利用NaCS-PDMDAAC生物微胶囊固定化培养乳酸菌的研究（可编辑）

利用NaCS-PDMDAAC生物微胶囊固定化培养乳酸菌的研究（可编辑） 利用NaCS-PDMDAAC生物微胶囊固定化培养乳酸菌的研 究 浙江大学 硕士学位论文 利用NaCS-PDMDAAC生物微胶囊固定化培养乳酸菌的研究 姓名:黄亮 申请学位级别:硕士 专业:生物化工 指导教师:梅乐和;姚善泾 2002.3.1浙江大学生物化工颂士学位论文 摘要 ? 对利用生物微胶囊培养乳酸菌进行了研究,考察了 影响乳酸菌发酵的各个方面:不同菌种的乳酸产率是不一样的,。是短乳 杆菌最适的生长发酵温度,为.较有利于乳酸的产生,用微胶囊培养乳 酸菌底物和产物的抑制作用是比较小的。 丕游离和固定化重复发酵作了研究,并比较了固定化微生物细胞发酵 反应的优劣。固定化培养能有利于提高微生物的耐性和利用率,能提高反应 效率,能减少后期分离的:艺程序,有着良好的应用前景。 对?生物微胶囊的传质特性作了研究,测定了乳酸和葡 萄糖在胶囊内的扩散系数。在不包菌的空胶囊,乳酸的有效扩散系数为 【.而葡萄糖的有效扩散系数为.×.~;在包菌的微胶 囊内,乳酸的有效扩散系数. .。.~,比不包菌时低%;葡萄糖 的有效扩散系数则为..~,比不包菌时低%。而且分配系数乳酸 由不包菌的 也降到.,葡萄糖也由不包菌的 降到.。并对 扩敞系数汁算方程适用的条件进行了论证。这些工作列研究微胶囊固定化细 \ 胞&养仃尊要的作用。’ 建吨.了微胶囊内乳酸菌生长和发酵的模型,用来描述微胶囊内乳酸凶的 长年?发酵情况,并希望能将此模型推广于利用?微胶囊固 定化微生物过程动力学。 天链列:?,物微胶囊、。川定化细胞乳酸菌:扩散、模”??一一塑鋈查兰兰塑 些三堡圭兰垡堡苎 ~ ,. ,,,. ?.. .., . . 】.×’。.’ .‘‘.一 。.。 .‘.~.. .:, ., ,. ? ,: ; :? ??一一塑坚叁兰兰塑些三堡主兰垡堡茎 世纪被称为生物技术的世纪,生物技术将对人类的生活作出重大的贡 献和改变。生物产品从抗生素,甾族化合物,维生素,诊断试剂,疫卣,酶 和多糖扩展到有机酸,醇类和单细胞蛋白类等精细化工产品。各种此前只有 用化学方法生产的产品现台:逐步可阱用生物技术方法来实现,而且,生物方 法还可以比化学方法更经济有效。生物技术服务于生产将是世纪的一 项重要课。 生物微胶囊是一种新型的微胶囊,它具有机械强度高, 制备简单,空间效应小,截留性能好等优点,被用来进行了微生物发酵、酶 催化、动植物细胞培养及人造器官的研究,均取得了较为满意的结果。 在尘化生产过程中,分离过程常常是需要较高的投入,其成本大约占整 个小产过程的%,而微胶囊技术能大大降低分离成本,提高生产效率,是 一种良好发酵和分离耦合的生物反应器,具有良好的应用前景。 乳酸 ,??是一种重要的有机酸,乳酸、 乳酸盐及其行丁生物是化学工业、食品工业、皮革工业和制药工业的重要的 原 荆.彳单成为一种代替石油化工产品的大量生产的化学品。 采用发酵方法生产乳酸逐渐成为乳酸生产的一种主要生产方式,而且目 】:『乳酸的产率也较稳定,现在更多的探索是关于如何提高原料利用率和减 少 成本,旨约能源的方法。而乳酸菌的固定化是一种有效的提高产量、质量和 节约能源的方法。 乳酸的发酵山于采用的菌种不同,用来描述其发酵动力学的模型也 不川,而目前文献中还没有同时考虑产物、底物传递与微胶囊内菌体生长的 步了解微胶囊对乳酸菌生长的影响,加深剥 动力学模型。为了进 .中空微胶囊这种新型的生物反应器的认识,本实验利用此浙江人学生物化 工硕士学位论文 微胶囊对固定化乳酸菌发酵生产乳酸进行了研究。 在本研究中,对不同的发酵条件对固定化微生物发酵和游离微生物发酵 的影响进行了研究,对微生物被固定化后的性质受到的影响作了探讨。并且 还建立了乳酸菌在微胶囊内的生长发酵模型,用来描述微胶囊内乳酸菌的生 长和发酵情况,并希望能将此模型用于建立.微胶囊固定化 微生物过程动力学,为扩大?微胶囊的应用范团做好了准 备。????????????????』些兰堂兰塑些竺?兰竺堡塞?? 第一章文献综述 .乳酸及其用途 乳酸具有光学异构体,分为型,一型,型。当一、型乳酸遇到高 温、酸碱或酵母菌作用时,则成为?型乳酸消旋乳酸。消旋乳酸在自然 界中广泛存在。一、型两种乳酸除在光学异构体上有明显差别外,其化学 性质以及实用上都没有差别。 乳酸的构造图如图 所示: 一乳酸 .乳酸 一. . 