铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究

铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究 铁过??,、.. .. 嘶 ,声 尸 明 明 本学位是我在导师的指导下取得的研究成果,尽我所知,在 本学位论文中,除了加以标注和致谢的部分外,不包含其他人已经发 或公布过的研究成果,也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的。 叁冬 研究生签名: 弘/年弓月日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档,可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容,可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文,按保密的有关规定和程序处理。 益叁 研究生签名: 和年多月刃日摘要 摘要 铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素的重要成分并广泛地参与生物体的生长和发育 过程,是人体中最重要的金属元素之一。铁主要从食物和饮水中获取,通过尿液、汗液 和表皮细胞的脱落排出体外。人体从饮食中吸收的铁多于排出的铁。随着年龄的增长, 铁会累积在器官中。铁的过量累积通常伴随着睡眠的紊乱,这些睡眠的变化与老年人的 睡眠特征相似。睡眠与生物节律有着密切的关系。随着年龄的增加导致的铁过度累积是 否与生物钟基因的表达有关系目前还不清楚,本课题利用基因敲除的遗传工程小鼠来研 究这种关系。 对比分析了周龄小鼠和周龄小鼠肝脏中个生物钟基因、、,.、 、和的转录结果显示只有心厂在周龄小鼠肝脏表达减少了%, 其他的生物钟基因的转录没有削弱。与周小鼠相比,周龄小鼠肝脏中铁的含量增加 了约%。喂食周龄的雄性小鼠含有%羰基铁的食物周后,小鼠肝脏中铁含量增 加了倍。检测喂食高铁食物的小鼠肝脏中的生物钟基因的表达,实验发现铁过量累 积小鼠的生物钟基因的转录与周龄小鼠有着相似性,心力的表达下降了%,其他 的生物钟基因的表达没有减少。右旋糖酐铁注射造成小鼠的铁过载模型也显示铁过载会 导致基因转录水平的下降,并呈现出时间和剂量的依赖性。体外实验也进一步证 实,会导致细胞中力基因表达水平的下降。这些结果表明随着年龄的 增加,食物中的铁在体内累积导致心,转录水平的下降。 ’基因的削弱会导致血小板数目的减少和功能的减弱。比较.周龄的野生型小 鼠和,基因缺失小鼠.的尾部凝血速度,结果显示力.小鼠的平均 凝血时间要长倍,这说明,.基因缺失会造成凝血能力的下降。对比野生型小鼠和 心门.小鼠的外周血中血小板的功能,发现凡厂.小鼠的血小板聚集能力下降, 血块收缩变慢,分泌能力减弱,血小板中致密颗粒和【颗粒明显减少。分析比较两种基 因型小鼠的外周血发现,力.小鼠的血小板数目只有野生型小鼠的一半。将巨核细 胞离体培养,结果证实了的巨核细胞产生血小板前体的能力明显下降。对两 种小鼠的巨核细胞内部结构分析发现,.小鼠的巨核细胞的数目相对于野生型小 鼠没有减少,但是.小鼠的巨核细胞的分界膜系统发育异常,出现大量的空泡, 内部颗粒大量缺失。对巨核细胞的含量及分布研究发现,以.巨核细胞内 含量明显增加。由于巨核细胞凋亡的减弱会导致分界膜系统发育异常和含量的大 量增加,所以分析对比了野生型小鼠和.小鼠巨核细胞的凋亡水平,发现 心以.小鼠的巨核细胞凋亡减少。考察了和其受体的表达水平,发现 和其受体在力.小鼠体内表达升高,这些实验结果说明以一小鼠体内摘要 /的表达升高可能是由于血小板数目减少导致的代偿性的增强。通过对巨核细 胞内凋亡相关的基因转录水平的研究发现,,.小鼠的巨核细胞内抗肿瘤基因 表达减弱,导致下游的抗凋亡基因&乒和&厶儿表达升高。这些实验结果表明, 基因减弱降低了转录水平,增强其下游基因和&乩的表达,减少了巨核细 胞的凋亡,导致血小板数目减少和功能的削弱。这些结果与衰老个体的血小板数目的减 少是一致的。 力基因的削弱导致红细胞对外界压力敏感度增加。高剂量的盐酸苯肼注射. 周龄的野生型小鼠和小鼠,实验结果发现力.小鼠的致死率明显增加, 是野生型小鼠的倍。