内毒素对去卵透明带2_细胞小鼠胚胎体外发育的影响_cropped

内毒素对去卵透明带2_细胞小鼠胚胎体外发育的影响_cropped 内毒素对去卵透明带 2 - 细胞小鼠胚胎体外发育的影响 1 1 3 211卢丽华朱伟杰李 菁 钟 瑜 张春雪 ()1. 暨南大学生殖免疫研究中心 2. 暨南大学医学院 ,广州 ,510632 摘 要 : 目的 观察不同剂量浓度内毒素对去卵透明带 2 - 细胞小鼠胚胎体外发育的影响 。方法 获取小鼠 2 - 细胞 胚胎 ,用胰蛋白酶法去除卵透明带后 ,分别臵于含有 0 , 1pg/ ml ,5pg/ ml 和 10pg/ ml 内毒素的 CZB 液滴中培养 ,此外 ,用蛋白酶 法去除卵透明带 ,在不含内毒素的 CZB 液滴中培养 ,观察胚胎体外发育情况 。结果 用胰蛋白酶法去卵透明带的 2 - 细胞小 () ( 鼠胚胎 ,其囊胚率随着培养液中内毒素剂量的增加而降低 ,且 5pg/ ml 和 10pg/ ml 时与对照组 不含内毒素相比差异显著 P ) < 01001。在有内毒素存在时 ,停滞在 2 - 细胞或 4 细胞期的胚胎彼此分离排成列 ,不再呈球形 。部分卵裂球出现空泡或碎 ( ) 裂 。另外 ,用蛋白酶法去除透明带的 2 - 细胞鼠胚的囊胚率为 6117 % ,显著低于胰蛋白酶法的 7318 % P < 01001。结论 微量内毒素即明显抑制去卵透明带 2 - 细胞小鼠胚胎的体外发育 ,并现出剂量效应 ;去卵透明带 2 - 细胞小鼠胚胎试验可 应用于培养液的微量内毒素检测 ;胰酶法去除卵透明带后胚胎的囊胚率优于蛋白酶法 。 关键词 : 内毒素 ;质量控制 ;胚胎 ;小鼠 ;卵透明带 ;体外培养 () 文献编号 : 1006 - 9534 200302 - 0089 - 03 中图分类号 : R32111 文献标识码 : A 1 1 3 2 Effect of endotoxin on the development of zona - free t wo - cell mouse embryos in vitro. L u Lihua, Zhu Weijie, Li Jing, Zhong 1 1 ()Yu, Zhang Chunxue1. Center f or Reproductive Immunology Research 2. Medical College , Ji nan University , Guangzhou ,510632 Abstract :Objective : To investigate the effect of endotoxin on the development of zona - free two - cell mouse embryos in vitro . Methods : Zonae of two - cell mouse embryos were removed by 011 % of trypsin. Then the embryos were cultured with endotoxin - free ,1pg/ ml ,5pg/ ml , and 10pg/ ml endotoxin in medium. In addition ,015 % of pronase was used to remove zona ,and the embryos were incubated with endotoxin - free in medium. The development of the embryos in all stages was observed. Results : The development of the embryos whose zonae were re2 moved by 011 % of trypsin was inhibited by endotoxin in a dose - dependent manner. Comparing with the control group ,the developmental rate ( ) of blastocysts were significantly lower at the levels of 5pg/ ml and 10pg/ mlP < 01001. Embryos mostly were blocked in 2 - cell or 4 - cell stage ,and the blastomeres were separated each other or in