图 乳酸的构造图 于乳酸的酸性柔和且稳定,有助于食品的风味,在食品工业上广泛用 作酸味剂、防腐剂和还原剂。可用于清?饮料、糖果、糕点的生产,也训用 鱼、肉、蔬菜的加工和保藏。与柠檬酸、节果酸等食用酸相比,乳酸岜具 有很强的竞争力。在美国,乳酸用在软饮料方面,已很大程度地取代了柠檬 酸、磷酸等。在啤酒制造上,美国全部采用乳酸来代替磷酸等无机酸来调 节。世界上四分之?的乳酸用来生产硬脂酰乳酯酸。它的盐类,硬脂酰乳 酯酸钙和硬酯酰乳酯酸钠,大量用于面包加工,不但使西包质 地松软、细腻,而且可以延长其保存期。浙江大学生物化硕学位论文 ? 乳酸,特别是乳酸,对人和畜无害,而且具有很强的杀菌作用,其杀 菌能力是柠檬酸、酒石酸、琥珀酸的几倍。搌文献记载“,在%糖液中加 入%柠檬酸或酒石酸,放置?就腐败了。但是加入%乳酸时,经过一 个月尚未出现异状。在含有%糖液中,分别接入大肠杆菌、霍乱菌、伤 害菌,而在糖液中加入 %乳酸后,这些病菌全部死亡。这是其他有机酸 无法实现的。因而,乳酸可以直接用作手术室、病房、实验室、车间等场所 的消毒剂。 一乳酸,一乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合配制成输液,可治疗酸中毒 及高钾血症。哥酸铁、一乳酸钠、一乳酸钙是补充金属元素的良好药品。 由于人体只具有代谢.乳酸的酶,.乳酸不能被人体吸收,并且过量食 用对人体有毒。因此,世界卫生组织提倡使用,乳酸作为食品添加剂和内服 药品,取代目前普遍使用的一乳酸。 乳酸可用 乳酸可添加于烟草中,能保持烟草的湿度,提高卷烟的质量。 ,使皮革 于制革一业中的脱石灰,它能使石灰变成可溶性的乳酸钙盐而除去 使之易于 柔软、细密,从而制成高级皮革。乳酸还可用来处理纺织纤维,可 着色,增加光泽,使触感柔软。 乳酸的发酵液若用水稀释后,可以浇灌水稻等农作物,具有改良土壤、 增加广量的效果;也可以直接作为药剂,喷洒于人工养殖场所,可以防治水 产铺的病虫害。 山乳酸缩聚得到的高分子聚乳酸,具有高强度、热塑性、可纺织性、生 物降解性及可从再生性资源发酵获得等优点,图.被认为是最具发展前 途的用和工业用可生物降解高分子材料之一,其应用前景是难以估量 的。?????????????????璺三奎兰竺塑些三堡主兰垡笙兰 际习 植物木材 养殖场所 .、,.....。...。.... 淀粉、纤维素、半纤维素 青贮缶寸料』 酶 葡萄糖、术糖等可发酵性糖 添加制 堆肥微生 乳峻菌. 一乳酸发酵被 物降解 ~乳酸 容器、薄膜 纤维等制品 :嚣竺竺兰兰型 蛛酬 ~ 二兰兰竺 图 』一乳酸发酵有关的优化和聚乳酸的循环 .乳酸的生产 业上制法主要有发酵法、乙醛法、丙烯睛法。在美国,乳酸%是通 过化学合成。而发酵生产乳酸始于年的美国【年本以刳薯淀粉 为原料,接科。德氏乳杆菌生产乳酸。由于该菌在?下仍能保持旺盛的产酸 能力,克服以往使用中温菌时,易染杂菌和操作较复杂的弱点,促进了发酵 法的发喂。我囤是在年期间于重庆首先生产药用乳酸钙‘引,年?以后 发展较快。而提高微生物的乳酸产量可大大提高经济效益,减少环境污染。 而乳酸发酵过程存在典型的产物抑制作用,目前的研究主要集中在利用新的 便。白:的及可再生的底物上开发新的发酵途径上。 张余诚 用一种耐热高活性乳酸菌以嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌质量配比 :混合直接接种到喷射液化、糖化好的玉米浆中,再加碳酸钙直接发酵浙江大 学生物化工硕士学位论文 ‘卜成乳酸钙。结果表明,采用此工艺生产乳酸钙反应速度快、转化率高、 纯 度高、吸收力强,产品属于高活性钙添加剂。 郭杰炎等扣则利用了乳酸菌发酵豆乳,结果表明,如同牛乳一样,豆乳 也能提供乳酸菌生长所需的营养物质,并使豆乳的下降和产生凝乳现象。 只是经乳酸菌发酵的豆乳,其酸度不如酸乳。 罗暑等【以玉米芯的水解残渣木糖渣为原料,研究了纤维素酶水解 动力学:根掘乳酸发酵与纤维素水解具有一致的最佳温度、值及厌氧要求 的特点,研究了纤维素的同时糖化和乳酸发酵过程,建立了相应的 动力学模型。 等就尝试了用错流过滤和离子交换树脂的偶联来进行循环 发酵以提高乳酸产率和底物利用率,发酵系统具有较高的瞬时乳酸产率平均 ./,小时后总乳酸可达./,较高的细胞产率平均./ 平?较高的底物利用率约%的肉汤得到利【手。 币和研究了利用透析在连续发酵过程中去除抑制剂和 有毒性的代谢物,体系的值自动控制在,。