用低剂量的盐酸苯肼注射考察红细胞比容的变化,结果表明 ,.小鼠红细胞比容下降的更明显,说明肋.小鼠红细胞受到盐酸苯肼的氧 化破坏更严重。体外分离野生型小鼠和小鼠的红细胞,在和低渗压力诱 导下,力.小鼠的红细胞溶血率更高,血红蛋白更容易被诱导生成高铁血红 蛋白。由于以.小鼠的红细胞对外界压力敏感导致其更容易被破坏形成溶血, 造 成了力.小鼠有氧代谢和血液中的氧饱和度的下降,脾脏中红髓明显增加,血清 和脾脏中铁含量增加,网织红细胞比例增加,外周血中平均红细胞体积和红细胞分布宽 度增大。通过对红细胞形态分析发现,力.小鼠的畸形红细胞数目增加。心,. 小鼠红细胞中的含量明显下降,细胞膜上酶活明显的增加,离子的浓度 明显升高。.小鼠的骨髓和脾脏中,.的亚基的表达明显升 高。这些结果说明门基因的削弱导致的转录水平上升,增强了红细胞膜上 的活性导致被大量消耗,含量下降,使红细胞对外界压力敏感程度增 加,更容易破裂。这些结果与衰老个体的红细胞对外界压力敏感度提高是一致的。 以上的结果说明从食物中摄取的铁随着年龄的增加而积累在体内造成生物钟基因 力转录水平的下降,从而影响机体的生物钟系统和血液系统。这些实验结果提示成年 人对铁的摄取应该慎重。 关键词:铁过载,衰老,厂,血小板,巨核细胞,红细胞,溶血 ? 一~ , , , . . 诵 . .? , . .、,. . .’ ? . . ,,,. 血, 尸力 %. %. , ’. ? . % 、析 . . ,. . . 一.一 ,,诚% .尸,.一 一.. 一 .... ,, .叫 谢廿 . , , . . . . . 一 .一; . 、析. . 。 . :。,,,,, ‘, 目 录 目 录 摘 要。...............................。................................ ...............................。................... ................................................................. ............................................. 绪 论..................。.....................。.............。.....................................。.....。............ .铁的生理功能和铁过载的危害..铁的生理学功能. ..铁累积的危害?. ;.铁的吸收和外排过程?...?。? .生物节律和生物钟基因??...生物节律 ..昼夜节律.. 。 ..生物钟基因调控路径:??..?. ..生物钟基因.衰老对生物钟系统的影响一 ..衰老对生物钟输出通路的影响 ..衰老对中心生物钟的影响?. ..衰老对外周生物钟的影响.生物节律对巨核细胞发育、血小板的生成和功 能的影响?。 ..巨核细胞的产生、发育和成熟的过程 ..巨核细胞的成熟调控机制..血小板的产生与凋亡? ..血小板功能异常??.. ..生物节律对巨核细胞和血小板的影响 .溶血的原因和生物节律对红细胞的影响.. ..溶血原因的研究进展? ..昼夜节律对红细胞的影响.本论文研究的目的和意义?。 ..研究目的 ..研究意义??.. .本论文的主要内容?. 参考文献。 铁过载削弱生物钟基因的表达? 目 录 .引言.材料与方法? ..实验动物及饲养。 ?一 ..试剂.?..:??. ..实验仪器 ..小鼠铁过载模型的建立及处死时间的选择? ..铁代谢指标的检测..细胞同步化及的处理. .. 的抽取、的生成及基因表达分析??。 ..数据的余弦拟合 . .结果与讨论.. 基因在衰老小鼠肝脏中表达减少??. .. /老龄小鼠表现出铁过载的现象?。 . , ..羰基铁导致的铁过载削弱了生物钟基因的表达??。 ..右旋糖酐铁削弱了肝脏中生物钟基因的转录 .. 处理细胞削弱了生物钟基因的表达? ..血红素代谢基因的表达在高铁食物喂养小鼠和老龄小鼠有着相 似性??. ..讨论??“ .本章小结...??. 参考文献??.:? 生物钟基因缺失导致血小板数目减少和功能减弱。? .引言.方法与材料..实验动物??.. ..试剂??. ..实验仪器??.. ..实验小鼠基因型鉴定.. ..