重组人干扰素α-2b的纯化研究（可编辑）

重组人干扰素α-2b的纯化研究（可编辑） 重组人干扰素α-2b的纯化研究 天津大学 硕士学位 重组人干扰素α-2b的纯化研究 姓名:赵雪雁 申请学位级别:硕士 专业:生物化工 指导教师:孙彦 20031201中文接要 中文摘要 本文系统地介绍了膨胀床吸附分离技术,并研究了其在实际的生物工程药物 一 一蓬组人干扰索氆一分离缝纯中的应用。 .班溶菌酶为目标蛋盎,磷究了 吸辩奔蕨在膨胀廉中的膨张瞧蕊、 流体力学一睫能以及蛋白脯在吸附介质上的吸附性能,并将膨胀廉吸附分离 技术应 膨胀床一步分离 用于卵清纯化溶菌酶的实际过程,结果表明通过 缝纯,溶蘩簿活毪渡零达弱。%,缝纯毽子这裂,; 一,可以有 。通过使用疏水性膨胀床介质 分离纯化 效的分离纯化 吼心,去除细胞碎片:在 疏水性膨胀床 操非豹放大避程孛,过瑕中干扰素豹活性收率可以达到%发言,整个过糇艴 处理萤可以达到./舞介震; 过程中,在 膨胀床介质提取裂解液中 .应用自修饰的 纯化 甜的同珏寸,细胞碎片被有效的去除,单步纯化因予达到.发右, 活洼雯率达蜀%轰右;在惫素豢鞠澎涨寒吸辫酶敖太过舔中, 过程的处理量为疏水性膨胀床吸附操作的两倍; .在色素亲和膨胀床吸附操作之后,进~步利用离予交换层析和擞胶过滤层柝 米分 程。,霹敷蒋慧纯他翅子挺裹到左右。整个过程的蚊率簌 离缝纯 ‘.的磁活在..× %以上。整个纯佬过稷褥到静 /,接远 纯品 .的比活.× /。 关键调;膨强凑、雾蒎穷凌、生蘩努璃、干扰紊 ,. 一一一。 乙.. .%, 伐? . 。 . %... ,, , % ... .%. /. , ,, :独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经 发表 或撰写过的研究成果,也不包含为获得墨鲞盘茔或其他教育机构的学位或证 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名: 签字日期: 狲 少予年位月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫洼盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨生盘茎可以将学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检 索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意 学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 保密的学位论文在解密后适用本授权说明 导师签名 学位论文作者签名 起卿 签字日期:多年/上月习日 签字日期:?洳弓年,。月衫日第一章文献综述 第一章 文献综述 .截富 囊零燕组技术诞生以来,作为现代生物技术拨心豹蒸闲工程技 术得戮飞速的黢展。年美国公司蓄虎将重组禳岛素投放市场,标志鬻 世界第一个基臌工程药物的诞生。基因工程药物自闽世以来,成为制药行业的~ 支奇暴,每年平均有种左右酶新药袋疫营溺麓。迄今态立,已有种鏊隧 工程药物上市,多种处于临床试验状态,融开发成驹的药懿已广泛应用于治 疗癌霾、器炎、发育不楚、糖藤瘸、囊纤维变髓帮一黧遗传瘸上,京穰多领域特 别是疑难病症上,起到了传统化学药物难以达剿的作用。基因工程制药行业在鲎 二?霉中翡飞速发震燕戳努予遗传、努予生耨、分子癀遴移垒梅耱理等蒸磷攀辩 的突破以及基因工程、细胞工穗、发酵工程、酶工程和鬣白质工程等撼础工程学 褥戆巍速逡袋为螽詹瀚,集串了毳蓑燮妨学、医擎衮蓊学翡最宠避翁技术、设奄 和方法。从而形成一个随大的黼新技术产业,产生了不可估量的社会效益和经济 效益; 生产基因工程药物的基本方法是将目的基因用重组的方法连接在载 俸主,然莲饕羧葵导入鬻缨稳锾生物、碡嚣动饕缀藏或天转缀缓靶缨慈,蕊 目的基因在靶细胞中褥副表达,最后将寝达的目的蛋囱质提纯并做成制剂,从而 或受蛋鑫类蓊蠛疫蓥。 据美国药物研究与制造协会华统计,将正搬开发的生物药晶按分子擞 裂努裳,蓑在;藿丸霞豹分裂是:革夷爨攘蒋、痰萤、鏊强浚疗、鑫奔素、予拢索、 生长圈子、重组可溶蚀受体,反义药物和人生长激素。生物投术产品年全球 镄售额在万美元以上熬奘蠢个,驽耩,红缨藏生藏素, 胰岛紊,伐, 千扰素,乙肝疫苗, 蘩磷藏蕾骚酶,,缀织纾缭蛋妻游溱暴激活熟; ., ,,艇长激素。/抗体, 垫予貔爨,甜链球麓酶,。,囊介豢 。和,粒细胞匿蠛细胞巢落莉激辫子等。 基因工程药物豹附擞捡毽极高,健在原料滚中含攘很低,燮实现这些生物潢 性街旗的疆楚决菲舞事。摇衙稍焉叟渤分离摅术,低成本、离牧率、离效率酮缱 化目标产物以及有效控制有寄物质的禽量是这些生物产物能磷转变为一个具有第一章文献综述 实矮羧毽秘竞争力夔产瑟静藏蘩滴嚣】。僵壹予掰受释试识上熬蒙蠢,久饲霹下 游分离纯化过程的研究重视不够,无论是在规模上述是科研投入上部避远小于对 上游技术的研究,使下游分离技术的研究明显落展。同时在生物物质的分离过程 中,生物产物的多样性、复杂性、特殊性、易变性和对生物产物要求的严格性, 导致下游分离技术的成本往魏占整个生物加工过穗的? ,。因此,设计合 理戆下游分鬻过翟,臻究署发骚鍪蘸效;装及吴毒镑对技赘分凑菝本惫寒鑫受鬟人 们的关注。 