乳酸的产量得到显著提高, /, 产量由/%葡萄糖,酵母浸出物%,./, /。 /,.‖,./至 ./,. .等四在生物反应器中利用脱篮白的乳清流加培养游离和固定 化的乳酸菌,旺明流加培养方式是一种比阳隙培养更加有效的产酸方式,在 底物浓度为/和流加速率为/的条件下,反应器中的乳酸浓度最 大叮达剑/。 ,等?还不发了一种计算机模糊系统,它能准确检测出乳 酸:产过程的错误和故障,为乳酸大规模工、化生产提供了方便。浙江大学生 物化工硕十学位论文 .乳酸菌的发酵形式 ..常用的乳酸菌 乳酸菌为一类可发酵碳水化合物以获取能量,并生成大量乳酸的细菌的 总称。它们具有’定的蛋白水解能力,但脂肪分解能力较弱。乳酸发酵生产 中采用的乳酸菌分属于乳杆菌属、链球菌属、片球菌属、明串珠菌属和双歧 杆菌属【”。 .乳杆菌属:为无芽孢革兰氏阳性,微需氧,不能还原硝酸黼, 过氧化氢酶阴性和细胞色素阴性,中%鸟嘌呤胞嘧啶 为?%。目前已应用的有专性同型发酵乳杆菌,如德氏乳杆菌、瑞 .乎杆菌和嗜酸乳杆菌;兼性异型发酵乳杆菌,主要有干酪乳杆菌及 其哑种;专性异型发酵乳杆菌,主要有短乳杆菌、发酵乳杼菌和克菲 尔乳杆菌。 ,链球菌属:为无芽子乜,革兰氏阳性、兼性厌氧、过氧化氢酶 阴性、化能异养菌。在发酵乳酸中应用的主要有:乳链球菌、棉子糖链球 菌和嗜热链球菌。 .明串珠菌属:球杆状细胞,细胞色素和过氧化氢酶阴性,町发 酵葡萄糖产生乙雕和一.乳酸。需将它与链球菌分不链球菌不生 成,,成一乳酸,为?%。发酵乳中应用的主要有:肠膜 明串珠菌、类肠膜明串珠菌、乳明串珠蓝和酒明串珠菌。 .片球菌属:片球菌是唯一的在两个平面上形成四分体的乳酸 菌。它们通过途径发酵碳水化台物形成、一或十一乳酸,不 产气,过氧化氢酶和细胞色素缺乏,为%。仅有戊聚糖片球菌 和其它乳酸菌结合用于发酵乳生产。 .双歧杆菌属:多形性杆菌,号、字形或曲状弓形,革????????????????塑奎堂 竺塑些三堕主兰堡丝苎 兰氏阳性,无芽孢,不运动,厌氧,过氧化氢酶阴性,能利用葡萄糖经 一磷酸果糖分支途径产生摩尔比为:的醋酸和乳酸,不产,为 ?%,报道目前所知道的个种中,有个存在于人体肠道, 在发酵乳中应用的主要有:两歧双歧杆菌和短双歧杆菌。 ..乳酸菌与乳酸发酵 ?同型发酵? 同正型发酵是葡萄糖经途径降解为丙酮酸,丙酮酸在乳酸脱氢 酶的催化下还原为乳酸,它对葡萄糖及其它碳糖几乎全部反应,基本没有 什么副产物。 ? 同型发酵的乳酸菌一般主要是乳杆菌,仅有个别乳球菌。同型发酵的乳 酸菌有】芽乳杆菌、德氏乳酸菌、保加利亚乳酸菌、干酪乳酸菌及粪链球菌 等。一般生育温度~。,最高温度~。。 ?异混合型发酵. 、。斗 异,钽发酵乳杆菌中有肠膜状明串珠菌,甘露醇乳酸菌,短杆菌等。一般 二要是乳球菌呈异型发酵,仅有少量菌呈异型发酵。异型发酵利用碳 糖、露糖、半乳糖等糖类主要生成乳酸,并有乙醇、二氧化碳,有时也有 乙酸与油等副产物。异型发酵不能发酵木糖却能发酵阿拉伯糖及棉子糖。 ?甘露醇发酵 乳球菌中如粪链球菌在好气性条件下,能将甘露醇发酵生成乳酸『本乳杆菌 却在厌气下将甘露醇发酵生成乳酸。??蔓坚盔兰竺塑些三堡主兰焦丝苎 斗。十未知物质 ?其他菌类乳酸发酵 利用碳糖发酵生成乳酸,也并不是乳酸菌的专利。根霉、酵母菌、大 肠杆菌、芽孢杆式菌、枯草菌等都能不同程度的生成一定量的乳酸和少量乙 醇和乙酸。?、 异型发酵大肠杆菌办属此类。所不同的是大肠杆菌革兰氏染色呈阴性。 它与革兰氏染色呈阳性的乳酸菌在分类学上完全不同。 另外还有双歧发酵,它是两歧双歧杆菌 发酵 葡萄糖产生乳酸的一条途径。 巴寸】 .固定化技术 ..固定化技术简介 早作十九世纪中叶,人们发现,某些微生物细胞有一种吸附在固体物质 农的人然倾向和特殊功能,并以这种方式被束缚、固定起来。当时,曾利 ;这种被吸附的微生物细胞,在滴滤式反应系统内生产醋酸。 臼.一世纪六十年代初期固定化酶技术问世以来,又逐渐发展起一系列吲 定完整细胞的新方法,较之以前的固定方法,有了很大进步,形成了固定化 技术。近来,在探索新固定化方法的同时,研究重点已转向固定化细胞特征 的研究,反应器的选择和应用方面。细胞种类方面,也从原来的微生物细胞, 扩火到动物细胞、植物细胞,以及用重组技术和细胞融合技术人工组建 的细胞。??一一塑坚查兰竺塑些三堡主堂些堡兰 日狮可用于制备固定化细胞的方法种类繁多,很难对固定化细胞进行分 类,不同的研究者有不同的分类方法,但大致可分成吸附法、共价结合法、 ,“。 