row and showed more fragments and vacuoles. However ,the developmental rate of ( ) blastocysts of the embryos which were treated by 015 % of pronase was significantly lower than that of those by trypsinP < 01001. Conclu2 sion :More than 5pg/ ml endotoxin inhibited the development of zona - free two - cell mouse embryos. The development of zona - free two - cell mouse embryos in vitro could be use to measure low level of endotoxin in medium. The development of embryos was inhibited by endotoxin in a dose - dependent manner. The developmental rate of blastocysts whose zonae were removed by trypsin was higher than that of those by pronase . Key words :Endotoxin ;Quality control ; Embryo ;Mouse ; Zona pellucida ; Culture in vitro ( ) ,但在体外 ,小鼠胚胎的早期透明带对着床前胚胎是必需的 内毒素 endotoxin是革兰氏阴性菌细胞壁 的 脂 多 糖 结 5 构 发育在缺乏卵透明带的情况下仍可进行,具有较强的毒性作用 。内毒素在细菌被破坏和自溶时释 。故此 ,有试验将 去卵透 明 带 小 鼠 胚 胎 应 用 于 体 外 培 养 系 统 的 内 毒 素 检 放出来 ,可存在任何空间 、表面和液体 , 难以 灭 活 其 生 物 活 6 - 9测 ,但相关研究尚少 ,国内未见详细评价 。本实验观察性 。以往研究表明 ,人类辅助生育项目的体外培养系统被内 不同浓度的内毒素对去卵透明带的 2 - 细胞小鼠胚胎体外毒素污染 ,可造成所培养的配子功能降低 ,胚胎出现碎裂 ,导 1 ,2 发育的影响 ,以期为体外培养系统的微量内毒素测试提供参 致着床失败。 考性资料 。 检测内毒素水平的方法有多种 ,如人精子存活试验 、小 2 ,3 鼠胚胎的体外发育试验和地鼠精子活动力实验等。其 材料与方法 中 2 - 细胞小鼠胚胎体外发育成正常形态囊胚试验是体外 一 、实验材料与处理 受精质量控制的常用方法 ,但有研究认为其不适用于微量内 2 实验用清洁级昆明系雌性小白鼠 ,4,5 周龄 ,18,20g ,毒素。 雄性 10 , 12 周 龄 , 25 , 30g 。培 养 用 CZB 液 按 Chatot 配() 卵透明带 zona pellucida是一层包被在卵及着床前胚胎 1011 4 方 ,冲胚和洗胚用 M液按文献配方, 用 五 蒸 水 配 制 , 2 外的糖蛋白 ,参与受精及着床前胚胎的发育。在体内 ,卵 ( 调节 p H 为 712 ,使用前加 15 %的胎牛血清 FCS ,杭州四季青 ) ( ) 公司;内毒素 E. col Serotype O55 :B5 ,Sigma 公司;胰蛋白酶基金项目 :广东省科技攻关资助项目的部分工作 ( ) ( ) 3 通讯作者Gibco 公司; 蛋 白 酶 Hyclone 公 司 ; 一 次 性 塑 料 培 养 皿 (Φ( ) ) 3min 后 ,胚胎的卵透明带就已脱落 ,部分胚胎卵裂球分开或35mm ,FALCON 3001;石蜡油 Sigma 公司; 所用玻璃器皿 均在 180 ?干热灭菌 2h 。 皱缩 ,选卵裂球无变化的用于培养 ;011 %胰蛋白酶 37 ?,5 % 二 、实验方法 CO培养箱中与胚胎孵育 8,10min 后 ,胚胎的透明带有的已 2 1. 去卵透明带 2 - 细胞小鼠胚胎的制备 :雌鼠购回后常 脱落 ,卵裂球无大变化 ,少数卵裂球出现分离或皱缩 ,有的透 ( ) 规饲养 1w ,于下午 5 :00 腹腔注射孕马血清 PMSG10 IU/ 只 , 明带涨大 ,表现为卵周隙变大 ,选卵裂球无大变化和卵周隙 ( ) 48h 后注射人绒毛膜促性腺激素 hCG10 IU/ 只 ,即与雄鼠 1 :变大的胚胎用于培养 。