慢病毒感染的脐血间质干细胞(pGC—FU—EG— 3期马贵亮,毛伟征,杨垄,等.人TNF-a重组慢病毒载体构建及其脐血问质干细胞表 达191 FP),空白组为未经感染的脐血间质干细胞,每孔 细胞数为5×10个.待细胞融合度达到30,换 液加入2mL低糖DMEM培养液,10g/L的poly— brene1L,实验组加入感染复数(MOI值)为lO 的重组慢病毒10L,空载体对照组加入空载慢病 毒1L,空白组加入PBS1L,72h后观察荧光. PCR检测:分别抽提3组细胞总RNA,加入 ?RT— GAPDH基因引物作为内参,同时加入TNF—a基 因引物行RT—PCR反应以及灰度分析,检测各组脐 血间质干细胞中TNF—a基因mRNA表达情况.每 组随机读取5次灰度分析数据,取二者比值平均值. ?ELISA检测:收集3组上清行TNF—a蛋白检测, 按ELISA试剂盒说明书操作,检测不同浓度TNF— a品及各组细胞上清液在波长450nm处吸光 度(A)值,根据A值计算各组上清液TNF,a浓度. 1.3统计学处理 应用PPMS1.5统计学软件?3进行数据处理, 结果以?S表示,数据间比较采用方差分析,两两 比较采用q检验. 2结果 2.1慢病毒载体表达质粒pGC—FU—TNF,Ct构建 电泳结果示,748bp处有特异条带,与预计产 物大小一致,表明已成功提取TNF—a基因(图1); 慢病毒载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱见图2; TNF—a重组质粒阳性克隆PCR鉴定,琼脂糖电泳 可见527bp目的片段,与预计PCR产物大小一致, 初步确认成功构建重组质粒(图3).测序结果显 示,pGC—FU—TNF—a中TNF—a序列与GenBank中 正常NM一000594序列完全一致. 2.2包装细胞293T细胞转导pGC—FU_TNF—a质 粒后绿色荧光蛋白(EGFP)的表达 将pGC-FU—TNF—a质粒转导入293T细胞后, 其TNF—a蛋白的表达与EGFP的表达是一致的. 将pGC—FU—TNF—a质粒和包装质粒pHelper1.0, pHelper2.0共同转染293T细胞12h后,在荧光显 微镜下可以看到EGFP的表达呈阳性. 2.3携带重组慢病毒的包装和病毒滴度 本文三质粒共转染293T细胞,成功包装表达 TNF—Q基因和EGFP基因的慢病毒pGC—FU—TNF— a,实时荧光定量PCR结果显示,3,1OL样品和 其后更低稀释度样品之间基因表达有一定差异,其 后样品基因表达和空白对照组相比差异无显着性, 因此评估3,1OL样品中仍有病毒颗粒,该批病毒 的滴度为2×10TU/L,Actin及感染样品熔解曲 线均呈单峰,可排除引物二聚体影响. 2.4慢病毒感染人脐血间质干细胞表达情况 2.4.1慢病毒感染人脐血间质干细胞绿色荧光蛋 白的表达病毒感染人脐血间质干细胞72h后,荧 光显微镜观察,实验组可见绿色荧光,分布于胞膜位 置,荧光随着细胞传代可持续;空载体对照组见较强 绿色荧光;空白组未见绿色荧光. 2.4.2TNF—a基因mRNA表达电泳结果显示, 186bp处有特异条带,与预计产物大小一致,表明3 组均有TNF-a基因mRNA的表达(图4).空白组为 6.03?0.88,实验组为2.71?1.57,空载体对照组为 4.63?1.32,实验组与空载体对照组及空白组比较差 异有显着意义(F一11.677,P<0.01),空载体对照组 与空白组之间比较差异无显着意义(P>O.05). 2.4.3各组上清液TNF—a浓度的测定空白组为 (O.76?0.11)mg/L,实验组为(91.32?0.23)mg/ L,空载体对照组为(O.7O?0.25)mg/L,实验组与 空白组及空载体对照组比较差异有显着意义(F一 21.321,P<0.01),空白组与空载体对照组之间差 异无显着性(P>0.05). 