交联法、包埋法等? 】. 吸附法 很多细胞都具有吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力,如靠带电 的微生物细胞和载体之间的静电相互作用而吸附在载体上的固定化方法,这 种吸附能力可以是固有的,也可以是经过诱导产生的,依靠这种吸附能力, 人们发展起许多廉价而有效的固定化方法,统称为细胞固定化的吸附法。吸 附法呵分为物理吸附和离子吸附等两种,已有多种微生物细胞如酵母、细菌 等用吸附法围定在不同的载体上。吸附法常用的载体有:硅藻土、木材、玻 璃、陶瓷、塑料等。 吸附法又可分为表面吸附法和细胞聚集法。 吸附法的优点是操作简易,固定化条件温和,细胞存活率高和酶活力损 ,夫小等。它的缺点是致附过程与细胞的性质、载体性质及细胞与载体之间 的 相’.作用有关,只有这些参数配合恰当才能形成稳定的微生物??载体复合 物,爿能用于连续生产系统。当值或离子强度发生变化、吸附细胞发生 倍增以及与气泡和粒子等接触时,固定化细胞会变得不稳定。吸附法与其它 删定化力弘州比的另 个小利之处是反应器内每单位体积所含的细胞浓度比 较低。 .共价结合法 其价结合固定化是利用细胞表面的氨基、羧基、羟基、硫基、眯畔基等 反应基团与已活化的无机或有机载体之间的反应,形成共价键而成为固定化 细胞。』价结合法制得的阿定化细胞与载体之间的连接键很牢固,稳定性好, 仍反』、条件苛刻,操作复杂,细胞的死亡率非常高,不利于发酵。 . 交联法??.塑坚查兰兰塑些三堡?兰垡笙圣 : 交联法固定化是利用双功能或多功能试剂,直接与细胞表面的反应基团 氨基、酚基、硫基、咪哗基等发生反应,使细胞彼此交联,形成网状结 构,制得固定化细胞。交联法与共价结合法~样,都是靠化学结合的方法使 细胞固定化,但是交联法所采用的载体是非水溶性的。常用的交联剂有戊二 醛、甲苯二异氰酸酯等。 . 包埋法 包埋法是将细胞用物理或化学的方法包埋在各种载体中的固定化方法。 包埋对细胞本身性质的依赖性很小,是应用最为广泛的细胞固定化方法之 一。 细胞包埋的载体主要有聚丙烯酰胺、琼脂、明胶、.卡拉胶、海藻酸钙等。 包埋法固定细胞具有很多优点,如:方法简便、条件温和、稳定性好、机械 强度较好和容量较高等。包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法两种。 。.微胶囊技术 . 微胶囊技术 微胶囊技术是一种用成膜材料把固体或液体包覆使之形成微小粒子的技 术,由微胶囊技术制得的大小在微米或毫米范围的微小粒子就称为微胶囊。 包/微胶囊内部的物质称为囊心,微胶囊外部由成膜材料形成的包覆膜称为 糍壁,囊心可以是固体、液体或气体,囊壁由天然或合成的高分子材料或无 机化合物形成。微胶囊的技术优势在于形成微胶囊时,囊心被包裹而与外界 环境隔离,使它的性质能毫无影响地保留下来,在适当条件下,囊壁被破坏 义能将囊心释放出来,阂此,微胶囊具有改善和提商物质外观及其性质的能 范围,形状以圆形为主。常用微胶 力。微胶囊粒子的大小一般在~ 建的制备材料有蛋白质类、植物胶类、纤维素类、缩聚物类、共聚物类、蜡 类和无机材料类等。微胶囊可以被用作微反应器,具有与液体培养相近的培 养环境。其中,用于固定生物物质的微胶囊又称为生物微胶囊。浙江人学生 物化工硕士学位论文 微胶囊的研究开始于二十世纪三一年代,在五十年代取得重要成果。美 国的 在年代末首先采用空气悬浮法制备了微胶囊】,并将其 成功用于药物胞衣领域;年代美国..首先利用物理化学原理制 备了微胶囊,开创了以相分离为基础的物理化学法制备微胶囊的新领域。 年代末到年代,人们开始研究把合成高分子的聚合方法应用于微胶囊的制 备?,年代后,微胶囊制备技术日益成熟,应用范围也逐渐扩大,尤其是 年代以来,微胶囊技术的研究取得了更大的进展,不仅发表了许多微胶囊 合成技术新专利,而且开发出纳米范围的纳米胶囊【”】。微胶囊的应用范围 也 得到了扩展。 牛物微胶囊用于细胞培养时,具有许多优点: ?微胶囊可以提高细胞密度; ?微胶囊可以将目的产物截留在膜内,通过微胶囊与培养液的分离即可 实现产物与培养液的分离纯化,减少分离产物的过程投资; ?细胞可以重复或连续使用而不会大量流失; ?可降低培养时对细胞的剪切力。 . 生物微胶囊的制备方法 ,物微胶囊的制备按原理可分为化学法、物理化学法和物理法阱”】。 