小鼠尾部流血实验..制备洗涤过的血小板 、富含血小板的血清, 和没有血小板的血清,一 ..血块收缩实验。 ..血小板聚集实验 ..血小板分泌实验. 目 录 ..血气分析和氧代谢指标测定..红细胞常规分析?. ..红细胞形态分析? ..透射电镜分析?:. ..红细胞膜蛋白分离及分析 ..铁含量测定及组织学研究 .. 盐酸苯肼诱导溶血性贫血??.. .. 诱导的溶血.. ..谷胱甘肽和丙二醛的测定??. .. 高铁血红蛋白形成实验? ..渗透脆性分析?。 ..红细胞中含量的测定? ..红细胞膜活性测定? ..红细胞膜内、十离子浓度的含量?;..??.. .. 的分离及相关基因的表达分析??. .结果与讨论? ..高剂量的苯肼注射后,小鼠死亡率增加..低剂量的苯肼注射后,小鼠红细 胞贫血更严重. ..导致.小鼠红细胞溶血更严重。 .. 基因小鼠的红细胞更容易被诱导形成高铁血红蛋白 。 .. .小鼠导致血液中含氧量下降氧代谢下降 .. .小鼠的红细胞对渗透压力更加敏感??. .. .小鼠血铁增加、脾脏中红髓和铁含量增加?。 .. 没有导致贫血 .. .小鼠的红细胞中畸形红细胞数目增加?. ..野生型小鼠和.小鼠的红细胞膜蛋白没有明显差异?. .. .小鼠的红细胞中谷胱甘肽减少,丙二醛?增加??. .. .小鼠的红细胞中含量下降、含量上升?。 .. .小鼠的红细胞膜的活性上升一 .. .小鼠的红细胞内部十离子浓度上升? .. 基因的缺失导致高表达..讨论.. .本章小结??. 参考文献??. 结论、创新点、建议和展望? .结论?.. .创新点?.二:?二. .建议和展望致 谢................................................................... ............................................ 博士期间研究成果??博士论文 铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研 究 绪论 .铁的生理功能和铁过载的危害 ..铁的生理学功能 铁是人体中最重要的金属元素之一,几乎高等动物所有的细胞中都含有铁元素。 铁在人体中的形式多种多样,生理功能也表现出多样性【刁】。铁广泛地参与了生物体的 生长和发育过程,例如:铁参与构成了红细胞中的血红蛋白,其生理学功能是为生物体 内各个组织输送氧气同时将二氧化碳排除体外;铁构成了心肌和骨骼肌等肌肉组织中的 肌红蛋白,其生理功能与血红蛋白相似可以贮存氧,并将氧运至线粒体中进行能量代谢; 由铁所形成活性中心的细胞色素作为辅基的电子传递蛋白,广泛参与生物体组织中的氧 化还原反应;铁还与各种酶结合形成过氧化物酶、过氧化氢酶、单胺氧化酶等,在细胞 中发挥着分解代谢废物的解毒作用和抵抗细菌的功能;铁与机体中能量代谢关系密切, 三羧酸循环中大部分的酶和反应因子都含有铁或者与铁结合时才能发挥其生理作用;铁 还能影响生物体内的某些重要蛋白质合成和免疫机能的应答过程。铁在生物体中的作用 如此重要,缺铁会导致机体的一系列异常,因此补铁剂的开发就被提上了日程,并成为 营养学研究的重要方向。 最初补铁剂的尝试始于世纪,一个英国人将铁锈混在葡萄酒里用来治疗倦怠类 疾病。年实验发现硫酸亚铁可以被人体吸收,随即硫酸亚铁被开发并成为第一种应 用于临床的补铁剂?】。随后,人们开始了对新型补铁剂孜孜不倦的追求,碳酸亚铁、 氯化亚铁、磷酸铁钠、焦磷酸铁、焦磷酸亚铁、焦磷酸铁钠、氨基磷酸铁等无机补铁剂 相继被开发并应于临床。经过长时间的研究,人们发现这些早期开发的无机补铁剂有着 自身的诸多缺陷,这些缺陷使得人们对这些最初开发的无机补铁剂日益不满。究其原因 主要有两点:一是早期无机补铁剂中的铁元素由于其不稳定性易与硫化物或多酚结合导 致食品变色,变质,甚至对人体的胃肠有着严重的刺激作用;另外早期无机补铁剂由于 其不稳定性不易被人体充分吸收利用。近些年来,人们为了完善补铁产品的性能,将注 意力投入到新型补铁剂的开发和研制过程中。其中具有典型代表意义的是类血红素铁的 研究开发。与早期无机补铁剂硫酸亚铁相比,血红素铁由于是人体中本身就 大量存在的 物质,因此对人体的胃肠没有严重的刺激作用,而且人体对血红素铁的吸收率比早期无 机补铁剂有了很大的提升。血红素铁作为新型补铁剂虽然有着自身的优势,但是它也有 着自身所继承的一些缺陷。