灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α, IL2 mRNA表达的拮抗作用 .doc

灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α, IL2 mRNA达的拮抗作用 .doc 灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL 1α, IL 2 mRNA表达的拮抗作用 作者:张群 雷林生 余传林 吴曙光 【摘要】 【目的】观察灵芝多糖(GLB)对前列腺素E2(PGE2)抑制小鼠脾细胞增殖及IL 1α、IL 2 mRNA表达的拮抗作用。【方法】采用混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖程度，半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)法检测IL 1α及IL 2 mRNA的表达水平。【 结果】PGE2连续作用48h后，脾细胞增殖反应受到不同程度的抑制作用，当PGE2浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P,0.01);固定PGE2的浓度为20 μmol/L，并合用不同浓度的GLB(25、50、100、200mg/L)，当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2(20 μmol/L)的抑制作用(P,0.05);培养8h及12h后，PGE2(20 μmol/L)可抑制IL 1α及IL 2 mRNA的表达，GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用(P,0.05或P,0.01)。【结论】灵芝多糖可部分拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞增殖及IL 1α和IL 2 mRNA表达的抑制作用。 【关键词】 灵芝多糖/药理学; 肿瘤/中药疗法; 肿瘤/免疫学; 细胞培养 灵芝〔Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr. Karst.)〕是灵芝菌科灵芝属真菌。文献报道〔1-3〕，灵芝多糖(GLB)是灵芝中主要的生物活性成分之一，其主要的药理作用为增强免疫功能和抗肿瘤。目前其抗肿瘤作用的机制尚不清楚。肿瘤逃避免疫监视的机制比较复杂，其中之一是有些肿瘤细胞能直接分泌〔4-5〕或刺激巨噬细胞〔6〕分泌前列腺素E2(PGE2)，后者可对免疫系统产生广泛的抑制作用。藉此，肿瘤得以逃避免疫系统的攻击，在体内无限生长。本研究观察了灵芝多糖对PGE2抑制小鼠脾细胞增殖及IL 1α和IL 2 mRNA表达的影响，探讨灵芝多糖的抗肿瘤免疫学机理。现报道如下。 1 材料与方法 1.1 动物 C57BL/6j及BALB/c小鼠(SPF级)，8,10周龄，雌雄兼用，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号分别为:2005A044和2005A046。 1.2 药品与试剂 RPMI 1640培养基(GIBCO公司产品);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司产品);HEPES(MDBio, Inc分装);四甲基偶氮唑盐(MTT)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、前列腺素E2(PGE2)均为Sigma产品;RNAoutTM(深圳市华氏生物技术有限公司产品);傻瓜逆转录(RT)反应体系〔AccuPoa Scientific 公司);AB 120型电子天平(美国Denver Instrument公司);连续波长酶标仪(Bio RAD公司);CS 15R台式低温高速离心机(Bechman公司);PTC 100TMPCR循环仪 (美国MJ Research. Inc.公司);Po处的光密度(D570)值表示。 1.4.3 总RNA提取 根据试剂盒说明所提供的按比例缩小进行操作。于96孔板中，每孔加RNAoutTM试剂40μ,，每组收集10孔裂解液于0.5m,Eppendorf管中，提取总RNA。 1.4.4 逆转录反应 DEPC处理水配制的Oligo dT18 (10 nmol/L)与DEPC处理水配制的总,,, (0.1 mg/L)按体积比1?1混合于Eppendorf管中，70?孵育5min，,?冷却,min。吸取上述混合液20μL加入AccuPoin离心3s，置PCR循环仪中反应。反应参数如下:42?、60min，94?、5min。 1.4.5 PCR扩增 PCR引物采用在线软件Primer 3进行。小鼠IL 1α:上游引物 5’ GCATCCTCACAGCAGGATTT 3’，下游引物 5’ GAATCCAGGGGAAACACTGA 3’，PCR扩增产物为354bp。小鼠IL 2:上游引物5’ AAGCTCTACAGCGGAAGCAC 3’，下游引物5’ TCATCGAATTGGCACTCAAA 3’，PCR扩增产物为348bp。小鼠β actin:上游引物 5’ CCAGAGCAAGAGAGGTATCC 3’，下游引物 5’ GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA 3’，PCR扩增产物为216bp。经预实验发现IL 1α和IL 2 mRNA的表达丰度约为β actin的1/5左右，为了使被检测基因的扩增速率与β actin的扩增速率基本一致，均处于指数扩增范围从而防止平台效应，在进行β actin基因扩增时，将逆转录第1链cDNA 产物稀释5倍，其他条件与被检测基因相同，操作如下:在PCR PreMix 管中加入消毒双蒸水8μL, 被检测基因mRNA逆转录产物2 μL或内参β actin mRNA逆转录产物经5倍稀释后2 μL，相应的上、下游引物各5μL(15pmol)，振荡混匀，加石蜡油15μL，1000r/min 离心3s，置PCR循环仪中反应。