生物反应的产物一般是含细胞、游离的细胞外代谢产物、细胞内代谢产物、 残留底物殿其它成分的混合液。从低分子化合物到具有复杂结构的生物组织,在 大小、形悫和性质上具有广溅的分布。因此,在生物产物分离纯化过橼中必须根 据基轹产凌瓣特点,在豫撩箕黛镌瓤缝靛兹撬下避露分离缝纯操俘。为了绦护联 提取甥痰的生理活毪及结鞫上酌完整,生纯分离方法多采用温稻的“多喻式”进 行,也就魑我们常说的“逐层剥皮”方法,一个生物产物的分离常需臻几个步骤, 甚至十几个步骤,并不断变换备种分离方法除去杂质,才能达到纯化日的”】。这 种分离方法操作时间长,步骤繁琐,目标产物的收攀低,常会给制备工作带来诸 多不便。铡烟,公司在擞产鬟组太簇岛素豹秘麓,其分离过程鸯个工痔, 雹捂获链仞辫、拼攘、援叠等,按每一步骤的收率《遮%,萁慧蔽率仪为.%, 因而无法嫩产?。 干扰索是病毒等诱导剂作用于寄生细胞而产生的一类县肖生物活性 的糖蛋囱,具有很高的抗病毒活性并能够抑制痫游、肿瘤细胞的增嫩,是一类广 谱的抗瘸毒药物。干扰素被广泛邈用于治疗手炎、溅行性感霉等常见瘸漆性疾病, 嗣霹在警&滁瘗、雷蘸癌等多秘痰瘘静治疗孛氇褥到广泛熬盔瘸。于魏索摄蕹萁结 构和来源分为三种。即干扰索仪、干扰素、干扰素。作为一种多潦因产物, 干扰索分为许多亚型,其中黛组人干扰素一 ..,简称 .以其对重症急性呼吸系统综合征的显著防 治作用,燮是引起了众多企般界和学术界的关浚。年我国生产干抗素的厂 家鼗薰梵多家,壶魏霹戳饕逡于撬素在生凌王稳舞耱孛占毒重饕戆壤霞。 由予入干扰素为臆肉活性产物,利用传统的血浆制备褥到的产物产量 很低。因此,现阶段在工业上多采用基因工程技术进行生产,主要怒通过对重组 基因工糨菌的构建,培养和下游的分离纯化等一系列步骤而得到的。天津华立达 生物工稷肖限公司在实际生产中,从细胞裂解到获褥符合药品规范的纯品干扰素 一数霭簧步淤土夔势褰纯纯建程,鼙绥庭酸碎、离心凌簿、鼗辑淡淀、凌淀兹 复溶、疏承惶相互作用层析、阴离子交换层柝、阳鬻子交换层析积凝胶过滤层析 等。繁多的分离步骤引起的产品收率低一般产晶收率约%和生产周期长,第一章文献综遮 成为了熬个生产过程靛溉颈润。嚣姥,选辑抉遮两有效豹分离手段是鼹决上述 问题的获键。目前,国内对相关方面的技术改造黟集中程对生产过程后期的改进, 如袋罔雄抗亲积层辑技术域多步非亲昶朦援方法泉达到分离纯化于扰索的目的。 虽然上述的方法对于整个爱产过程有所改遴,键是共采省略离心、盐辨沉淀等步 骤,菠以黠予叟产孛蕤瓶矮润戆并没套蜜爨戆鹃瓣决。 遥年来,一释耨鳖酌象物分离概念被撬漱:集成纯分离技术,即对已知的两 种域阏警申以上的单元操佟进行礴效豹组合,组成一种更有效的单元操作,以达到 挺黼产黼收率、缩短纯化步骤和降低纯化赞黼瀚酋的尊。集成化技术的发展为生 物分离技术开辟了新鲍领域,已经逐渐成为避曩簪来生甥分离技术研究中的薪热点 。弱黎褰霓瓣集箴纯分亵技寒奄摇紊黎爱黢匿、双承骚摹取、亲黎貘遘滤、 亲和膜攀取、趣旗界萃取帮流纯臻啜辩等玲吲。其中,滚纯床吸附技术将圆液分 离、浓维帮初步纯仡嚣几个步骤集成予一个肇元撩作中,直接肮含育细腿或缩藏 碎片镣阐体颗敉的高粘度料液中分离纯化目桥产物,以其集成化的优势已经引怒 了备黼麟究学纛和产照器静极大兴趣。然箍,囱予流纯臻蠹固淑磁糖闺邂混藏黧, 啜瓣裁攀耀效率差,分离效率低,掇太弱袋剁其在生黪分离逡露审豹戍爱。 簿黧疆上述潺瑟,感勰了~耢囊鍪豹流稼方式??黪藩藤,淹淹纯藤在下游 生物加工过程中的应用开辟了崭新的领域。膨胀床是利用特殊设计的吸附剂 和陵 餐装爨藤形盛爨旁低返溅姆滢鳃滚纯痣,是一葶孛灏兴戆集成分篱按零,‘芝集澄瀵、 浓缩和净刀步纯化于一体,以真接从含商细胞域细胞碎片等固体颗粒的商粘度料 滚每努离缝化慰轹产戆,妊细熙或绥黪终笄的斌整耋议辖当予离心分离法懿一 %。爨冬 公鹊攘篷了溉‰糙翳聚粥膨聪寡吸鬻奔 袋秘膨胀寐装鬟墩来,黟臌寐嗷瓣毅零技越窳麓广泛豹震翔在爨囊矮撬缝,臻 胞分离【和细胞破碎【‘锵生物下游加工工业中。由于戴在生物分离中其有诱入 的野发麓景,已经逐渐成为生物分离技术蹬究巾的囊热点,尤其楚如馋将膨胀廉 技术熬合予现鸯酶生物分离过糕,发挥膨胀臻躲浆成恍势,接动膨胀藤技术产鼗 纯已经蕊鸯当今产整窥攀零雾懿共谖。零章嶷分缮手魏素夔毪旗翻分褒缝二于撬 索静静种色谱分离手段的萋础上,将重点介缓膨张床吸辩技术静原理、特性、分 离过襁殿其在生物分离领域中的相关研究逃腥。 .干扰素的性质及墩用 .。平挽素的本瑗 干扰素是在特定的诱嫩剂作用下,幽细胞产生的一种具有商魔生物学活性的 免疫灞牲蛋蠢震,主蘩怒瓣蛋秘,昊毒虢瘸辫、抗黪癣釉免疫调节等俸嗣‘。 笫一章文献综述 譬弋鞠豹摄告中称一类能予扶瘸毒在宿主缀腿内增殪懿蛋白 质为干扰素,分子量在之间。但是,现在人们认为干扰素不仅具有免 疫淫蛙纛曼还是体内一秘递矮和激素样物质,?%够调节细腿功能,防獭弧来 物质 尤其是核酸的入侵,维持正常细胞的生理状态,是生物宴田胞普遍存在的一 个防御 系统。 ..干扰素的类型 干扰素分三大类二溅。三大类有白细胞干扰索.仳、成纤维干扰素 一瑟、免疫干扰索。秘型分为型和型,一。【葶疆一? 腾型,?属型。,主要是由人或动物白绷胞诱生艏分泌的 一静的糖蛋白和间源前婀黑皮素原前体,其分子机构 还含有和内啡肷的氨基酸序列四,.在的时候怒稳定的, 该类干扰索还可以分为个亚型。,主要慰由成纤维细胞产生,在许多方面 与相似,为糖蛋融,其特点是在的时候是不稳定的。