化学沤 界岍聚合法:将丽种活性单体分别溶解在不同的溶剂中,当~种溶液被 分散在另一种溶液中时,在两种溶液界面间发生聚合反应,形成聚合物薄膜。 原位聚合法:在原位聚合法微胶囊化过程中,单体及催化剂是全位于芯 材液滴的内部或外部,聚合反应在液滴的表面进行,生成的聚合物薄膜可覆 盖住芯材液滴的全部表面。 采用能溶于水或能溶于有机溶剂的线型聚合物为原 液中硬化覆膜法: 料,先将聚合物溶解形成溶液,然后,当其固化时,聚合物迅速沉淀析出形?? 一.塑坚奎兰生塑些三堕?兰丝堡壅 成壁膜。 物理化学法 相分离法:包括水相分离和有机相分离两种方法。在水相分离法中,形 成微胶囊囊壁的起始原料为水溶性的聚合物,聚合物的凝聚相从水溶液中分 离出来,形成微胶囊的囊壁。有机相分离中,聚合物溶解在有机溶剂中,通 过加入可混溶的非溶剂而使聚合物发生沉淀。 界面沉积法:在该法中,用作微胶囊化的介质是水或挥发性的油,将壁 材和芯材的混合物以微滴状态分散到介质中,随后,挥发性的分敞介质急剧 地从液滴中蒸除形成囊壁。 粉术床法:粉末床法是使液体球的边沿上粘有被弄湿的粉术,是清晰耳. 固定的相分离持久存在,形成具有一定厚度的壁膜。 .物理法 静电沉积法:带有相反电荷的芯材颗粒合成膜材料经喷雾器释放到空中, 通过静电吸引而结合在一起,形成微胶囊。 空气悬浮法:应用流化床将芯材固定粉末悬浮在空气中,接着将可在芯 材表面上行成囊壁的成膜液喷雾在流化床上,在悬浮微粒表面形成一个很薄 的沉淀层,从而实现微囊化。 真空蒸汽沉积法:该法以固体颗粒为芯材,将金属如铝、铜等,或将膜 涂住芯材颗粒的表面。 喷雾干燥法:制备由芯材与壁材组成的混合溶液,均质化后使其物化进 入燥宅,形成微胶囊。 由于物理化学法和物理法制备过程中常涉及高温或变化大或馒用了 有机溶剂,利一细胞等生物活性物质,因此,生物微胶囊的制备多数采用 化学法。 】 .. ?生物微胶囊???? 塑坚查兰竺望些三堡主堂笪堡苎 生物微胶囊是八十年代初由前民主德国科学院高分子 化学所现高分子化学所的博士等发明的引。 即纤维素硫酸钠 ,图.即聚二甲基 二烯丙基氯化铵 ,图 两种物质 均是能溶于水的聚电解质。为聚阴离子化合物,为聚阳离 子化合物,当这两种带不同电荷的物质混合时,在两者的界面发生络合反应, 生成多聚电解质复合体, ,形成了一层半透膜。制 备微胶囊时则是先将要固定的生物物质与溶液混合,然后将混合液滴 入溶液中,与在界面发生张合,形成水凝胶 珠,经过一分钟后,凝胶珠中的与在膜的附近全部反 应,最终形成一个中空的微胶囊,膜厚约.,直径约为...。 \ 图. 的结构浙江大学生物化工硕士学位论文 嘶习, 图. 的结构 与生物微胶囊的特点 与以往的固定化方法相比,该体系具有以下优点: . 该中空微胶囊可使细胞、微生物、酶等的空间效应减到最小; 该胶囊的多孔膜层物化性质稳定,不受光、热影响,不溶于大部分有机 溶剂如乙醇、丙酮、丙醇等,在.范围内不发生变化: 微胶囊的膜层虽然很薄,但微胶囊的机械强度很高,可承受牛顿的正 面垣力: 对微生物无毒,与络合后也无明显毒性; 微胶囊的多膜的截留性能很好,截留区问为,~,; 微胶囊的制备过程十分简便,只需~步化学反应便可。 与前应用最多的微胶囊相比,该微胶囊电有制备方法简单,膜物 理化学一陀质稳定及机械融发好等优点。由于以上优点,该体系日益受到国 际 的重视和研究,已用该微胶囊体系进行了微生物发酵、酶催化、动植物细 胞培养及器官的研究,均墩得了较为满意的结果。 本实验室对.做了微生物发酵及生物相容性,传质性质 等力‘面的研究,也得到较好的结果阻’’引。浙江大学生物化工硕士学位论 文 ..乳酸菌固定化的研究 乳酸菌的固定化发酵可以追溯到年,和【应用 白明胶在聚合电解质的存在下将微生物细胞包埋,并在柱反应器中培养,乳 酸用离子交换分离,转化率可达%。 年”应用聚丙烯酰胺包埋了不同的菌种,其中包括乳酸菌, 而且他还第一次将之应用于工业放大生产,实现了工业化生产,从此乳酸的 ,上产进入了一个新的时期。 等四用一卡拉胶?. 固定 了三种不同的菌种,并对它们进行了连续混合培养。主要考察了值、温 度、洗脱速率对菌体生长的影响和洗脱液在拟平衡状态下,相互作用对体系 的成份和活性的影响。实验显示了很高的生物稳定性,没有一支菌种占优势 或被淘汰。而且经过天的连续培养,微胶囊还具有很高的机械强度,微生 物产酸能力也未受考察条件变化影响,证明了固定化对微生物稳定性的提高 作用。 