用蛋白酶法去除卵透明带的 2 - 细 1 合笼 ,14h 后检查雌鼠阴栓 ,将阴栓阳性者隔离 ,用于取胚 。 ( 胞小鼠胚胎 ,其囊胚率为 6117 %显著低于胰酶法的 7318 % P 注射 hCG 后 42h,46h 用颈椎脱臼法处死阴栓阳性的雌鼠 , ( ) ) < 01001,其它发育阶段比较并无显著性差异 > 0105, P 取出输卵管 ,自输卵管伞部用预平衡过夜的 M液灌注冲出 2 见表 1 。 ( ) 2 - 细胞胚胎 , 选优良胚胎用 011 %胰蛋白酶 用 PBS 配制讨 论 12 37 ?孵育 8 , 10min, 或 用 015 %的 蛋 白 酶 37 ?孵 育 2 ,去卵透明带 2 - 细胞小鼠胚胎试验是将卵透明带去除 8 3min,酶解去除卵透明带 ,再用 M液洗 3 遍 ,待实验 。2 后的胚胎进行体外发育培养 。本实验采用胰蛋白酶法去除 2. 实验分组及培养 : 实验共分 5 组 ,A 、B 和 C 组 : 内毒 卵透明带后 ,2 - 细胞小鼠胚胎的囊胚率随培养液中内毒素 素含量分别为 1pg/ ml ,5pg/ ml 和 10pg/ ml ;D 组 :不含内毒素 , 含量的增加而降低 ,在 5pg/ ml 时 ,其各个阶段胚胎的发育已 用蛋白酶法去除卵透明带 ; E 组 : 为对照组 ,不含内毒素 ,与 与对照组差异显著 , 其囊胚率为 5010 %显著低 于 对 照 组 的 A 、B 、C 组都用胰蛋白酶法去除卵透明带 。 7318 % ,10pg/ ml 时 ,囊胚率更降到 4615 % 。即在内毒素含量μ将 CZB 液制成 20l/ 滴 ,覆盖石蜡油 ,臵 5 % CO,37 ?培 2 ?5pg/ ml 时 ,已明显抑制胚胎的发育 , 提示去卵透明带 2 -养箱中预平衡 12h,16h 。将洗涤 3. 数据处理 : 实验组与对 细胞小鼠胚胎对内毒素较敏感 ,这可能与胚胎卵裂球的膜直 照组胚胎各阶段发育率的比较采用卡方检验 ,用 SPSS 1010接暴露于内毒素有关 。Luis 用蛋白酶法去除 2 - 细胞小鼠胚 软件包进行数据处理 。胎的卵透明带后 ,在含有内毒素 1ng/ ml 和 4ng/ ml 的培养液 结 果 中培养 ,其囊 胚 率 分 别 为 27 %和 25 % , 显 著 低 于 对 照 组 的 一 、不同浓度内毒素对去卵透明带 2 - 细胞小鼠胚胎体 73 % ,但两种内毒素浓度对 1 - 细胞和 2 细胞胚胎体外发育 外发育的影响 都无影响 ,显示去卵透明带 2 - 细胞胚胎较 1 - 细胞和 2 - 细 不同浓度内毒素对去卵透明带 2 - 细胞小鼠胚胎体外 胞对内毒素更敏感 ,但内毒素含量如此高时 ,1 - 细胞和 2 - 5 发育的影响见表 1 。用胰蛋白酶法去除卵透明带的 2 - 细胞 细胞胚胎的囊胚发育率仍然无影响,可能与其使用的培养 小鼠胚胎 ,其囊胚率随培养液中内毒素的增加而降低 ,内毒 液或方法学不同有关 。 素为 1pg/ ml 时 ,各个阶段的发育率与对照组相比无显著性 本实验中亦采用了蛋白酶法去除透明带后进行培养 ,结 ( ) 差异 P > 0105;5pg/ ml 时 ,4 - 细胞期和 8 - 细胞期的发育 ( 果其囊胚率为 6117 %显著低于用 胰 蛋 白 酶 法 的 7318 % P ( ) 率与对照组相比差异显著 P < 0105,囊胚率仅为 5010 % , ) < 0105。蛋白酶与胚胎在 37 ?,5 %CO培养箱中孵育 2 -2 ( ) 显著低于对照组的 7318 % < 01001;10pg/ ml 时的囊胚率 P 3min 后 ,透明带已脱落 ,但部分卵裂球已分离或 皱 缩 , 说 明 低至 4615 % 。B 和 C 组观察到胚胎发育主要停滞在 2 - 细胞 其酶解强度大 ,对胚胎的损伤较难控制 ,尽管实验中挑选了 和 4 - 细胞期 ,发育阻滞的胚胎形态学明显改变 ,不呈球状 , 卵裂球无明显改变的胚胎进行培养 ,其结果也不理想 。用胰 卵裂球彼此分离或是排成列 ,部分卵裂球成空泡 ,或碎裂 。 蛋白酶与胚胎同样条件孵育 8,10min 后 ,透明带脱落卵裂 表 1 不同酶解法及不同浓度内毒素对去卵透明带 球无变化 ,或透明带涨大使卵周隙增大 , 后者胚胎培养 24h 2 - 细胞小鼠胚胎体外发育的影响 后 ,透明 带 自 然 脱 落 , 选 这 两 类 胚 胎 培 养 , 其 囊 胚 率 可 为 ( )组别 胚胎发育阶段数及发育率 % 7318 % ,提示胰蛋白酶溶解透明带较温和 ,易控制 ,对胚胎的 ( ) 2 - 细胞 4 - 细胞内毒素浓度 8 - 细胞 囊胚 损伤小 ,是较好的去除卵透明带的方法 。 ()()()() 19 17 39 6814 49 8546 80A 1pg/ ml57 本实验表明去卵透明带试验可以应用于培养液中微量 aab() ((() ) ) B 5pg/ ml60 42 7010 33 5510 30 5010 内毒素检测 ,但该试验也有一定局限性 。由于去除卵透明带 abb()C10pg/ ml () () () 58 40 6819 29 5010 27 4615 后 ,胚胎处于非正常生理状态 ,失去透明带的机械支持卵裂 b()D 0 ,蛋白酶法 ()()34 26 7614 23 6716 () 21 6117 球会彼此分离 ,更易出现发育阻滞 ,故对培养液和操作技术 () () () () E0 ,胰酶法 ,对照组65 57 871752 801048 7318 更高 。此外去除卵透明带采用的酶解方法也是重要的 注 :同列中字母 a 注者与对照组相比 P < 0105 ;字母 b 注者与对照组 影响因素 ,实验应完全排除技术干扰后才可用于质量控制 。 相比 P < 01001 ;未注者与对照组相比差异不显著 P > 0105 。 表 3 3,28 天发病者阳性菌株及药敏试验 占阳性菌 检 出 菌 例数 敏 感 药 物 百分比 % 14 2216 表皮葡萄球菌 头孢噻肟钠 、丁胺卡那霉素 、庆大霉素 、哌拉西林 、红霉素 、先峰霉素 V 金黄色葡萄球菌 9 1415 头孢噻肟钠 、丁胺卡那霉素 、庆大霉素 、哌拉西林 、先峰霉素 V 、环丙沙星 1415 9 假白喉棒状杆菌 头孢噻肟钠 、丁胺卡那霉素 、庆大霉素 、青霉素 、红霉素 、先峰霉素 V 917 草绿色链球菌 6 无 肺炎克雷伯氏菌 6 917 头孢噻肟钠 、庆大霉素 、哌拉西林 头孢噻肟钠 、丁胺卡那霉素 、庆大 615 铜绿假单胞菌 霉素 、哌拉西林 、菌必治 、环丙沙星 4 由表 1,3 中我们可以看出多数细菌对头孢噻肟钠 ,丁以表皮葡萄球菌及肺炎克雷伯氏菌为主 。其中表皮葡萄球 25 % ,肺炎克雷伯氏菌占阳性病例 2013 % 。 菌占阳性病例的 胺卡那霉素 、庆大霉素 、及先峰霉素 V 、哌拉西林敏感 。由表 2 中可以看出生后 3 日内感染肺炎患儿致菌以肺炎克雷伯 两者均为机会致病菌 ,近年来该菌所致肺炎有上升趋势 ,其 () () 氏菌 ,草绿色链球菌 , 粘质沙雷氏菌及大肠 埃 希 氏 菌 为 主 。 原因可能为 1新生儿抵抗力差 ,以上菌易感染新生儿 。2出生 3 日后感染肺炎患儿致病菌以表皮葡萄球菌 、金色葡萄 由于近年来抗生素的应用 ,导致肺炎致病菌谱发生变化 。 球菌及假白喉棒状杆菌为主 。有羊水吸入者 , 细菌培养阳性 率 为 100 % , 提 示 羊 水 吸 入者易合并细菌感染性肺炎 ,因而对羊水吸入者预防性应用 讨 论 抗生素是十分必要的 。 , 新 生 儿 肺 炎 以 细 菌 性 为 多 见 , 约 占 3112 %, 因条件所限 ,对新生儿肺炎未做病毒学及支原体方面的 在我国 5211 % ,检测肺 炎 致 病 菌 以 指 导 临 床 用 药 具 有 实 际 指 导 意 检测 ,故不除外细菌与病毒 ,支原体共同感染所致的肺炎 。 义 。吸引患儿下呼吸道分泌物做细菌培养具有安全 、准确性 本组肺炎致病菌谱的药敏试验结查显示 ,头孢噻肟钠 、 高的特点 ,能代表致病菌的真实情况 。 丁胺卡那霉素 、庆大霉素 、先锋霉素 V 、哌拉西林对多数细菌 本组患儿气管内分泌物细菌培养阳性率 9619 % ,提示肺 敏感 ,该结果对临床用药 ,治疗新生儿肺炎具有一定的参考 炎患儿其细菌感染的机会大 。 < 3d 阳性者多有胎膜早破 , 意义 。 母亲发热 ,产道感染或窒息复苏史 ,提示为宫内或产时感染 参 考 文 献 的因素 。肺炎致病菌在不同的地区 ,不同时期有所差异 。国 1 黄建伟 ,陶立生. 新生儿肺炎致病菌谱的探讨. 新生儿科杂志 , 外 Bahi 等报道细菌性肺炎致病菌以肺炎链球菌为多见 。国 () 2000 , 5:215 内汪洁等的研究提示新生儿肺炎以大肠杆菌为主 。而郭铭 2 金汉珍 ,黄德珉 ,官希吉主编. 实用新生儿学. 第 2 版 ,北京 : 人民 玉等则认为肺炎致病菌依次为葡萄球菌 、肺炎链球菌 ,革兰 卫生出版社. 1999 :526,532 氏阴性杆菌 。