楚由活纯 细胞和天然杀伤细胞 ,细胞受有丝分裂或特异性抗原 刺激后产生的,不耐热和酸,税的时候楚不稳定酶。叶不仅髓影响蘸 括抗病毒、抗肿瘤细胞生长、分化等方颟的细胞功能,黼且在免疫调节中还起糟 重要乍蠲,如促进合成,健进炎和类组缓兼容往挠淼酌表达,高节丽 。 种细胞、细胞,睡噬细胞的功能活性 ..平扰素的产生 干扰素的产生受细臌基因缀控耩,出于细藏憾中于扰素基因柿稍耪 与干扰素綦因结合,抑制复制酶系统,所以一般情况下,干扰素撼 因处予季荦镧状态。当病毒或其它诱生藕作用予缁脆膜蕨,使干貔素萋豳脱捧割, 干扰索操纵子开始转录,合成,迅速转移至细胞浆,在核糖体上 转译成鼍:挠素麓俸,韬除信号靛爱,袋熬豹予扰索分泌掏缎藤耱。美予俸内猫 些组织产生干扰素,在很大程度上取决予诱导物的应用。产生干扰素的细胞很多, 久翁币狻藏、葶貘、耧鹜、嚣瓣静耱鞠裁纾缝绸憨在掰流感瘸毒憝理爱缘霹 产生干扰素。比较鸡胚肺、肝、肾、心肌、骨骼肌的上皮细胞或成纤维细胞发现. 瓣静上疫缩戆秘戒纾缭缨魏产生于撬繁熬量最大。惹瘸霉楚理家兔鲍黪、 肝、脑和白细胞,最先产生干扰索的是脾和肝细胞,其中脾脏细胞产生的量最大。 这些缝暴表鹗,甭嗣缀织、缨戆产生豹与诱导兹麴秘类鸯缀太关蓉”“。 液中的囱细胞、淋巴细胞、病毒诱导的成纤维细胞和一些肿瘤细胞都能 产生,或,只有来源子遗蛊系统豹缎戆裁连续产生一氆霸一?。正誊个体第一 章文献缘述 麴脾脏、翳照、鹭舷、终周血漤巴麴腿秘嚣髓中都能捡出一岱或一》幻表达 四。。的诱生剂很多,其中病毒的双链的诱生能力最强四。?由 缎腿和鳃腿产生。的诱生裁媳括强秘:一嵇楚促细腿分裂剂,如植物 血凝素、刀豆素、商陆,、葡萄球菌肠毒素; 另一种趣特异性抗原,如结核蘩素、破伤风毒豢、肿瘤细胞等。另外,糖皮质 激 綮、环胞毒素、.和.等则能抑制.的产生四。 .予撬素的生攘豢特性藏凌戆生黪嚣性 具有广谱抗病毒活性,一种既可普中制多种痫毒,叉可抑制多 释瘸毒。不同病毒对的敏感穗不露。其有囊膜结构豁病毒对最敏 感。不仅不同种类的病毒对的敏感性有差异,而且闻一种瘸毒的不同变种对 豹敏感性落不完全穗麓。酴广谱抗瘸毒活稳拜,还髓籀翻病毒以外的获 它微生物的生长,抑制细胞分裂,抑制肿瘤细胞增殖和参与调节免役应答。 ...相对的种麟特异性 予挠素的活力其有相对的种属特异性,即菜~种属动物或组织细胞产生 的干扰索只能对同种属或种属非常接近的动物戏细胞有保护力,即干扰索活 力在 溺静细脆上高,在异释维胞上低。鸡在璃细麓上,/滴度即可抵御水 泡性口炎病毒的攻击,而在鼠细胞上,滴度仍不能保护。但是这种 特要毪怒稻对秘,不是绝对的,如猴绥耱产生静酴对猴有谦护作用辫,对入 和兔的爨阻胞也有一定的保护作用】。 ...微弱的抗原性 年有入报告,用鼠或鸡的免疫兔绒豚鼠,每周次,在篇次出 现抗体,第次以后抗体演度鞘亳。墩有人报告,用人和兔的免疫豚鼠, 每周次,持续半年才获得中和抗体‘婚。 .。警扰素豹研究避聚及蔽褥 .。。拳撬素农越掌串翡聚究疑藏曩 通过对干扰索的作用机制的研究,袋明干扰索并非赢接作为反式作用因子对第一章文簸综述 其效应分子豹基邋组进行调控,褥是氆勘受咎分母的信号转导系统弓发一系列特 辩的生化反应,盥至达到调控效应分子的目的。由于干扰素具有较强的抗病毒、 抗黪瘤霸参与免疫调节作用,爨此,各晕申干扰索广泛应朋于临藤医学。 目前,已取褥的研究及应用成果主鼹有:?干扰素用于慢性乙型肝炎的治疗 葶?研究;?干扰素用于掰型肝炎的治疗和研究;?干扰索用于病毒性心肌炎的滁 疗和研究;?干扰素用于肿瘤的治疗和研究:?干扰索对机体的免疫调节作用; ?干扰豢在畜牧兽医中的应用和研究【。此外,在于扰素与免痰.神经.内分泌网 络的研究领域中也有避聪四。 世纪年代,科学家开始探索干扰素的基因工程生产。年,美国食 鼯管理黉员会蓠先批准 【~和程一干扰素投放市场,基因工 程、干扰素也相继于、年获准投放市场。年,我国科学家成功 磷翩密麓因工程 卜墅予挠素,并予年获褥黼家一裘新药证书,这楚 我国第~个批准生产的藻因工程药物。 ...干扰素的安全性掰究 关于干扰索使用的安全性问题也是入们关滋的焦点。干扰素可引起机体产生 棚应的揽体,人们把这葶中抗体绷分为两类:中謦性抗体和结合性抗体。 一般认为,建囊,结合性抗体怒黧,后者院前者犟出现,鼠出现攀 和滴度也高于前者。临床早已发现,可引起~定的可逆性剐作用,如流感样 症狡、脱发、自蹦胞和瓶小板减少戳及精神揶鄱等症状。一般清况下,停药 居舔 可恢复难常,严重副反应发生搴不到%。 筑矫,于撬素静分子生耱攀研究氇联褥了邋矮,其巾奄括静基因结鸯及 其表达调控,受体取的结构和功能,以及与受体结合后,引起 静信号传导薪模式帮快速调控蒸因表这鹃分子梳理等诸多领蠛“。 鉴于干扰素的众多功用,现在,研究工作翥正设法通过各种遗传技术来增加 手撬素瓣产量;?扩大干撬素蕊因数数瓣;?熬于撬索麓霞藏凌谖节强子翁 控剃 下来增强基因的表达,这种调节因子可以变化,但无害于细胞的生长;?限制产 燕降薅;?诱菇产品分泌;稳定徽生魏晶系。 .。可溶性粗制于扰素的获得 .。.分泌型表达系统 可盥接收集培养上清液。研究了用酵母分泌人干扰素,构建的质 粒霹在释母蓥痰壹接会戏氇、破彝 予拔素,劳客套分泌搐号编码序列,毙在接篱一耄文赣稼述 葵滚串分滋嚣链子撬索。将墙嚣上溃滚离心,谈除莹髂缨您裁获褥粗制可溶性 干扰紊。 ..。稚分泌箍袭这聚绕 熬露滚程骚塞形式器雀。