葡萄籽原花青素的提取与分离

葡萄籽原花青素的提取与分离 试验研究 ChinaFoodAdditives 中国食品添加剂 葡萄籽原花青素的提取与分离 王卫东,李超,凌莉 (徐州工程学院食品工程学院,江苏徐州 221008) 摘 要:原花青素是葡萄籽中含有的一种重要的生理活性物质。采用溶剂浸提的方法从葡萄籽中提取原花青素,并通过单因素试验和正交试验优化了最佳提取工艺参数为:乙醇浓度70%,浸提时间120min,料液比1 20,浸提温度40 。选取四种不同的大孔树脂(DA201、AB-8、HPD-100、HPD-700)对最佳条件下提取的粗提液进行静态吸附、解吸实验和动态实验,结果表明:DA201为吸附葡萄籽原花青素的最佳树脂;当原花青素浓度为0 15mg/mL时,上样流速为1mL/min,洗脱流速为1mL/min,洗脱剂乙醇浓度为70%,用量为5BV时的纯化效果 1 最佳。 关键词:葡萄籽;原花青素;大孔树脂 中图分类号:TS202 3 文献标识码:A 文章编 号:1006-2513(2010)03-0084-06 Abstractionandseparationofproanthocyanidin fromgrapeseeds WANGWei dong,LIChao,LINGLi (CollegeofFoodEngineering,XuzhouInstituteofTechnology,Xuzhou210008) Abstract:Proanthocyanidinisasubstanceingrapeseedsthatplaysanimportantphysiologicalroleinhumans.Theresultsshowedthatthebestconditionswere:70%ethano,lextractiontime120min,temperature60 . liquidratio1 20, Itwas extractedbysolventextraction.Theoptimalconditionswerestudiedbysinglefactorexperimentsandorthogonaltests. extraction Fourdifferentmacroporousresins(DA201,AB-8,HPD-100andHPD-700)werecompared elutionflowratewas1mL/min, eluantconcentrationwas70%eth 2 inregardstopurification.Theresultsshowedthat:DA201wast hebestresin.Proanthocyanidinconcentrationwas0 15mg/mL.Thesampleflowratewas1mL/min, ano.lTheamountofresinat5BVshowedthebestpurificationre sult.Keywords:grapeseed;proanthocyanidin;macroporousres in 原花青素(procyanidins),简称PC,是植物王国中广泛存在 的一大类多酚类化合物的总称, 由不同数量的儿茶素和表儿茶素结合而成的,有二聚体、三 聚体、四聚体等直至十聚体。通常将二、三、四聚体称为低 聚体,将五聚体以上的称为高聚体 收稿日期: [1] 肿瘤、抗辐射、防止血小板凝结,增强心血管活性等多种生 物活性和药理作用。研究发现在众多的植物组织中,葡萄籽与 松树皮提取物中原花青素的含量最高 [4] [2、3] ,而从葡萄籽中提取原花青 [5、6] 素的方法主要有溶剂提取法、微波浸提法 [8] 3 [7] 、 。原花青素具有抗氧化、抗衰老、抗超声提取法和超临界CO2萃取法等。 2009-08-02 基金项目:徐州工程学院培育项目(XKY2008322)。 作者简介:王卫东(1971-),男,讲师,博士,研究方向为食品资源开发与利用。 84 试验研究 葡萄籽原花青素提取物中含有很多杂质,需进一步纯化才能提高原花青素的纯度,常用的纯化方法有溶剂萃取、膜过滤及色谱法。大孔树脂的表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好,在水溶液和非水溶液中都能使用。现在市场上可用于分离纯化葡萄籽原花青素的大孔树脂品种繁多,且分离纯化的效果也各不相同。