而我们的检测结果却发生新生儿肺炎致病菌 收稿日期 :2002 - 06 - 10() 上接第 90 页 the embryo culture media of human in vitro fertilization and embryo trans2 7 George MA ,Braude PR ,Johnson MH , et al . Quality control in the IVF () fer . Fertil Steril ,1996 ,65 3:614 - 9 2 laboratory :in - vitro and in - vivo development of mouse embryos is unaf2 Dumoulin J C ,Menheere PP , Evers JL ,et al . The effects of endotoxins on fected by the quality of water used in culture media . Hum Reprod ,1989 , () gametes and preimplantation embryos cultured in vitro . Hum Reprod , 4 7:826 - 31 () 8 Montoro L ,Subias E , Young P ,et al . Detection of endotoxin in human in 1991 ,6 5:730 - 4 3 Rinehart J S ,Bavister BD , Gerrity M. Quality control in the in vitro fertil 2 vitro fertilization by the zona - free mouse embryo assay. Fertil Steril , () ization laboratory :comparison of bioassay systems for water quality. J In 1990 ,54 1:109 - 12 () Vitro Fert Embryo Transf ,1988 ,5 6:335 - 42 9 Zarmakoupis - Zavos PN ,Zavos PM. Factors that may influence the mouse 4 Mansour RT , Rhodes CA , Aboulghar MA , et al . Transfer of zona - free () embryo bioassay. Tohoku J Exp Med ,1996 ,179 3:141 - 9 embryos improves outcome in poor prognosis patients : a prospective ran2 10 Chatot CL ,Ziomek CA ,Bavister BD ,et al . An improved culture medium () supports development of random - bred 1 - cell mouse embryos in vitro . domized controlled study. Hum Reprod ,2000 ,15 5:1061 - 4 () 5 Bielfeld P , Faridi A , Zaneveld LJ , et al . The zona pellucida - induced J Reprod Fertil , 1989 ,86 2:679 - 88 acrosome reaction of human spermatozoa is mediated by protein kinases. 11 王敏康 ,张田 ,王晓燕 ,等. 几种克服昆明小鼠 2 细胞胚胎发育阻 () Fertil Steril ,1994 ,61 3:536 - 41 () 滞的培养液研究. 动物学报 ,2000 ,46 1:81,87 6 Quinn P , Warnes GM , Kerin J F , et al . Culture factors in relation to the 12 许华夏 ,崔晓 ,杨抚华. 纤连蛋白抗血清对人精子受精能力的影 success of human in vitro fertilization and embryo transfer . Fertil Steril , () 响. 华西医科大学学报 ,1994 ,25 4:422 - 425 () 1984 ,41 2: 202 - 9 收稿日期 :2002 - 11 - 30 修回日期 :2002 - 12 - 26