脊天试受赣蓼交遮霎羝;客毒二醚镶数霆多蓑诲是 形成的原因。假有些蛋白的茵体寝达鬣并不商,硫镳的数目氩很少,但却以甑 涎髂魏形式枣程。越藏类于撬索,霉逮过一室熟蹇法玻蘧,冀心爱雾去缎魏癸睾, 赋上清液即为椒制干扰索。 戳包涵棼缮蕊存程。毯强?蹩嚣援燎貔表逖系统麴~转产嬲。关予趣涵髂形 成视璐,从“豢自质辑叠”的角度出发,认为怒处于半折叠状舔蛋自藤分子煎瀑 台髂脚。基予包涵莽靛特性,对形或镪涵髂数予技素,蓠先要选用一定的方法破 藤常蠲高压訇浆法、麓声波攘荡法簸溶蓠酶法,低遽离心藤分离爨镪涵舔, 然蜃髑燮牲刹翔盐黢臁、承豢、十二烧基磺簸钠等搬提出包涵转中的于扰索, 霉选择遥当静条律霞窝缝干捷豢复程,默狡黉箕鑫然的空藉捺爨狡态,袋秀暴商 良好潞解度的糖制干扰素。 .膨胀床暇附层毫『疑其巍生化分离中的应用 照麟技术楚生化分离中最常用豹方法之~,传统屡擞的最大缺点艘不能处理 台磊榷游瓣液,蠹蒗逡遽释不蕊蕊采藤瓣最麓攀方法楚凳瑟瓣鼗瓣裁整按与藤辩 液在搅拌罐中混合来吸跗目标产物和漩化床吸附。憾这些方法分离效率著不缎 懿精鍪屡瓣羧 嵩,舞使分离逶程曼趣台莲;一静豫之凳黪藤藤 术在九十年代问世,它通过改进吸附剂本身的物理特性和经过对层析植的仔纲设 诗,褥瓣了稳定裁遮滋壤孛熬流琵藤。骚篦较释褰逶谴鼹藩簌粒逶蘧藤屡,叉胃 设计了~个特别的 以填充床的模式来吸附目标产物。年,幂 滚藩矜礤器,袋瓣黄蕊羲骧豢蕤凄器套豢形戴了器袋辩。运这饔装羲楚霪蛋巍壤 和细臌混合波,颗粒溅过层槲荆床层诮不造成阻塞,熊层析性能基本与填充 床相 嚣。年, 公簿专门竣诗黎懿恣了蔽辩裁蠢黪骚蒸装嚣, 取名为,其内桉为石藏砂,外筒包了~层琼脂糖基质,吸附剂的 密塞:隧热霪黢霹羲涌慧,羲辩熬黪羧绞遴毒穰簇簧要寒赣备,这襻鬣艇豫琶爨辑 在高流速下避行,又不影响介质的吸晰性能。 公司的邈~ 蔑臻,镬褥运鼹瑟羲袋零塞接援鼙菠孛啜爨秘麓步热能萋稼袋鑫盛灸爵戆。这秽 膨胀脒技术可以把生物制品下游过稷中的预然理、浓缩和产物捕获几个步骤巢成 予一个肇嚣搽槔孛;犬太懿减少了撩捧步骤,堤裹产滠羧搴,簿鬣缝纯费臻。第一牵文献塔滩 .,黪强瘫鞭辫嚣毽 律为~种特殊形式的流化床,膨胀床兼裔了阉定床和流化床的优点。膨胀滕 粤濂能藤翡最大送裂怒瀛稼黪啜醚裁粒子蓦零港悬浮在黪滕窳斑斡淘定燕鹫 上,固液相间轴向混合糨腱较低,流体以接近活塞流的方式流疑床层,从而获得 嶷葑鳓分黉慕慕。黪蘸藤与瓣定藏嚣嚣鬟在予:黪酝袋黎疆裁装麓瀛发调节器, 滚动骚麸褒癔渡咎分枣舔羧入,彩骚臻赣套鞍瓷靛窒蹶率,泰凄疆醛,、,霹戳竞 诗耱滚窜缨魏、缨藏碎片薄弱蒋黢粒瀚逶遘,势童蔽舔裁藜瓢爝攀滗,分褰效率 高。 程膨鞭凑攘传串,辩瓣渡激速麓逡撵痉瀚怒竣下关系;激瓣裁熬最低淡 亿速率《避料速率吸辩荆嬲终端速率;进糕速率杂质微粒的终溺遮率。谯 雾黢寨掇雩孛,瓣滚获鬻鞭藤褒篓鑫嚣主逶入,堂这囊一囊流遮瓣,霖瑟瑟魏 膨胀,此时的流速称为吸附黼的最低流他速率 : 髓罄滤滚熬增蕊,凑瀑开熬澎张,瑕黔裁籁麴窝踩增丈,瓣渡中悬浮媳杂覆徽糙 可以穿疆床层空隙流出。而目标产物被吸附强膨胀床内的吸附荆上,从而实现料 滚豹豢按分离;当藏遮避~疹熟增热,啜驸剖开始被带趣拄努;搬对麴滚速穆为 啜辫裁瓣终臻速率 ?粥。 程澎骚痣撩终孛,最低流纯速率 泌稻终端速率骐可鞋分霸缀攒下式遂嚣 计算社% ‰篓二窒童 秽。。?? ‘ “ ..麟涨奔蕨 瑚飙神【糊掇掇火量的实验研究,总结出用予膨胀床操作的吸附荆 应满遐的六磺萋奉要求;暇辫裁麓足寸帮密波痊糅芷萁终端流遮与辩滚中需 豫去麓滔形黢歉瓣考骥嚣艇蓑巽;?啜辫裁爨缀鸯~定豹羧经翱密发羚布,程 廖鼗臻斑会辫成稳定鹣分缀,欤瑟减枣霹滚糨阕鳇运灌;?壤辩裁疲其毫淹赔 的孔道结构,不易被料液中的月旨类、核酸和杂瀑白等生物物滕污染;吸附剂第一章文献综述 痤美套溪缓蘩鋈,霉鑫修馋爨露特异注蔽隧教鬣蒸,使蔽瓣蠢对磊椽产物具有较 高的吸附容羹;吸附弃鹰赋有较高化学稳定饿和良好机械强度,熬中较高的 化学稳定性可以保证吸附剂可以承受较苛刻的洗脱条件,而良好的机撇强度可延 长吸附剂的使用寿命;吸附剂应具有良好的传质性能,在较高的流速下。可 以保持较离静吸附量。 棂豢公式网,搬襞象示,颗簸戆终壤滚速与鬏粒秘誊径、霾 辐与液稽嚼的密度差成正眈,譬液相粘度成反魄。膨胀介质的粒经过小,在实际 操作时为溅免膨胀率过高,所用的流速较低:粒裰避大,目标产物的扩散路径较 长,造成吸附量的下降,分离散率降低;膨胀介质的密度越高,终端流速也就越 高,操作时流速有较宽的选择范围。研究表明,,具有一定粒径和辩度分布的 澎强分矮,农流传终惩下,在藤内可鞋形藏稳定豹分级,太粒径亵窝密瘦分痿势 布予床瑟底部辫近,露小粒掇帮低密度介质集孛程床层的顼部,腻丽傈诞膨胀床 内的混合稳度较低。 ..膨胀床的装置 除特殊设诗熬吸瓣裁外,膨簇床还露要骞专设诗豹装置。蓠先,为绦迁流 体戬遥像乎雄流豹形式逶道藤蒺,必须在麟涨床的入口处设诗一个流体分布器。 流体分布器应保证床截面的流速分布均匀,尽爨减小由于液体的不均匀分布而导 致的淘流和其它不规则流动,并且允许料液内的阉形微粒,如菌体细胞或细胞碎 片通过,而对吸附剂则具有裁留作用。其次,在膨胀床操作过程中,瀚度调节器 的整鬟旋惨好位于寐媛的顼部娃臻小死俸积,劳飘可强莰揍嚣要改变位鼍。另癸, 岿骚廉熬缴辩柱浚诗霹黪获藤啜鼯有重要影穗。蠢学者【瑚在蔽辩柱凌设鲞挡板, 将床分为几个区域,用来减小膨胀介质在液相返擒程度,以提高吸附效率。 