反应参数如下: 94?预变性2.5min, 然后进入以下28个循环:94?变性45s，57?退火1min，72?延伸1.5min。循环完毕，72?延伸5min。 1.4.6 半定量分析 取被检测基因和β actin RT PCR扩增产物上样于20g/L琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5g/L)梳孔中，采用0.5倍Tris 硼酸电泳缓冲液，在3V/cm电压条件下电泳50min。将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中，在紫外线照射下测定PCR扩增产物的荧光强度(I)值。结果表示为:p=〔I检测基因/(Iβ actin×5)〕×100%。 1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。混合淋巴细胞培养反应数据的显著性差异采用独立样本t 检验;PCR半定量数据采用配对样本t 检验。 2 结果 2.1 PGE2对混合淋巴细胞培养反应(MLR)抑制作用的造模浓度 将C57BL/6j及BALB/c小鼠脾细胞按体积比1?1混合作为MLR模 型，PGE2连续作用48h后，小鼠脾细胞增殖受到不同程度的抑制作用，浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P,0.01)。根据表1结果，选择PGE2抑制模型的造模浓度为20 μmol/L。2.2 GLB拮抗PGE2对MLR中脾细胞增殖的抑制作用 在MLR中，固定PGE2的浓度为20 μmol/L，再加入不同浓度的GLB(200、100、50、25 mg/L)，观察GLB对PGE2的拮抗作用。培养48h后，当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用(P,0.05)，但不能恢复至正常水平，结果见表2。 2.3 GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL 1α mRNA表达的拮抗作用 培养8h后，GLB(200 mg/L)可明显促进IL 1α mRNA的表达，而PGE2(20 μmol/L)抑制IL 1α mRNA的表达。两者合用，GLB为100、200 mg/L的浓度时均可部分对抗PGE2对IL 1α mRNA表达的抑制作用，结果见图1、表3。 2.4 GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL 2 mRNA表达的拮抗作用 培养12h后， GLB(200 mg/L)同样可以促进IL 2 mRNA的表达，而PGE2(20μmol/L)产生抑制作用，结果两者合用，GLB(100、200mg/L)也可部分对抗PGE2对IL 2 mRNA表达的抑制作用，结果见图2、表4。表1 PGE2对MLR中小鼠脾细胞增殖的抑制作用统计方法:t检验;?P,0.01，与阴性对照组比较 表2 GLB拮抗PGE2对MLR中脾细胞增殖的抑制作用统计方法:t检验;?P,0.01,与阴性对照组比较; ?P,0.05，与PGE2组比较表3 GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL 1αmRNA表达的拮抗作用统计方法:t检验;?P,0.05，?P,0.01，与阴性对照组比较;?P,0.05，?P,0.01，与PGE2组比较表4 GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL 2 mRNA表达的拮抗作用统计方法:t检验;?P,0.05，?P,0.01，与阴性对照组比较;?P,0.05，与PGE2组比较 3 讨论 肿瘤发生发展的机制十分复杂，其中有些肿瘤能释放出一些可溶性免疫抑制因子，降低宿主免疫力，从而逃避免疫系统的监视。PGE2是众多免疫抑制因子中最重要的一种，合成PGE2的限速酶是环氧化酶 2(COX 2), 许多良性癌前病变和恶性肿瘤中均有COX 2基因的扩增及其蛋白的高表达, 如结直肠腺瘤和腺癌、胃肠上皮化生和胃癌、食管癌、慢性肝炎和肝细胞肿瘤、胰腺癌、口腔黏膜白斑和头颈部肿瘤、腺瘤样不典型增生和非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、光化性角化病和皮肤癌、胶质瘤等〔9-10〕。有些肿瘤除了本身合成和释放PGE2以外，还刺激宿主巨噬细胞产生PGE2〔6〕。可见，产生PGE2抑制宿主的免疫功能，从而逃避免疫系统的攻击是众多肿瘤得以无限生长的重要机理之一。PGE2对免疫系统的抑制作用广泛而深重，如抑制白介素1(IL 1)〔11〕和白介素2(IL 2)〔12〕的产生等。 在特异性免疫反应中，巨噬细胞在呈递抗原的同时，合成和释放IL 1，IL 1再作用于T辅助细胞产生IL 2，后者产生广泛的免疫调节作用，包括促进前体细胞毒T细胞的活化，并分化为具有杀伤活性的效应细胞毒T细胞(Tc)，Tc在肿瘤免疫中发挥重要作用。 混合淋巴细胞培养反应(MLR)是同种异型抗原诱发的特异性免疫反应模型，具有特异性免疫应答的一般特征，实验操作简单、方便，得到的结果具有较好的指导意义。本研究结果显示PGE2可抑制MLR中小鼠脾细胞的增殖，抑制IL 1α和IL 2 mRNA的表达，这些结果与以往采用其他模型的研究结果相一致〔11-12〕，说明本研究的模型是可靠的。 灵芝多糖的免疫增强作用和抗肿瘤作用已得到广泛的研究和证实，但其抗肿瘤作用机制尚不十分清楚。本研究发现GLB在100 mg/L以上时可部分对抗PGE2(20 μmol/L)对小鼠脾细胞增殖和IL 1α、IL 2 mRNA表达的抑制作用(P,0.05)，提示灵芝多糖对产生PGE2的肿瘤进行辅助治疗具有一定的临床意义，也提示灵芝多糖拮抗PGE2的免疫抑制作用可能是其抗肿瘤作用的免疫学机制之一。【