本研究的目的就是通过以乙醇为提取剂,对葡萄籽原花青素有机溶剂浸提的工艺参数进行优化,然后再用大孔树脂对原花青素粗提液进行分离纯化,从而拟定出葡萄籽原花青素的最佳分离纯化方案,为葡萄籽的综合利用和原花青素的工业化生产提供科学依据,使原花青素得到更广泛的应用。 中国食品添加剂ChinaFoodAdditives 4 时做空白实验。空白溶液以蒸馏水替代原花青素溶液。原花青素含量计算方法如下: (C!5 5/0 5) 葡萄籽原花青素含量%= m!1000 !100 !V 式中:C???葡萄籽原花青素粗提液的浓度(mg/mL); V???葡萄籽原花青素粗提液的体积(mL); m???称取葡萄籽原料的质量(g)。1 2 3 葡萄籽的预处理 葡萄籽#粉碎#过80目的葡萄籽粉#减压干燥#超临界CO2萃取葡萄籽油#残渣#烘干备用1 2 4 葡萄籽原花青素提取工艺的优化 以过80目筛的脱脂葡萄籽粉为原料,按不同的料液比加入不同浓度的乙醇溶液作为提取剂,恒温搅拌提取一定时间,离心后取上清液。以相同的条件再提取一次,合并两次上清液,用去离子水定容至25mL,在500nm波长下测定吸光值,考察料液比、乙醇浓度、提取时间对原花青素提取率的影响。在单因素试验的基础上,以乙醇为提取剂,选择搅拌时间、乙醇浓度以及料液比三个影响因素,以花青素含量为响应指标,选用L9(3)正交表,正交实验设计的因素水平见表1。 表1 葡萄籽原花青素正交提取试验L9(34)因素水平表 5 Table1 FactorlevelofL9(34)orthogonalexperimentforGSPextraction 水平123 搅拌时间(A) 90min120min150min 乙醇浓度(B) 70%80%90% 料液比(C) 1 101 151 20 4 1 材料与方法 1 1 主要材料与及试剂 葡萄籽石家庄金牛饲料有限公司;DA201、AB-8大孔吸附树脂安徽三星树脂有限公司;HPD-100、HPD-700大孔吸附树脂沧州宝恩树脂有限公司;儿茶素品中国药品生物制品检定所;RE-52AAA型旋转蒸发器上海仪器有限 公司;756型紫外-可见分光光度计上海成光仪器有限公司;SHA-B型恒温振荡器常州国华电器有限公司。 1 2 实验方法 1 2 1 儿茶素标准曲线的制作 采用香草醛-浓硫酸法测定葡萄籽原花青素的含量 [9、10] 6 。取7支试管,分别加入浓度为0、 0 005、0 01、0 02、0 03、0 04、0 05mg/mL的儿茶素标准溶液0 5mL,然后在各试管中分别加入2 5mL的3%的香草醛甲醇溶液和2 5mL的30%硫酸溶液,轻微振荡摇匀。将试管口用棉花 球塞住,放入30 的恒温水浴中反应15min。以0号管为参比,在波长为500nm处测定反应液的吸光值。以儿茶素浓度C为横坐标,以吸光值A为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程为A=3 37771C-0 0003,方程的决定系数为0 9990。1 2 2 原花青素含量测定 精密移取原花青素溶液0 5mL于一支干净试管中,按照制作儿茶素标准曲线的方法操作,同 1 2 5 大孔吸附树脂对原花青素的静态吸附和解吸试验 1 2 5 1 大孔吸附树脂的预处理 选取DA201、 AB-8、HPD-100、HPD-700等四种不同型号的大孔树脂,用无水乙醇浸泡24h,湿法装柱,用无水乙醇洗脱,至洗脱液与去离子水混合无混浊现象产生,改用蒸馏水洗脱至无乙醇味。1 2 5 2 静态吸附试验 分别称取适量湿树脂DA201、AB-8、HPD-100、HPD-700置于三角瓶中,加入20mL原花青素提取液(浓度为 85 试验研究 7 ChinaFoodAdditives 0 1166mg/mL),在30 的振荡水浴锅中振荡24h后,测定溶液中原花青素的浓度,计算各树脂的吸附率及吸附量。 树脂的吸附率(%)和吸附量(mg/g树脂)计算为: C原液-C吸附液 !100 C原液 (C原液-C吸附液)!V 吸附量(mg/g树脂)= W干树脂吸附率%= 式中:C原液为原液的原花青素浓度(mg/mL),C吸附液为吸附液的原花青素浓度(mg/mL),V为溶液体积(mL),W干树脂为干树脂重量(g)。1 2 5 3 解吸试验 在上述充分吸附原花青素后的树脂中分别加入20mL70%的乙醇溶液,在30 的振荡水浴锅中振荡24h,倒出解吸液,测定溶液中原花青素的浓度,计算各树脂的解吸率。 树脂的解吸率计算为: C解吸液!V解吸液 解吸率%=!100 (C原液-C吸附液)!V吸附液 式中C解吸液、V解吸液分别为解吸液的原花青素浓度(mg/mL)和体积(mL);C原液为原液的原花青素浓度 8 (mg/mL);C吸附液、V吸附液分别为吸附液的原花青素浓度(mg/mL)和体积(mL)。