等的研究寝明口们,吸附柱的瓣盥度严重影响膨胀床内的液相返混程魔,即 使吸附 柱的垂囊媵仅有. 的偏麓,膨胀床内的肋凇数相应的由降到,表明 床内返滋稷发会有显著增加。 ..掰服床搡作特点 由于在生物分离过程中潺常涉及到细胞或细胞碎片的分离、浓缩、粗分离和 纯化等步骤以及膨胀床本身所嶷有的特殊床层结构,其吸附操作方式与固定床操 作不尽辐筏,一般大蘩分为嚣个除段,平饔、吸戳、清洗、洗脱移谯像滇洗。典 鍪豹搡铭溅疆如下鬻?瑟淤:第一牵文欺综述 攀衡 在簿次膨胀床吸附操作前威先自下而上通入平衡缓冲液对填充吸附剂的床 缮进行膨黻,当寐层爨遮稳定膨强离凄时,继续澎酝 ,良港陈不稳是 流动所带来的液相返混。而且在膨胀过程中,膨胀床需鼹有适巍的膨胀比,膨胀 魄遘低,会遥戒鹋滚中潮俸霰救遁过载瓣难;澎繇比过态,瓣会造成蠢麓对嚣繇 产物的吸附效率下降。研究表明,膨胀床吸附操作中最适宜的膨胀比为.。 冀羚,澎涨瘫内啜醛裁熬壤充怒蒗应在 戳上,以漤除送霸送壤不均匀渡他 的影响,这样刊’能得到稳定的床层和较低的返混程度九。 翳定床 平赣 暇咐 清洗 粒定寐方式洗疆 撵账瘫方式洗髓盎经涛漶 图膨胀床吸附操作过程. 。 ...吸附 当窳层达弱稳定黪胀嚣,逐速将平衡缓渖液锈按戒糕滚,密于瓣滚鑫奄糙度秘 密度高于平衡缓冲液,蒋维持原来操作条件的不变,膨胀床的床层高度就会发生 嶷纯。嚣筵,为绦持黪黢程度不变,篱鼗簿诋溅速竣保持寐裹;嚣在啜辫操俸豹 后期,由于膨胀介质吸附蛋白质、细胞、核酸等生物物质,密度又会肖所增加, 魏薅又嚣簧舞蹇滤逮来维持器膨胀裹瘦。在实鬻毅隆掇俘孛,毽霹疆采蠲维持滚 速不变,根据膨胀高度的变化,调节膨胀床内的高度调节器。和 跑较这溪耪操撂条终黯 瑕辫溶蓑薅魏裁态蔽瓣容量熬影桶,研究 结果表明:采用改变流速,保持膨胀程度的操作方式效果更好,这样可以获得较 褰熬动惫疆錾骞量。第一章文献综述 ,。。瀵洗 在料液上样吸附过程中,吸附剂内外不可避免的残留部分料液和吸附~些杂 菝。困魏,在对秘标产物静洗聪虢,应该先进符清洗操作。一般清洗操《乍采瘸膨 胀床方式进行,维持上榉流速,以缩短操作时间。清洗液采用平衡缓冲溶液【”, 氇可鼓粥裹糕凌懿缓渖液,翔%/曹、洼溶滚。袋羯嚣纛霹醴减小潘洗液 的用量,间时保证清洗波以更接近于活寨流的方式通过床层,以取得良好的清洗 效果。 .。。浚脱 洗脱是分离纯化的关键步骤,在采用膨胀床对目标产物的纯化过程中,通常 霹疆采蠲静洗聪方式分为霞定霖叁上锰下葶拜澎酝床鑫下往上方式洗麓, 如上图所示。对洗脱方式的选择是根据实际情况而决定的。一般来说,如果 蔽嚣季麓与基标产锈之阉熬骧辫佟溪力较弱,被吸辫靛携菠主蘩集中在臻嚣遂翻 处,一般应采用固定床方式进错洗脱;而吸附作用力较强时,目标产物被吸附在 整令雾涨床中一般应袋蠲澎骧痣方式洗魏可熊更有效。 研究表明,邀两种洗脱方式在实际应用中备具特色。采取固定床方式洗脱可 疆减小洗残滚豹建量,增掇产秘豹滚度,弱嚣毽哥强蘧灸基标产魏戆过渡稳释【拍, 卅。而采用膨胀床方式洗脱的优点是:洗脱过程简单,洗脱迅速; 不会造成吸驸劐颓粒豹妖聚;洗残设备蕊肇;哥班实瑷连续优生产。嶷蛙清洗? 在位清洗是膨胀床操作中一个重要步骤,包括吸附荆的再生 帮鬻羰寐靛港毒。疆辫麓舞秀叟楚维持墩辩翔鹣羧辩髓力稻确缣 所有杂质都被清除的必要环节【?。膨胀床吸附技术通常用来直接从含有细 胞、 缁藏薄片等困舔籁粒錾精滚孛缝健嚣搽产耱,联戮骚醛裁容易受弱糕滚中瑟含缀 胞、细胞碎片、脂类和核酸等杂质的污染,特别是特异性较差的介质,这些杂腋 虽然经篷滂洗、洗聪瞧缀难猿冷。这缝缓会造裁奔矮懿蔽爨容爨簿蜒,严重时避 会导致吸附剂的集聚,出现沟流,影响膨胀床的混合特性。因此,在洗脱操作绐 寒爱,吸瓣剡必须避露嚣生操露,班羧笈其淀倦宓学积吸辫性缝,以璞在下一次 分离操作中继续使用。另外,吸附剂再生时,礴生液的选择应该注意不会破坏【觋 嫩裁土豹配基,这榉可以延长趿默裁静使用寿念,对整令分离缝纯过稷艘本的蹲 低起到至关重要作用【,”。 在膨胀瘩吸附操乍瑶,除对吸附荆辫生,逐应对整个吸附毒主进行消毒。第一嚣文献综述 等辩谈必膨胀廉戆消毒工慧是荚蓉到鼹其分离缝他褥墅戆产懿戆爱投放枣坜的 一个主骚方面,由于其消毒工艺的不过关会导致膨胀床赢接纯化得到的产品很滩 镣台 豹撂壤,爨不曩说憝通过韵认 涯。 裁膨胀庶吸附层辑的鹿弼嶷铡, 霹撩鬣自 辩渍 敷辩帮 皎攀纯乏嚣予文蘸 .。膨胀藤瑕隧的痰麓 近魑年来,随着新溅吸附剂和膨胀装置的歼发和谈计,膨胀床吸附技术奄篁 兰 物鸯工过程中褥到越来越广泛麴应用,妇蛋自质挝纯,、抗体纯化、细臌 势褰霹、缝谯秘、鼷戆酸癸弹罐秘分瓣陬等方嚣。尽蛰嚣羲诲多 应瘸还彼隈予实验室规搂,但嚣经商~些中试袋鼹智囊产规模鹣应用实例陬 的 。例如,荚隰公司利用畿径为. ,墒究 骢 介矮,从细胞发酵滚巾盥按提纯~种重缎单竟隆抗 体,一次秣怒瑾瓣滚蔼麓这 ,缝纯嚣予戈,产物渡率麓运%弘。 膨胀廉实际应用的例子很多,在液.中总结了近年来膨胀脒吸附技术在生 物分离领域的应用事例。 .巯水性髅糈及冀在堂能分离巾的应需 .。巯水键罄糯昀基本藤壤 生物物溪,茏其爨援鑫矮大豁窘糍~霆虽戆藏承瞧基霞,程承溶泼孛,爱盘 质的袭面被祭水层包嘲,疏水性基团大多包埋于分予内,但是仍有一部分疏水性 萋鞫暴露在豢童囊表瑟螂,这黎分蘸承纂透露浚与暇辫奔霾袭嚣镁裴黪蕊基、豢第一章文献综述 蒸等蔬求罄发生提互终髑,蔹魂东蛙豹吸附剡鼹暇辫。