在已进行的实验中,在保持现有发酵水平的基础上,曹本昌刮用海藻酸 钙、拉胶固定化培养乳酸菌,发酵周期仅为小时,使发酵周期缩短. 侣,而糖利用率和转化率大大提高;本校叶子骚等用微胶囊进行 乳酸菌七定化培养,发酵周期也可达到~小时,发酵周期缩短倍: 己 曲人学的张强’等用%一卡拉胶包埋乳酸菌,经.%戊二醛和 .股溶液加固处理,乳酸蔼的稳定性和贮藏性得到了提高。 哈一大的柳萍等九则提出了利用离子交换吸附固定化乳酸菌的发酵生产 乳酸的新方法,咳法以海藻酸钙凝胶为栽体包埋固定化细胞,用于生产乳酸, 将离交换树脂填充柱与发酵反应器相连接,能从发酵液中及时地分离出产 物乳酸。这种新方法成功地消除了产物一乳酸对乳酸菌生长和产酸的抑制作 ~ ??一一旦垩盔兰竺塑些三堡主兰些堡兰 用。与常规的发酵法相比,利用离子交换树脂吸附发酵使糖转化率和乳酸, 士 %: 产速率分别由.%和./提高到 ./驯。 .乳酸发酵动力学模型简介 乳酸的发酵由于采用的菌种不同,用来拙述其发酵动力学的模型公式也 不唰?【“,常见的主要有: 一般化方程 一‰。一?: 盟掣:女上一旦, ‖。。 ‖。 ? 耻去 矗:方程.中,当 ,,这成为方程, ,,则变成方程。 混合型发酵模型 妄塞掣‖ 甜 另外还仃一些其它常用的模型: ‖ ? 舻以’忑 ?? 、 丘. ??一一塑坚查茎竺塑些三堡圭兰堡堡塞 ? 舻‖,毒熹, ‖一,丽‘万嚣’ ? ,‖。““ ? ? ‖矾赤”去, 舻“巧一玄’ ? ,“????????一 。。。.十/、 ““???????一 ’。?/, 而提出的一个的非结构模型 ‖?。。。 一 , 蟹? 秋分厉 稍 ? 一 堕 竺、 甓 这些方程都适用于’。种特定条件下的乳酸菌生长,都能较好的反映某~特 定条件『、.的乳酸菌的生长情况。 而要建立数学模型的主要目标为【】: 叫以预见任何系统的转化率或生产率?????????????????苎壁三垦竺塑些三 堡:兰些堡塞 可以用以检查在各种操作条件下工厂操作的性质和行为,并可检查适用的 范幽,包括允许从这一范围外推多远. 可以在其适用范围内,通用于其它情况 能用于进行工艺优化。 可用计算机进行模拟。 模型可用于检测出可能重要但尚未或被忽视了的工艺变量和参数. 在检查是否已有效地将生物现象和物理现象区分开时,模型可用作对照, 作为间接结果,模型可帮助搞清反应机理. 而建立一般化模型的目的在于: 有助于评估生长实验数据: 有助于建立描述微生物生长的其他有用的模型形式。 同丽对乳酸菌的』长动力学研究较多阻 ”,但是还没有结合产物、底 物传递情况束描述微胶囊内乳酸菌生长的方程。我们所作的工作就是为了反 应微生物在微胶囊内的生长和反应情况,以比较常见的乳酸菌作为研究对 象, 并尝试用方程来描述它的生长和反应,并希望能将之推广运用于能利用微胶 囊固定化培养的微生物。???坚查堂垒塑些三璺?.堂竺堡兰 一 第二章乳酸菌的发酵 .实验方法及装置 .. 菌种 保加利亚乳杆菌:浙江大学生物工程研究所保存; 短乳杆菌: 浙江工业大学环境与生物学院提供。 ..微胶囊的制备装置: 实验中共使用了两种方法制备微胶囊,一是用医用注射器手工滴制,另 址用微珠发生器进行制备。其实验装置分别为图.和图.所示。 溶液 磁力搅抖器 幽】?生物微胶囊制备手装置示意幽???????』燮丝巡塑巡 幽. ?生物微胶囊制备微琳发生器装置示意图 微珠发生器:气体流量计;.空气压缩机:。溶液 一’流泉:成囊池溶液,:蝴 ..培养基 培养基增菌用培养基: 葡萄糖或乳糖 /.蛋白胨‖,牛肉膏 /,酵母浸出物‖, 醋酸钠 /?柠檬酸铵 /, . ,,? /,。. . /,吐温~ ... 发酵培养基: 葡萄糖? /,胰蛋白胨 /,酵母宙 . /, /, /, ?.,接种前加.%、。 ..实验方法 发酵采用摇瓶重复发酵,方法如下浙江大学生物化工硕士学位论文 游离培养: 菌种活化一一摇瓶发酵一取样一 更换培养基一重复发酵 固定化培养: 菌种活化一一固定化一一摇瓶发酵一一取样一~更换培养基~一重复发酵 菌种在培养基中活化小时,将菌体溶于 无菌水中,与配 好的溶液混合,在。保温条件下,滴入溶液中,形成 微胶囊,固化?后,接入发酵培养基中。测定乳酸含量,葡萄糖含量,菌 体浓度。 待葡萄糖消耗完后更换培养基,改变培养条件,重复发酵。 .分析方法 ..乳酸的测定。” 试剂 碳酸钙,钠溶液,铬黑指示剂,氨缓冲液。 测定方法 取样品,容量瓶定至,取,加去离子水,加入氨缓冲 液,铬黑指示剂,用标定好的钠溶液滴定。