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人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体CH13抗原决定簇位点的

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人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体CH13抗原决定簇位点的人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体CH13抗原决定簇位点的 人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体 CH13抗原决定簇位点的 个随机多肤文库申筛选出能与 CH13结合的克】萱,测定上述克隆随机多肤的DNA序列,用随机多肚的氯基馥同鼎序列与PPUL44蛋白质的氯基 酸序列比较.结果:能与CHI3蛄舍的随机多肤的氨基酸序列显示出高度的一致性}随机多肤同鼎序列NEGEAFG— PDVSG与PPUL44蛋白位于第32l,332的氨基酸序列高度同源f而随机多肤序列FQ1LVCVESVLR与PPUL44 位于第181~18...
人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体CH13抗原决定簇位点的
人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体CH13抗原决定簇位点的 人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体 CH13抗原决定簇位点的 个随机多肤文库申筛选出能与 CH13结合的克】萱,测定上述克隆随机多肤的DNA序列,用随机多肚的氯基馥同鼎序列与PPUL44蛋白质的氯基 酸序列比较.结果:能与CHI3蛄舍的随机多肤的氨基酸序列显示出高度的一致性}随机多肤同鼎序列NEGEAFG— PDVSG与PPUL44蛋白位于第32l,332的氨基酸序列高度同源f而随机多肤序列FQ1LVCVESVLR与PPUL44 位于第181~184的氨基酸序列有4个相邻的氨基酸一致.结论{CH13的抗原决定簇位于PPUL44蛋白第32l, 332氨基酸序列附近;CH13与PPUL44位于第181,184氨基畦序列可能有一定反应.随机多肤文库在研究相王 作用蛋白质的氨基酸序列方面具有广泛的应用前景. 关键词全呈PPUL44蛋白f随机多肤文库;氨基醢序列 EpitopeLocalizationofHumanC Hytomegalov~rusMonoclonalAntibodyCH13 RuanQiang,RipahiA,LandiniP,Guo.1injin,LiuQing, WeiHongbin.IiYaohua,XChang (VirusLaboratory.TheSecondClinicalCoLlege,ChinaMedicalUnive~ity, Shenyang,110003) ABSTRACTObjective:Ouraimsweretolocalizetheepitopepositionofamonoclonalantibody(MAb)t CH13,againsthumancytomegalovirus(HCMV)PPUI44onPPUI.44protein,andtofindtheapplicationofaran— dorapeptidedisplaylibraryinaminoacidsequenceanalysisofproteinthatreacttoaknownprotein.Methods:Pep— tideclonesthathavereactivitytoCH13wereselectedfromarandompeptidedisplaylibrarybydirectlyusingmono— clonalantibodyCH13TheDNAsequencesoftheserandompeptidesweredetected.Thehomologyaminoacidse— quencesoftherandompeptideswerecomparedwiththoseofPPUI.44protein.Results:Theaminoacidsequences ofpeptidesthatreaciedtoPPUL44MAbCH13showedhighlyhomology.Thehomologousaminoacidsequence NEGEAFGPDVSGwassimilartothatlocatedatthepositIonfrom321to332aminoacidofHCMVPPUI.44.Se— quenceFQI1VCVESVI.Rhad4adjacentaminoacidsconsensuswiththoseofHCMVPPUL44fromaminoacid181 to184.Conclusion!TheepitopepositionofHCMVPPUL44MAbCH13waslocatedatregionaroundaminoacid from321to332ofPPUL44andthepeptidefromaminoacidl81to184ofPPUI. 