南予不同躲蛋自壤其琉水 性不同,因此,可以利用这一性质实现蛋白质分离。能够用疏水脞层析方法分离、 缝健豹蛋皇矮静类报多,其分子爨范匿可达到从左右的胰蕊素到万以上 的红细胞和淋巴妻珊胞【“”。 年,在其论文中指出,蛋白矮和一些物质会在中性的高浓度 捻溶液中发生赫析,但在低于盐析浓度的溶液中,它们会与一些吸附帮发生相当 强烈的吸附,并飘某些吸附剂在盐溶液中对蛋白质没商吸附或吸附很弱,但在 中等盐浓度下却会发生明显的吸附。他所提出的现象奠定了疏水性层析分离方法 以】 的基础。年】和明确提出疏水性层析的概念。 等人认为生物体眈永其裔更低的舞面自;能,在承溶液中它们或多或少与低表露 能的吸附剂表面产生范德华引力,这个力随溶液盐析能力的改变而改变,当 流动 稽中盐浓度逐步降低爵,范德肇等力逐步交小,当盐浓度下降到一定纛凌鞋重,溶 质和配基之间的范德华引力变为斥力,溶质即从吸附剂上解离。及其 合作者强,蚓磷究了蘸求侄屡拼匏参数之阕鹣关系稻提窭豹“蔬浴翔理论 ”,浚 ”。疏溶剂理论又被称为“空穴理论 遴论认为,当一个菲摄穗溶震或分子中熬菲援镶部分每板性港剂糖接簸辩,稳豆 产生斥力。自由能增加,熵减小,为弥补熵的损失,溶质分子中的非极性部分的 结梅取囱褥导致在辍瞧溶勰串形成一令“空楚”,获露涎者接熬嚣莰增大,这嵇 效应称之为疏水效应或疏溶剂效应。 ..琉水性屡析介赝 巯窳萑层毫蓐余震豹髓覆对予蛋自震等大分子钫震斡羧辩有熏妥彩响。吸鬻介 质的基威应当怒易于保持分子熙物活性的物质,并且同时具备潦水性和疏水性, 疆使其能够与秉承性溶矮撩接皴,又其宥一定戆藏瘩梭,霹数将溶痿吸斑舞箕亵 面。典魁的疏水性层析介质的结构是在基质表面键合一层亲水性物质,然后 再涟 揍特定囊奄蘸隶魏嚣萋搿。键舍熬亲拳瑟《爨是蠢辍势予貘,它熬存在?够避兔灏 基质效应而导致蛋白质失去生物活性。鞲己基种类也会影响疏水性相互作用。随祷 烃基毽瓣增燕,嚣萋滚本性隧之增太搿】,透露譬蛋鑫凌之趣靛熊互接用瞧睫之增 强。基于这一顺序,我们可以结合分离物系进行配基的选择。 铁黢零蛙鼷辑奔囊浆基曩※爱,题据无极硅获、霹控孔渡球等秘有机两 种【,删。以磺质高聚物微球为基质的有机填料是疏水性层析介质中的研究热点 之一,,这类填料包攒交联聚苯乙烯、赣聚糖靼琼 鬟糖等。这署孛基质具寿良好豹 化学稳定性,值应辫范围宽,不容易产生不可逆吸附作用,特别是它与生物 大分子有良好豹生物攘骞性,农分离过程中容爨进行化学改性,可形成多毒中吸戳第一章文献综述 劐。担楚这类填料的规械融压性能比较露限。 疏水性层析介质的一大特点是其配溅具有较弱的疏水性,与蛋白质的作用比 较温和,从面能够很好的保蜜蛋白质鲍生物活性。掌有的蔬水性配基主爱有:苯 基、短锩烷烃~、有机羧酸、烷氮基和商分子配基如聚乙二醇和聚醚 筹。 在疏水性层析体系中,固定相表面黧弱疏水性,流渤稆为商浓度赫溶液。在 这样的两相条件下,蛋囱质分子巾疏水部分与弱疏水性固定相表面发生相互作用 黹被吸附。逐渐降低流渤相的靛浓度。鬣自质按其疏水健的大小被依次洗脱,蔬 水性小的先洗脱,疏水性大的厝洗脱。 ..疏水性屡析的流动相 流渤裙的佼质对蛋白质在硫水性屡孝斤吸附介质上的傈留行为有极其重要的 影响四,它涉及到蛋白脯和盐离子的特殊反应,以及蛋白质的水合作用等诸多因 素。 作为流动相中的一个重要成分,无机盐的存在是必不可少的。常用的盐有硫 酸铵、硫酸链、筑佬钠等。降氐流动相的薤浓寝,洗脱麓力增强。流动楣戆起始 盐浓度对分离脊明显的影响,盐浓度大,容量因子也大,选择性好,峰型尖锐。 ..影响疏水性层析的其鬯因素 流动楣的值中经对傈掩蛋自震的活佳裔誉,毽变傀对蛋自溪的溶孵 度和活性都不利。但当值由增大黛~时,大多数蛋囱质的疏水性会减 弱,膏澍子洗瓣。因嚣:经典巯东惺菇耩普遍采雳降低盐浓度翡霜露遥当增大 的来分离蛋白质。由予在疏水憔层析方法中,礁胶被广泛的用作固定相 基震,穗基霜定穰会鞭大予瓣情嚣下逐渐溶解嚣流失,掰疆嚣在死孚全都采 用中性缓冲溶液。如磷酸盐体系、乙酸一乙酸盐体系和.体系,来保持具 骞薤浓发交纯懿溅动摺瓣僚苓交。 在疏水性层析过程中,温度是影响蛋白质保留值的~个敏感条件。对大多数 蛋鑫爱慕说,在一定蕊毽内,滋覆秀蹇衾攀大蛋白震在蔬承毪麓粝柱串熬绦警德 【?州】,但同时易使蛋白质溶解度变小,生物活性降低。 等久谈袅,在较低戆湿凄落盈蠹,瀑度交他不会零羧蛋白矮撺象发 生变化,蛋白威仍然呈稳定的天然结构。当超过一定温度后,骚白质才开始发生 擒蒙交纯,导致蛋鑫囊表嚣藏承性基嚣增多,与藏承瞧屡援静吸赡裁之阗豹璁承 性作用增强。而陈国亮簿入【 在实验纂础上发现,在温度升高的全部过程中,鬣 岛臻豹梭蒙都会不嚣瑕发豹发嫩变鬟二,只有在较低的瀵度范基内,温度变纯仅涉第一章文献综述 及蛋自竣袭嚣蕊承蛙氮鏊酸残基熬暴露,嚣不涉投蛋自震肽链静静震和蚕邑质透 性中心的构象变化。当越过一定温度后,蛋白质的氨基酸残基在蛋白质表面暴露 褥更充分,甚至发生构象变化,使摄蛋囱质表露筑水性蒸团增多,琉承性乍用增 强。由予蛋白质谯高温下会失活,所阻鬣白质疏水性层析通常都是在相对稳 定得 塑涅或受低温度下进行,尤其是分离热稳定性差搏蛋白成时,应当尽量谯较低的 潞度下进行操作,啦提商蛋白质稳定性。 此外,蛋白质的种类对于其谯疏水性层析的吸附介威上的吸掰寸行为也有影响 硌。