再折算成乳酸的含量。 ..还原糖的测定法 试剂配制 .,充分溶解在水中,再加 称取.二】基水杨酸., 入酒石酸? .,苯酚.,偏重亚硫酸钠 .,充分溶解后盛于棕色瓶中,放置天后即可使用。所用应有足够 的????????????????塑兰堂竺塑些三堡:兰垡堡塞?? 碱性,检验方法用. 滴定加了苯酚的试剂,到终点时应用去 ,若用量小于,则需加入。 曲线的制作 . 精确配制浓度为., ,., ,.,.,., /的标准葡萄糖溶液一组。 .在支试管中分别加入标准葡萄糖溶液,另用蒸馏水作空白, 再加入试刺,沸水浴中保持分钟,冷却至室温后.加水至, 摇匀。在处测定吸光度值。 以浓度对吸光度作标准工作曲线,如图 所示。 取适当稀释后样品,加试剂,沸水浴中保持分钶,冷却至 室温后,加水至,摇匀。在处测定吸光度值。按标准曲线计 算其浓度,再折算出还原糖的浓度。 / 图 糖浓标准曲线 ..菌体浓度的测定 浊度法 .标准曲线的制作 取不同浓度菌浓的菌液,将各浓度的菌液在下测定吸光度,再将塑坚奎兰竺 塑些王堕:兰垡堡壅 ??一 其离心,烘干,测出其下重,折算出菌浓,并以菌浓为横坐标,吸光度为纵 坐标,作标准曲线,如图.所示。 .菌浓测定 将待测样品稀释至合适的浓度,测定下的吸光度,参照标准曲线 即可测知其菌浓。 幽 菌浓标准曲线 .不同菌种的乳酸菌发酵 ..试验材料 .曲种: 保加利甄乳杆菌,短乳杆菌 .培养基: ‘后转移入发酵培养基中进行发酵。 活化采用培养基,??????????????????堂堕三三兰竺塑些三塑圭兰垡堡苎 ..试验的结果与讨论 对两种不同的菌株进行了游离细胞的和固定化细胞的发酵生产乳酸的实 验。实验结果如下: .保加利亚乳杆菌和短乳杆菌游离发酵比较 在图.一图.中,分别示出了两株菌种在发酵时,菌浓、糖浓与乳 酸浓度随时问的变化关系。 一,一? 图.游离细胞发酵生产乳酸过程中的菌浓变化 一佩帕剌?乳十帆 ?蛳乳 圈.游离细胞发酵生产乳酸过程中的糖浓变化?~塑坚查兰竺塑些三望::兰垡 堡壅 一保加州扎?街 “ 茜 童 %。 兰 ? ? 。 幽.游离细胞发酵过程中的乳酸浓度 游离培养中,保加利亚乳杆菌发酵周期比短乳杆菌长得多,前者时间几 乎足后者的倍。而乳酸产率乳酸/葡萄糖‖分别为.%和.%, 两肯则比较接近。 .保加利亚乳杆菌和短乳杆菌固定化发酵对比 我们将两株菌种分别固定在微胶囊中,保持反应条件与游离培养相同, 进行固定化细胞发酵。结果如图.,.: 划 四定化细胞发酵生产乳酸过程中的糖浓变化?????????????????坚鲎竺 塑些三堡主兰垡堡兰 保加州弧乳村菌 ?露打苗 一言一??。书旦 ? ? 倒. 刮定化细胞发酵生产乳酸过程中乳酸浓度变化 同样,固定化培养显示出两株菌种在培养条件相同时,尽管两株菌种的 发酵周期长短相差很大,但乳酸产率几乎相同,具体对比见表。。 表.保加利亚乳杆菌与短乳杆菌发酵生产乳酸结果对比 由上面对保加利亚乳杆菌和短乳杆菌在下发酵的情况来看,两者 刚属于异型发酵,短乳杆菌比保加利亚乳杆菌具有更有利的发酵性质:在相 近孚酸产率下,短乳杆菌具有更短的发酵周期,更快的产酸速率,本实验 选择短乳杆菌作为后期工作的研究对象。 塑垩奎兰生塑些三堡主兰垡堡塞 ??一 .温度对发酵的影响 通常,温度对乳酸菌的产酸有着重要的影响,而且不同的菌种对发酵和 生长的温度要求不同,为了了解温度对本短乳杆菌的影响情况,本实验进行 了。、。、 、。、 五个不同温度下的发酵试验,分析温度的 影响。 ..不同温度下游离细胞的发酵 在不同的温度下,短乳杆菌在游离细胞培养时,菌浓随时间的变化如图 .所示: 厦 一圈一 幽短乳杆曲定不同温度发酸时的菌浓变化 “菌浓随时问的变化可以看出,菌体在。下基本上不生长;而在 ?,。,?生长都较快,尤其是在。下,菌体浓度可以达到最大。 不同温度下,短乳杆菌游离细胞培养时,培养液中葡萄糖浓度随时问变 化的关系如图.所示: ??????????????????鲨二兰圭塑些三堡主兰竺堡苎 :一.。..、,。一~ 液中 以认 的关 一一一一一 ??:::可。~一一一腻、引? 圆..筘一圜,‖..一 ..一一 幽,不同温度短乳朴曲发酵乳酸浓度曲线 从阁 中乳酸浓度随时间的变化可见,。下乳酸浓度达到最高: ?和。下都有较高的产率, 和。下,乳酸的产量并不高。 一 ...??????????????????翌堕生堡塑些三堡?