44mayhavepartiaIreactivityto CH13.TheRandompepddedisplaylibraryshowedwidelypotentialapplicati oninaminoacidsequenceanalysisof proteinthatreacttoaknownprotein. KEYWORDShumancytomegalovirus;PPUL44protein;randompeptidedi splaylibrary}aminoacidse— quence 人巨细胞病毒(humancytomega’lovirus, HCMV)PPUL44蛋白是一个具有与DNA结合特 性的磷蛋白,分子量为52kd,在HCMV急性感染 患者中主要刺激产生IgM抗体.在HCMV研究中, HCMVPPUL44蛋白的单克隆抗体CH13是经常 使用的抗体.为确定CH13在HCMVPPUL44蛋白 中的抗原决定簇位置,作者采用CH13在一个随机 多肽文库中筛选出与CH13具有结合能力的克隆, 耄大利Bologna大学微生物研究所病毒研究室 用4色荧光自动测序的方法测定了上述克隆编码随 机多肽基因的DNA序列,井比较了这些随机多肽 的氨基酸序列与HCMVPPUL44蛋白氨基酸序列 的同源性,探讨了随机多肽文库在研究相互作用蛋 白质的氨基酸序列等方面的应用. 1材料与方法 1.1材料 HCMVPPUL44蛋白单克隆抗体CH13购自 GoodwinInstitute,Plantation,Fla.随机多肽文库 中国医科大学第29卷 FliTrx”~RandomPeptideDisplayLibrary购自In. vitrogen公司.DNA提取试剂盒RPM购自Pro— maga公司.多肽文库中插入的随机多肽基因区上下 游的PCR扩增引物和上下游DNA测序引物由意 大利Primm公司合成如下:PCRPrimerU:ATT CACCTGACTGACGACAGT;PCRPrimerL: CCTGATATTCGTCAGCGAT;SeqPrimerU: GATGTACTCAAAGCGGACG;SeqPrimerL: GATCATTTTGCACGGACC.PCR扩增产物纯 化试剂盒QIAquickPCRPurificationKit购自QI— AGEN公司.4色荧光自动测序试剂盒ABIPRISM BigDyeTMTerminatorCycleSequencingReaction Kit购自美国PE公司. 1.2方法 1.2.1从随机多肽文库中筛选与HCMVPPUL44 蛋白单克隆抗体CH13具有结合能力的多肽克隆: 方法详见试剂盒使用说明.简述如下:将1x 1O个过夜培养的FliTrxTM文库细菌接种于含有 100~g/ml氨苄青霉素和100~g/ml色氨酸的IMC 培养液中,振荡培养6h,诱导文库中细菌鞭毛末端 随机多肽的达.同时用CH13单克隆抗体包被6O mr/a_直径的细胞培养板,井用1脱脂奶粉封闭培 养板.在包被有cH13的培养板中,加入表达的文库 细菌,室温孵育1h.洗涤5次后,将培养板置于磁力 振荡器上振荡30s,收集残存在洗液中的细菌.培养 收集的细菌,重复上述筛选4次.将收集的细菌接种 于含有100~g/ml氨苄青霉素的RMG培养基的培 养皿上,30”C培养过夜.挑出单个克隆,一8O?保存 备用. 1.2.2免疫转印检测筛选克隆多肽与CH13单克 隆抗体的反应n]: 收集用100gg/ml色氮酸诱导培养的挑选克 隆,加入含有SDS和巯基乙醇的裂解液煮沸5 min后,在9的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离 含有随机多肽的蛋白,并将其电转移至硝酸纤维素 膜上.用含有1脱脂奶粉的封闭液封闭硝酸纤维 素膜后,与1:500稀释的CH13室温反应1h.漂洗 3次后,加入辣根过氧化物酶标记的二抗体反应1 h.加入4一氯萘酚底物闭光显色.选择与all13有不 同反应性的克隆14株,无反应性克隆12株备用. 1.2.3克隆菌质粒的提取: 将挑选的克隆分别接种于2ml含有100~g/ml 氮苄青霉素的RM培养液中,30”C振荡培养过夜. 采用RPM试剂盒提取各个克隆菌的质粒DNA.提 取的质粒DNA加入0.8的琼脂塘凝胶电泳中检 测其分子量和纯度,此质粒DNA的大小为5kb. 1.2.4多肽文库质粒中插入随机多肽基因区序列 的扩增: 按下列配方配制PCR反应液:引物0.5umol/ L,dNTP0.1mmol/L,MgC122mmol/L,Taq酶 5u,5td,1倍浓度的缓冲液.反应条件为: 98?变性2rain,62?退火2Os,72c延伸20s.采 用热启动(HotStart)PCR方法进行35个循环的扩 增.扩增产物为181bp. 1.2.5PCR扩增产物的纯化和定量: PCR扩增产物采用QIAquickPCRPurifica— tlonKit进行纯化.纯化的PCR产物加入琼脂糖凝 胶电泳中.采用StratageneEagleEyel测定定量 加入(250ng)的DNA分子量标志物相应区带与 PCR扩增产物带的荧光密度,计算出各纯化的PCR 扩增产物的含量. 1.2,6DNA序列测定: 根据ABIPrismBigDyeTMTerminatorCycle SequencingReactionKit提供的操作方法,配制 PCR测序反应液如下:3ngDNA模板.8Termi— natorMixture,3.2pmolPrimers,进行26个循环 的扩增.扩增产物采用异丙醇沉淀法纯化后,加入聚 丙烯酰胺测序凝胶中电泳,采用PE公司ABIPrism 377GeneticAnalyzer读出DNA序列. 1.2.7氨基酸序列分析: 通过计算机互联网比较各个克隆随机多肽氨基 酸序列的同源性,并与HCMVPPUL44蛋白的氨 基酸序列比较.寻找各个随机多肽氨基酸序列问的 同源性,及其同源序列与HCMVPPUL44蛋白氨 基酸序列的关系. 2结果 2.1随机多肽文库FliTrxTMRandomPeptideDis— playLibrary中与HCMVPPUL44蛋白单克隆抗 体CH13有反应性克隆随机多肽的氨基酸序列见表 1;与CH13无反应性克隆随机多肽的氨基酸序列见 表2. 