亲水和疏水懿基酸都会影响吸附介餍表面上的疏水作用,亲水墅氨蘩酸的存 在及吸附介质表颇上电荷的改变,会使灏白质的吸附能力下降。 .离予交换屡析及其在生化分离巾的应用 离子交换作为一种分离技术~直广泛的应用于污水处理和念属离予的回收 过程中。自从上世纪年代用于分离鬣白质的离子交换剂问毽 以来,离子交换 吸附荆就被广泛的应用于蛋白成纯化领域中。随着高效液相色谱技术和大孔离予 交换荆合成方法的发展,从年代开始的离子交换色谱技术获褥了飞速的发震。 所谓离予交换色谱 ,是以离子交换剂为网 定相,嗣雳适宣的溶裁彳乍为流动稽,禳据流动相中静繁魄溶矮与离子交羧翔之闻 静电作阁力的麓异来达到分离溶质目的的洗脱色谱法。现在,离子交换色谱技术 棱广泛的应瘸在生褥纯王、制药、环保淤及食晶等领域审。离予交换色谱已经黢 展成为了分离和纯化蛋白质、核酸和其它带电缴物分予的主要筝段。 ..离子交换屡析的原理 离予交换啜辩弃在零溶液罴溶张静避程中,位子蔽辩翔夤熬上懿功能基蘸黪 的可交换离子会发生解离。解离出的离予可在吸附剂网状结构内自由迁移。如果 这雾幸溶液孛存在着同耱类壅豹其它离子,它逛哥能钛溶液中扩数到疆瓣翔瓣溺状 结构内。当这两种离子的浓度熬较大时,就会产生一种推动力使吸附剂与溶液主 俸之溺发生等瓷蠢懿褰予交按。上逮交换遘程灸《遂;霪程,经:建一袋霹阗嚣褰予 交换就选到平衡,而在艇个离予交换过程中吸附剂和溶液始终保持电中性。通过 这穗霹递交换嚣蕉戳及鞍辫裁费檠上功麓基与零蓠离子阗静电终焉力熬差吴,霹 以达到对水溶液中带电溶质分离、置换、浓缩蹲目的。蛋白质、多肽、核酸、聚 孩萤酸靼箕毯繁毫生物分褰歪蹩鲡越邋;童褰子交换吸隧剡褥刘了分离缝纯。印负 电荷的溶质可被阴离予交换剂交换;带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换 在过程孛,生躲大分予魏矮懿色谱援黎行为怒一个十分复杂鲍过程,围第一牵文献综述 为,在蛋自质和酶等生物大分子物质匏分蔫过程中,除了静电搏用外,大分子的 形状、大分子与吸附剂表面的疏水作用,氢键以及大分予表面的电荷分布等都对 具蠢很大的影响。研究表明,分配系数主要受离子强度的影响,在离离子强 度下,目标蛋白质基本上不在介质上吸附,所以洗脱是通过增加离子强度实现的, 通常在洗脱时一般采用滚动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法或离子强度 阶越增大的逐次洗脱法。 .。赛子交按吸酶努 离予交换吸附剂是一类带有功能基的网状结构的高分子化合物,包括不溶性 的三维空间网状结构,谶接在骨架上的功能基及功能基酗上所带的相反龟衙的可 交换离子三部分。离子交换吸附剂作为的固定相,除了需娶有较好的机械强 度、亿学和热稳定性颤及均匀蕊整的步形等条律外,还成具备稳定的功能基、较 商的交换容量和较快的离子交换速度等特点。除此之外,那些用于分离缀白质等 生物大分子秘质的离子交换吸附潮还碰其有足够大豹孔径瑷利于物质在颗 粒内 的传质。 离子交换啜辩翔簧絮的主要作用在予为功麓基提供淹好靛潮定场繇,因此箕 本身应巍是惰性的,可以是有机离分子聚合物,也可以熄无机高分子聚合物。目 靛,在蛋白震分藤过程中霉觅鹃离子交羧暖酪荆臀絮卺兹有极聚合魏懿、改牲穗 胶 】和多聚糖,等。吸附制的骨架决定了其机械强度、化学和热稳定性以 及色谱辍审流囊耜豹流韵特性。司嚣李,它还会影响蛋自矮等鞠矮豹璺三羧潘缝。褰 予交换吸附剂的功能基在色谱过程中起着十分羹要的作用,它不仅决定了水溶液 孛溶震与壤瓣藕越交换爱疫静类登、程度耪强弱。阕辩,英数鬃鞠巅矮率迄决定 了色谱违程中吸附剂的交换容最。 ..离子交换层析的应用 褰予交换瑟辑获主鼗纪蠹?年伐嚣始应舔与生貔携蒺懿分蔫中。年, 】对微孔玻璃的内 等【】将引入色谱过獠中用于分离氨基酸。等。 努表覆滋行蘩馋爱接上离子交换基霞,铡残褰予交换裁,趣予分鬻蛋白缓。 等【】在备种多孔硅胶表面键合不同种类的胺制成离子交换剂,发现其交换 能力 蹇,莠娶疑缀好瓣分离簿秘蛋鑫矮。等田将线牲聚会臻接拨到载体粒表嚣, 合成的触角型离子交换荆减少了非离予相互作用,具有交换能力大,回收率高、 选择蛙瓷秘效率裹等我患,适鼷子生物丈分子熬分裹纯他。还纛缀多磺究者捧”” 将离予交换剂用于多肽和低聚核苷酸的分析。等碍利用苯乙烯核乙烯苯 共聚物为基质数骥离予交换剂成功的分离自盘瘸细胞一乙醚基一氨豢葡糖蘸第一章文献综述 瓣豹各秘嗣工酶。慧恧袁之,离子交换热澄具鸯暇赡容爨高,使用方便等特点, 怒蛋白质等生物物质制备型分离纯化中常用的色谱模式。 .亲和层析及其在生化分鬻中的成用 ..亲和层析原理及特点 亲和缮析 是一币孛基于叟物活毪物质与疑它分予 之间可逆的特异性相互作用的色谱分离技术。利用亲和层析纯化拦白的报导最早 见于年,警时发臻淀粉酶可敬被遗撵健遗嗷谢在不溶往淀粉上。憾是由予 亲和吸附介质制备的困难,阻碍了亲和技术的发展。直到年,, 秘渺辩导了含骞蘩氨靛分子可缓被连接裂溪弦薅活纯懿多糖蒸质上割 得亲和吸附介质后,亲和纯化技术才从实验室研究走向缀白质分离的实际应用。 , 口 ?中 卜一卜 纨爹 口 口 。臻穗 ?出螂 积?鲥 蠛。? 证 耐 图亲帮拱揍簸理 亲和色谱分离的基本原理可以用上圈说明。首先将具有特异性识别能力的分 予配豢,霾建曩二在逶当数不游挫载钵土,褥刭亲彝碾戳裁。然嚣在套 利于吸附的条件下,通入含有目标蛋白的料液,目标蛋囱和配基之间通过亲和作 髑瑟被吸辩在墩瓣裁土,嚣杂虽鑫不和啜瓣剡缝合。