兰篁堡壅 从图 中乳酸浓度随时问的变化可见,?下乳酸浓度达到最高: ?【 。下都有较高的产率,。矛 。,乳酸的产量并不高。 ..不同温度下固定化细胞的发酵 随后,我们进行了不同温度下的固定化细胞发酵培养,考察温度对固定 化细胞培养的影响。 不【温度下,短乳卡菌固定化细胞培养时.培养液中糖浓随时间变化的 关系如图.】所示: 茜 呈 剀 不同温度卜五定化发酵的糖耗 同样,固定化培养时,在。,。、。和。下,发酵液中的糖分 ;能很快地被菌体完全利用,而在.。下,糖浓基本上不变。 ?、川温度,短乳杆菌固定化细胞培养州,培养液中乳酸浓度随时问变 化的关系如图. 所示:??塑竖奎兰竺塑些三堡主兰堡堡皇 , 言:; 蓍 譬: 兰 呈; 曼麓箍~ ; ’ 丝 一 厂,二一 /匡一 /国一一 幽 不同温度下固定化发酵产酸图 固定化培养时, ?、。和。下,发酵液中的乳酸浓度都迅速卜 升,而。,叫,乳酸产量很低。 由图. ,.的数掘,我们不难发现,固定化后和游离相比,温度条 件的影响是大致相同的。?明显不利于乳酸的发酵,而。虽有利于菌体 生长,但不利于产酸。温度对短乳乳杆菌发酵的影响如表?所示: 表?不同温度的发酵结果对比 发酵.指葡萄糖耗胜的时问????????????????』堑三堂竺塑些三堡主兰些堡 兰 总结上面的实验结果,不难发现,无论是游离还是固定化细胞培养, ?、。、?都是较好的乳酸发酵温度,虽然?有利于菌体的生长,但 不利于发酵。由上面的结果看出,温度对细胞游离和固定化细胞培养的影响 是棚『一的。综合各个因素考虑,本实验选取?作为继续研究时所用的发酵 温摩。 . 值对发酵的影响 值对乳酸的生成有着较大的影响,在有关的报道中,值在.附近 被认为是最适的四四。而本实验在发酵液中加入、后,值始终保持在 “.矗右,而这个值刚好是乳酸的最适生成值,所以将不再考察值 变化列发酵的影响。 .底物浓度对发酵的影响 在很多文章中讨论到乳酸的发酵中出现过底物抑制的情况,为了进一步 了解短乳杆菌的发酵特性,便设计了本实验来证明是否底物浓度对本菌种有 很人影。 ..实验方法 配制四种不司糖浓的发酵培养基,成分见论文前面的发酵培养基的配方。 只是所加的葡萄糖分别变为:/、/、/、/。将所配制的四种 同糖浓的培养基同时接入活化后的菌液,进行发酵实验。连续小时 测磴发酵过程中的菌浓和乳酸浓度。??????????????????里壁三兰竺望些三 堡:兰丝堡皇 ..实验结果 不同的初始糖浓对发酵的影响如图., 所示 惦 幽 不同初始葡萄糖浓度对菌浓的影响 , 一 . ? 加 一 ? 铀 一《。一??一曲 ? ~ ,. 蚰 ? ? ;,???卜‘ 广 \ 国? 芏 币唰初始葡萄糖浓度对葡萄糖消耗的影响 山刘 ,.所示,在不同的初始葡萄糖浓度下,短乳杆菌的生是近 似村同的;同时,不同初始葡萄糖浓度的发酵液中葡萄糖的消耗情况是大 致????????????????塑兰登兰塑些三堡主兰生丝苎 相同的,从另一个方面来说明了初始糖浓对短乳杆菌的发酵影响是不大的。 表列出了这几组实验反应结果。 表不同初始糖浓情况下发酵结果的对比 糖浓/ . 乳酸得率/. . . 反应时间 . 最高菌浓/. . . 从表中数据可知,在发酵过程中,虽然发酵时间各异,但乳酸得率和最 高菌浓近似相同,乳酸菌发酵可能存在的底物抑制在本实验中是不明显的。 因此,在葡萄糖浓度低于刚的情况下,短乳杆菌的底物抑制是可忽略的。 在建立生长模型的时候可以不考虑底物抑制项。 .乳酸菌固定化与游离的发酵对比 ..实验方法 制作一批。生物微微胶囊。将微胶囊加入发酵培养基中 进行发酵,在每批发酵结束后,将发酵液倒出,换入新的发酵培养基继续进 行发酵。 同时,进行游离细胞的发酵培养,每批发酵结束后,游离的细胞经离心 处理后,倒去上清液,将离心得到的菌体接入新的培养基重复进行发酵培养。 ..结果分析 培养结果如图.一图.所示。?? 塑垩查兰圭塑些三堕主兰些笙茎 岍 。 ‘ 。,。 . ? ? ?? 。 暑。? ? 。阱 ? 。。 一 一 一 ??? 一 一 多批游离培养菌浓曲线 ? 州 ? . ? ? 一茜? ? ? 一 一 一一 蚓 多批游离培养乳酸产蕈?????????????????坠三奎竺兰丝三堡主兰垡堡 苎 一 ? 、 一 ; . ‘。 ’ 一茜 . 、. . 幽.多批游离培养糖浓曲线 ?? ? ? ?. . ? 矗 . 吾 ? 日 弓 . ? 一 一 一 一 一 一 一 图 多批五定化培养乳酸产量