1 2 6 大孔吸附树脂对原花青素的动态吸附和解吸试验 将处理好的树脂装入玻璃层析柱,加入一定浓度的提取液,调节一定的流速,使提取液过柱,定时记录流出液浓度的变化,吸附达到饱和后停止进样,水洗除去糖等水溶性杂质,然后再加入一定浓度的洗脱剂,分部收集洗脱液,定时记录洗脱液浓度的变化。 佳组合为A2B1C3,所以最佳提取工艺参数为:提取时间为120min;乙醇浓度为70%;料液比为1 20。 表2 葡萄籽原花青素提取正交试验L9(34)的结果 Table2 TheresultofL9(34) orthogonalexperimentongrapeseedPCextraction 试验号123456789K1K2K3极差R A1112223336 296 916 250 22 B1231231237 196 705 560 55 C1232313126 326 466 670 11 原花青素提取率(%) 2 242 131 922 602 401 912 352 171 73 中国食品添加剂 对表2中的数据进行方差,结果如表3所示。由方差分析可以看出,在 =0 10时,提取剂乙醇浓度对葡萄籽原花青素 9 提取率的影响显著,提取时间和料液比对原花青素提取率的影响都不显著。 表3 方差分析Table3 Analysisofvariance 2 结果与讨论 2 1 葡萄籽原花青素提取工艺的正交试验 根据单因素提取试验结果,采用脱脂葡萄籽粉为原料,乙醇为提取溶剂,以原花青素提取率 为响应指标,在温度为30 下,对影响葡萄籽原花青素提取率的三个工艺参数(搅拌时间、乙醇浓度、料液比)进行正交试验,以优化提取工艺,正交试验结果见表2。由表可知,三个因素的极差大小顺序为B>A>C,各因素与水平的最 ABC 标准差平方和 0 0910 4660 021F0 10(2, 自由度 222 方差0 0460 2330 011 F值0 6083 1120 140 显著性 * 8)=3 110 F0 05(2,8)=4 460 2 2 温度对原花青素提取率的影响 10 提取温度经常也是影响提取率的一个因素, 86 试验研究 因此在正交试验的基础上进一步考察提取温度对原花青素提取率的影响。分别精确称取过80目的脱脂葡萄籽粉1g,置于五个锥形瓶中,加入80%的乙醇溶液20mL,将锥形瓶分别放在30 、40 、50 、60 的恒温振荡水浴锅中振荡提取120min。提取两次测定原花青素的提取率,结果如图1所示。由图可知,随着温度的升高,原花青素的提取率增大。当温度达到40 的时候,提取效果最佳。随着温度的进一步升高,提取率反而下降。因此,选择40 进行原花青素的提取。 树脂型号 中国食品添加剂ChinaFoodAdditives 为50 83%。因此,结在吸附率接近的情况下,DA201树脂的解吸率最高,应选取DA201大孔树脂对原花青素进行纯化。 表4 四种吸附树脂对原花青素的吸附性能Table4 Fourkindsofadsorptionresinadsorption propertiesProanthocyanidin 吸附率(%)82 6882 2580 6282 85 吸附量(mg/g树脂) 1 931 921 881 93 11 解吸率(%)60 5855 0644 1550 83 DA201AB-8HPD-100HPD-700 2 4 大孔树脂对原花青素的动态吸附和解吸试验2 4 1 上样流速对大孔树脂吸附量的影响 大孔吸附树脂对化合物的吸附需要一个过程,不同的上样液流速,目标物质与树脂的接触时间不同,吸附量也会发生变化。控制原花青素溶液(0 15mg/mL)的上样流速分别为1 0、2 0和3 0mL/min进行动态吸附实验,结果见图2。 图1 温度对原花青素提取率的影响Fig 1 Proanthocyanidinstemperatureonthe mpactofextractionratei 图中表明,当进样速度较快时,穿透点(流出液中样品浓度达到进样液浓度的10%左右时流出液的体积)出现较早。因此慢速有利于吸附,本实验中,上样时流速以1 0mL/min 为最佳。 2 3 大孔树脂对原花青素的静态吸附和解吸试验 分别称取适量树脂DA201、AB-8、HPD-100、HPD-700,置于三角瓶中,移取20mL原花青素提取液(浓度为0 1166mg/mL)加入三角瓶中,在30 的振荡水浴锅中振荡24h后,倒出吸附液,测定溶液中原花青素的浓度,计算各树脂的吸附率及吸附量。