最后通过诚整缀、离子 强度、温度、或者加入竞争性自由配基簿方式,将纯化后的目标蛋白洗脱下来。 亲鞠色谱技术豹或功应用琴仅要求艇携特爨性配基容易褥到,易于簸定化在 载体上,并且酉己基固定化后必须仍保持其对目标蛋白的特异性泶和结合能力,同 瓣还要求将来结合豹物矮清洗魅,联要的物矮能够被选择性地淡脱下来灏不丧失 其活性。 蛋巍履参与亲和馋罔的枫理尚不十分清楚。一般认为,蛋自质的立体结构中第一章文簌综述 含畜檠壁参与寒露缝台懿罄整,这些结合部穆爨溜貉或凸起麴续掏,能与该蛋白 质发生潦和作用的分予恰好可以进入猁此结构中,即具有亲和作用的分子之间暴 毒“钥匙”衣“锬孔”的关系。这裁怒尽兹普遮认可扮“锬钥学说”,这是产生 亲和结合作用的必要条件。此外,发生求和作糟还需臻以下作灞力中的~稀或凡 羊孛懿辅助下才能实现亲釉缝合。这些圣誊髑力包螨:静电乍媚:氯键: 疏水憔相互作桶:配位键;弱共价穗等。 和以上豹馋用力棚对应,凡是对这烘作用力有影响的因素都有可能封亲和作 用体系的结合产生彩响。主簧裔瑷下影响透索:离予强度,主要影璃静电作 用和疏水性相飘作用:值,通过改变配基和蛋白质上带电基网的离子化 程度对亲稻结合产生黪稳;粹裁鬣键形成鞠耪质,露鞭鞠赫酸弧。主要粼臻 亲和缝台作用力中的甄键:温度,温度的改变使分子和原予的运动剧烈程艘 发生改变对亲帮乍惹产生影舔;鼗羚寇亲纛蒋系中艴入离滚离子帮螯合裁也褥影 响亲和作用力。 奎物秘矮中最熬知秘零冤鹣亲窥襻焉律系之一是酶与冀疯黪、霹逆竞争链捺 制剂以及辅酶,这些体系具有较高的特异性,拱本上魑~对一的关系。而对于大 多蒙鹣寒帮钵系,亲秘侔簿稳不箕冬绝对赘特舜经,谈磐努深凝素霹与任褥各有 糖基的蛋白结懵,三嗪类色素可以和雾种脱鬣黼,激黼以及清白蛋白等结合, 这类亲籁箨系愿予群耪舅瞧索秘镩系。剩秀琶寨为配纂翁亲粒色谱渡称建色素塞 和色谱 。 活犍色素最裙应翅予纺织攮,奉毽鳃六十年我,瞄瓣四等爨然逸 发现虢色葡聚糖和一黪激酶之间存在结合能力,引起了人们的广泛关注。此后又 发瑗豫了 羹溶及箕雾毪棒 ., 鞠 一可以和蛋白质在其核替酸结合位点发生相互作用外,还有一大批活橼色 素秘嚣彦覆吴鸯缝会鼹力;瓠感,色索亲窝鼓寒裁舞始棱广泛建应弱起寒。 荫前应用煅广的怒以 为代表的三嗪类色素,熊结构式如 下鎏爨霖。 ? 武?,挺 阁 分子结构示意图第一章文献综述分子孛酌氯厦子其有较激的瀵性,在碱憾条 件下可以蕈 为离去基闰,极易与含有激基的物质发出亲和取代反应,所以,邋常可阻利用这 个性质憋箕蹋定纯在多糖栽俸土熬得寒黟暇辫分矮蹋予爨塞质豹分藏。爱瘟式始 下: , 丰 乳 一 焱 & 与抟统熬桊鞭体系稳魄,色素亲积爨毒激下髭罄后点;?激性鬯索襄拳馁 窘荔得;凝蓉豹固定偬过程遮速、麓荤,势且不等入有毒斡讫学镪蒺; 铷得的色素激酾啜鬻裁熊褥缀努垂奄稳定住,可鞋缳存数嗣舔不影嘲对蛋皇葳的缀 合能力,并且易予回收利用”。簇于以上优点,色素祭和色谱已发展成为蛋白斌 分离懿霄效漱零悉广泛瘫薅予聪慧酶醐、激酶鳓戳及巍浆粪蛋巍鹩分离缝铯酗。 .色素袈辆嘏豫棼 在逃特嶷辩紊秘暇辩攮筝审,逶露懿簧薅囊萋共徐璃联在菜耪不溶蠖邂体豹 表覆我肉肇《褥亲秘戳辫夯震,该匿髂粒子逶鬻称为酝基酶载钵。谗为载髂豁 阉体粒予成诚满足以下髅求: 熬商亲零性多强结秘,无特髯睦毅辩,魄袭嚣鬏大; 魏壤帮证学稳宠经裹,毒较鬻戆撬辕强震,毽焉寿螽妖; 奄蒋霹活纯鹣反应基溪,震予亲襄聚罄瓣豳宠纯; 粒径均一的球膨粒子。 夫部分袋秘戆色素豢鞠啜稳裁罄是然色素鬟定豫在璩鬻耱凝蔽上截霉靛,? 旨糖含爨为哌或%的凝胶应用最为广泛,因为该凝胶具有以下驻著优点: 凝获粒予暴露较,、豹足寸秘较大豹剐拣,可以兔诲袭较麓压力下操终;生蝴 搪容性好,舆霄化学稳定栋,能够承受较苛刻的清洗和褥生条牛;和其它鏊 旗稳院,辩瀑蠡震霞毒较小翡??特异谯啜辫;毒荔予懿墓嫠馋:骧?鹭餐撩 胶内部为开放的网状结掏,使得大多数的蛋白质分予能够进入赫内部,从而可以 敬爆较崧豹暇嫩窖重。鼙一牵文献综述 。色素亲鞠睾用瓣彩响殿素 《,:瘸跫靶色羰既基镦攫 由于在实际的亲和操作中,色素分子通常通过共价键被固定化在某种载体上 麟霉亲辩竣瓣裁,不辘橡溶渡中懿游离热素一样发生交巍移动,凝辍瑟罄与蛋幽 的结合方式在很大程度上将取决于色素觏基的固定化密廉。研究表明【釉】,蛋臼 静薮鬻容藿瑟罄修舔密度瑟壤大嚣增大。然露弱瓣,掺镣塞囊越藤,效啜戮蛋虫 的洗脱媳越困难朔。这种现象被认为是由于在磷修饰密度下,蕊臼与色索之间靛 生了多穗黠会佟建,麸鬻侵二蠹翡续合攫擞紧密隅。该理论能够焉寒解释诲 多实验现象,假楚也有例外,‘在研究色素与~种热稳定性的甘油激 酶亲窝啜醛对发堍,在修馋密度避襄和过糕辩,酶豹洗脱都非常翅难,表明存在 一个最健配基修饰密度范围。濑过上述例子说明,对予不同的体系,酾基密度的 影璃绪凝连寿羲舆; ..鬻孚强度 在影响色索亲和作用的诸多因素中,对离予强度影响的研巍比较广泛。由予 潘注琶紫分子中溪骞多个磷酸蒸蕊投健莲整,叉育葱醌环终为浆投幢蒸嚣。霞戴; 和蛋白质之间进行结食时既可能存在静电相互作用又可能存在疏水性稍互作用。 楚茭对于某些爨鑫,羲存在一些部短菇娃窝磺聚基遂过静逛搬互睾爝没生结台, 同时又爨露出某些非极性的位点,和多游环之间产生疏水性相氨作用。对此,通 棠逶避改变莓紧离子强度熬方法寒识舅《起主要影旗豹佟瘸力。】认为 如果蛋自可阻用盐洗脱