2.2与HCMVPPuL44蛋白单克隆抗体cH13具 有反应性克隆随机多肽的氪基酸同源序列与 HCMVPPUL44蛋白氨基酸序列的比较结果见图 1. 随机多肽克隆氨基酸同源序列NEGEAFG— PDVSG与HCMVPPUL44蛋白位于第321,332 的氨基酸具有高度同源性而随机多肽克隆序列 FQILVCVESVLR与HCMVPPUL44位于第181 第5期阮强等.人巨细胞病毒PPUI44蛋白单克隆抗体CHI3抗原决 定髌位点的确定 ,184的氨基酸序列有4个相邻的氨基酸一致. 表l与单克隆抗体CH13具有反应性克隆 随机多肽的氨基酸序列 Tab.1Aminoacidsequencesofrandompeptidesofclones withreactivitytomonoclonalantibodyCHI3 表2与CHI3无反应性克隆随机多肽的氨基酸序列 Tab.2AminoacidsequencesofrandompeptJdesofclones withoutreactivitytomonoclonalantibodyCHI3 克隆序号随机多肽氨基酿序列 VPH0一GAEAG,M 0K—VLDRMLS1P PTGESSRSWSAR RPLVLK—ISFGG VPH0一GAEAG— RGSHGFATLP EAGwLwlVVLQ— W QGGSNGLVRW— ARAGGTSWVFV? DDRGWYDPMEYE LRTQRDGRR—RG L+SFDQTLLARs HCMCPPUL44 AaI81,l84321332 克隆18FQILVCVESVLR 同源序列NEGEAFGPDVsG 图1与CHI3具有匣应性随机多肽的氨基酿同源序列 与HCMVPPUL44蛋白氨基酿序列的比较结果 Fig.1Comparisonresultsbetweenhomologousaminoacid sequenceofrandompeptideswithreactivitytoCHI3 andaminoacidsequenceofHCMVPPUL44protein 3讨论 HCMVPPuL44蛋白是一个具有与DNA结合 特性的磷蛋白[,分子量为52kd,在HCMV感染患 者中主要刺激IgM抗体的产生.在HCMV感染过 程中,PPuL44对于病毒DNA聚合酶起加工因子 (Processingfactor)的作用,是病毒依赖于0riLyt 的DNA复制所必需的蛋白口],对于病毒在细胞培 养中的繁殖非常重要]. HCMVPPUL44蛋白单克隆抗体CH13与 HCMVPPUL44蛋白具有较强的反应性,同时表现 出较高的特异性,是HCMV感染的诊断和研究中 经常使用的单克隆抗体,其在PPUL44蛋白上的确 切抗原决定簇位点尚未确定.本研究采用CH13单 克隆抗体在随机多肽文库中筛选克隆,井对其随机 多肽基因编码区进行DNA测序,比较了在免疫转 印实验中与CH13单克隆抗体具有反应性的随机多 肽氨基酸序列与HCMVPPUL44蛋白氨基酸序列 的同源性.结果表明,CH13单克隆抗体在HcMV PPUL44蛋白上的抗原决定簇位于其第32l,332 氨基酸序列附近,井可能与其位于第181,184的氨 基酸序列有一定的反应性.作为对照的与CH13无 反应性克隆的随机多肽氨基酸序列则无同源序列, 且在其随机多肽基因序列中常出现终止密码. 在各种生物的生命活动中,各种生命现象都是 以蛋白质具体功能的形式表现出来的.在蛋白质功 能表现中,蛋白质与蛋白质之间的相互作用起到极 其重要的决定性作用.因此,对蛋白质之间相互作用 的研究成为分子生物学研究的一个重要领域.采用 随机多肽文库结合DNA测序的方法,可以研究与 已知蛋白具有结合能力的蛋白质的氨基酸序列,再 结合与蛋白质文库(ProteinBank)中已知氨基酸序 列的比较,可以推测出与所研究蛋白具有反应性的 蛋白质种类.这一方法将为分子生物学研究的发展 起到推动作用. 参考文献 1LandiniMP.Miro]oG.Ba]dassarriBeta1.Humanimmunere— sponsetOeytomega]ovirusstructuralpo]ypeptidesstudiedbm— munohlotting.JMedvir.l,1985?17f303--311 2MocarskiESPereiraL.MichaelN.Preciselocalizationof genes0nlargeanimalvirusgenomesuseofgt11aEldmonoelon— alantibodiestomapthegene[oracytomegalovirusproteinfami— ly.ProcNat]AcadSclUSA1985tB2:1266--1270 3PariGStKacicaMA.AndersDG.Openreading[rEtmesUL44t 1RS1/TRSI.andUL36,38arerequired[ortransienteomple? mentationofhuman~ytomegalovirusoriLyt—dependentDNA synthesis.JVir.l,1993.67l2575—2582 4RipaItiAtBoccuniMCtCampaniniF?eta1.Cytomegalovlrus— mediatedinductionofantisens~mRNAexpressiontOUL44In— hihitsvirusreplicationinanas”t0】lline}identification ofanessentialgene.JViro]1995t69:2047--2057 (1999—12—08收稿) 3s79伸”卵?蚰
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