结果如表4所示。由表可知,HPD-700大孔树脂对原花青素的吸附率最高,为82 85%,其次为DA201树 12 脂,为82 68%。对原花青素吸附量最高的大孔树脂为DA201和HPD-700,都为1 93mg/g。 将倒出吸附液的各树脂中分别加入20mL70%的乙醇溶液,在30 的振荡水浴锅中振荡24h,倒出解吸液,测定原花青素的浓度,计算各树脂的解吸率,结果如表4所示。由表可知,DA201大孔树脂对原花青素的解吸率最高,为60 58%,其次是AB-8,为55 06%,然后是HPD-700, 图2 不同上样液流速对吸附量的影响 Fig 2 Effectsoffeedflowrateonadsorptioncapacity 2 4 2 洗脱剂浓度的选择 原花青素经大孔树脂柱吸附后,需用合适的 87 试验研究 ChinaFoodAdditives 溶剂将其从树脂上洗脱下来才能达到分离纯化的目的,通常根据被分离物质与树脂之间吸附力强弱来选择不同的洗脱剂和相应的洗脱剂浓度。本试验分别选取30%、50%、70%、95%等不同浓度的乙醇溶剂对被吸附的原花青素进行洗脱,解吸流速控制为1mL/min,分别将各次洗脱的浓组分合并,然后测定它们的吸光度值,结果见表5。 由表可知30%乙醇洗脱时,洗下的原花青素不多,用50%乙醇可以洗下大部分,只有少部分原花青素尚未洗下来,用70% 13 可以洗下绝大部分的原花青素,所以用70%乙醇对大孔树脂吸附的原花青素进行洗脱。 表5 不同乙醇浓度对原花青素的解吸效果Table5 Theeffectofdifferentkindsofalcoholsinelution 乙醇浓度(%)洗脱液吸光值 300 108 501 175 700 164 950 024 中国食品添加剂 2 4 4 动态解吸曲线 控制吸附流速为1mL/min,当树脂吸附饱和 后,首先用去离子水冲洗树脂柱(流速3 0mL/min),以洗去其中的水溶性杂质(糖、蛋白质等),洗至洗脱液还原糖反应呈阴性,然后根据上述确定的洗脱条件,采用70%(V/V)的乙醇溶液为洗脱剂,以1 0mL/min的流速对吸附有原花青素的大孔吸附树脂层析柱进行动态洗脱实验,分部收集洗脱液(6mL/管),测定洗脱液中的原花青素浓度,绘制树脂的动态解吸曲线(见图4)。 由图4可以看出,采用体积分数70%乙醇进行解吸时,洗脱峰集中,对称,无明显拖尾现象,采用70%乙醇250mL基本上可以将原花青素 14 完全洗脱下来。 2 4 3 洗脱流速对大孔树脂解吸率的影响 分别采用1 0、2 0、3 0mL/min等不同的流速,用70%的乙醇溶液对已经吸附原花青素的树脂进行解吸实验,结果如图3所示,与上样流速对树脂吸附性能的影响一样,洗脱流速过快,解吸率反而降低,分离效果不好,流速在2 0和 3 0mL/min时的解吸率均在90%附近,当流速为1 0mL/min时,溶剂载样量大,解吸率可达95%以上,但流速太慢延长实验周期,提高成本,综合考虑解吸率和工作效率,洗脱流速选择在1 0mL/min 较为适当。 图4 DA201树脂对原花青素的动态解吸曲线Fig 4 DynamicelutioncurveofPConDA201resin 3 结论 乙醇浓度对葡萄籽原花青素提取率的影响最为显著,提取时间和温度对葡萄籽原花青素提取 率的影响都不显著。其最佳提取工艺参数为:乙醇浓度70%,提取时间120min,料液比1 20。静态吸附实验表明HPD-700对原花青素的吸附率最高为82 85%,其次为DA201,为82 68%,其差值相差不大,而且,这两种树脂对原花青素的吸附量也相同;在解吸试验中, 图3 洗脱流速对解吸率的影响 15 Fig 3 Effectsofeluteflowrateondesorptionratio DA201树脂对原花青素的解吸率最高,为60 58%,而 HPD-700对原花青素的解吸率只有50 83%。结合吸附试验 和解吸实验,确定DA210 88 试验研究 树脂为分离原花青素的最佳吸附树脂。 通过工艺优化,在原花青素浓度为0 15mg/mL时,流速为 1mL/min,以70%的乙醇溶液作为洗脱剂,流速为1mL/min,洗脱剂用量为5BV,可以对葡萄籽原花青素的提取液进行初 步纯化。 参考文献: [1]万本屹,李宏,董海洲.葡萄籽原花青素提取及其应用研究 进展[J].粮食与油脂,2002. 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