3讨论 近几年的研究显示,多种细胞因子对恶性细胞 有杀伤作用.TNF是1975年首次由CARSWELL 等[4发现,经卡介苗注射或细菌内毒素感染的小鼠 血清中含有一种可引起荷瘤动物的肿瘤组织出血坏 死的物质,该物质对体外培养的多种肿瘤细胞株具 有细胞毒作用.LIENARD等用TNF—a进行隔 离性肢体灌流法治疗肢体软组织肿瘤和骨肉瘤取得 了轰动成果.TNF—a可通过TNF—a受体诱导肿瘤 细胞凋亡,促进免疫细胞增殖分化,影响肿瘤局部血 管,提高肿瘤血管内皮细胞通透性,促血栓形成,抗 肿瘤新生血管形成抑制肿瘤生长.然而,临床研究 显示,以全身给药的方式应用TNF—a,即便给药量 达到人体的最大耐受量,也难以达到体外实验中有 效的抗肿瘤增殖的浓度.其原因可能与循环系统对 其清除以及半衰期较短有关.TNF-c~大剂量应用 产生的副作用较多,也限制了其全身给药.本实验 目的在于寻找TNF—a载体,使其在肿瘤局部持续低 浓度释放,既达到杀伤肿瘤细胞作用,又使副作用最 小,即转基因载体. 3期杜婷婷,宋宁,谢俊霞,等.迷迭香酸对MPP导致MES23.5细胞损伤保护作用195 质瘤和中脑黑质DA能神经元的特性l-8].本实验室 前期的工作表明,MPP可通过诱导凋亡对MES 23.5细胞产生毒性作用,MPP可以特异性损伤线 粒体,导致线粒体跨膜电位的降低,细胞内ROS的 生成增加,而ROS的产生又加重了线粒体的损伤, 如此循环,最终导致细胞的凋亡.本实验证实了 RA能对抗MPP诱导的MES23.5细胞的损伤. RA发挥其保护作用的可能机制主要有两点:一是 氧化应激 RA可能通过抗氧化应激发挥保护作用. 在PD中起到重要作用,脑内富含DA的区域容易 受到氧化应激的影响,因为DA本身的代谢导致了 ROs的产生,包括过氧化氢和羟自由基l_9].线粒体 不仅是ROS的主要靶点还是R0S产生的主要部 位,这与氧化分子破坏的主要靶点一致口.RA可 能通过减少R0S的产生,保护线粒体功能,发挥抗 氧化应激的作用.二是RA可能通过抗凋亡发挥保 护作用.本室以前的工作证实了MPP可诱发细 胞的凋亡过程,因此我们推断RA可能通过抗凋亡 机制保护MES23.5细胞的功能.本实验证实了 RA对MPP导致的MES23.5细胞损伤确实有保 护作用,其发挥作用的机制仍待进一步探讨,为该药 开发成为预防和治疗PD的新药提供了实验依据. [参考文献] E13JELLINGERK.PathologyofParkinson'ssyndrome[M]. HandbookofExperimentalPharmacology,1989,88:47 112. r23GELINASS,MARTINOLIMG.Neuroprotectiveeffectof estradiolandphytoestr0gensonMPP+一inducedcytotoxicityin neuronalPC12cellsj-j].JNeurosciRes,2002,70:90—96. r3]SCARPATIML,ORIENTEG,Isolamentoecostituzione dell'acidorosmarinico[J~.RicSci,1958,28:2329—2333. E4]AQUILANOK,FILOMENIG,DIRENZOL,eta1.Reac— riveoxygenandnitrogenspeciesareinvolvedinsorbitol—.in—- ducedapoptosisofhumanerithroleukaemiacellsK562[J]. FreeRadicRes,2007,41(4):452-460. 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