血红素由于是卟啉环包裹铁元素,其含铁量比较低。另外在 血红素铁的制备和保存上还存在着诸多问题。对于非血红素类补铁剂的研究也取得了一 定的进展,相继开发出了乳酸亚铁,葡萄糖酸亚铁,柠檬酸亚铁等多种新型补铁剂。在博士论文 绪论 这其中,右旋糖酐铁和羰基铁是最近几年中补铁剂研究的热点。右旋糖酐铁又称为葡聚 糖铁,含铁量较高,达到.%,年和首次制备并应用于临床, 作为一种治疗缺铁性贫血的药物。右旋糖酐铁注射后可以加速并促进机体血红蛋白的合 成,一纠正组织器官缺铁和含铁酶活性降低等症状,主要用来缓解缺铁性贫血这类疾病。 右旋糖酐铁主要通过淋巴系统缓慢吸收,三天内吸收可以达到%,.周内吸收率达 到%。羰基铁粉在年由德国人首次研制成功,年在德国开始了产业化生产。 作为新型补铁剂的研究发现,其半致死率比硫酸亚铁要高倍,生物体对它的吸收率 高达%,对生物体机体的胃肠刺激较小。钝化过的羰基铁粉也具有含铁量高、成本低、 稳定性强、在空气中氧化还原性弱等优势。目前羰基铁粉已经正式被美国药品管理监督 局批准,可以直接添加到食品中作为一种新型补铁剂。 . . ..铁累积的危害 铁累积会导致机体一系列的紊乱和疾病的发生。铁过载对血液系统有着重要的影 响。周敏等【】用处理巨核细胞后发现,巨核细胞受到影响, 导致产生血小板前体的能力减弱,这说明铁过载会导致巨核细胞产生血小板的能力下 降。另外通过研究铁过载的病人的红细胞发现,由于游离铁的存在,红细胞中活性氧 明显增加,红细胞中抗氧化物质谷胱甘肽含量明显减少,氧化产物丙 二醛含量增加,改变了红细胞膜活性,红细胞内和离子浓度明 显增加,这些实验结果说明铁过载改变了红细胞中的氧化还原的平衡,使红细胞更容易 破裂,导致溶血【。】。肝脏是机体内的重要调控铁代谢的器官,同时也是铁在 体内主要 的累积器官【.】。因此,肝脏也成为铁过载引起破坏的主要器官。铁的累积与肝脏内疾 病的发生也有着密切的联系。铁的累积引起的肝细胞中胆固醇合成增加和纤维化的发 生,铁会刺激肝脏中合成胆固醇的酶的表达增加,使肝脏合成胆固醇的功能增加,引发 一系列肝脏疾病。肝脏受到铁的慢性损伤会导致肝纤维化,而肝纤维化通常会发展为肝 硬化。通常发生在严重的遗传性血红蛋白沉着症的病人,其最主要的病理特征是在肝细 胞内储存了大量的棕褐色的含铁血黄素,肝脏的纤维化主要出现在肝脏的血管内及其周 围,原因之一是因为在血红蛋白沉着症病人中,来自胃肠道的富含铁元素的血液经过门 静脉周围的肝细胞。铁在心血管疾病的发病过程中有着多个方面的作用川。铁直接参与 了心肌缺血.再灌注损伤的过程,影响心脏的传导系统,损害心脏功能。过量的铁累积 会增加心脏的纤维化的几率。铁同样也参与了动脉粥样硬化的形成过程。缺铁性贫血的 病人不容易患心血管疾病,而铁过载会促进动脉硬化的形成。最近的临床报 告显示,心 脏病患者体内铁的含量明显高于正常人,铁含量的增加与血压、血细胞比容、胆固醇、 低密度脂蛋白在体内的升高有着密切的联系。目前的理论认为,体内铁含量升高增加了 心脏病发生率的机制可能与铁过多导致的自身的氧化水平提升有关,铁含量的降低有抗 铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究 博士论文 氧化作用,使心脏病的发病几率降低。另外,目前大量的流行病学资料显示,体内铁的 贮存过多与肝、结肠、直肠、肺、食管、膀胱等多个器官的肿瘤发生和转移有关。 在注射右旋糖酐铁的部位容易发生肉瘤,且肉瘤的发生与铁的剂量有着极强的相关性。 通过对血红蛋白沉着症病人进行研究发现,肝癌发生率为普通人群的倍。在对普通 人群调查后发现,铁含量较高的人患癌症的几率也是正常人的.倍。铁过载的病人在 患急性淋巴细胞白血病后,死亡率也明显增加。在一些自发性的铁累积动物模型中也有 着相似的结果。机体内铁累积过多诱发肿瘤的发生和发展的可能机制包括以 下两个方 面: 一方面,铁过多诱导的脂质过氧化反应的增强,导致机体氧化和抗氧化的平衡失 调,直接损伤,诱发突变。另一方面,铁是肿瘤细胞生长和复制的限制性营养素。 体内铁水平升高可增加肿瘤细胞的生存和生长。铁、氧自由基、肾小管上皮细胞间的相 互作用机制正日益受到重视困之】。正常情况下,体内的铁以血红素铁和非血红素铁等形 式存在。但在急、慢性肾脏病变,尤其是伴有蛋白尿的临床病人和动物模型中可发现小’ 管液及上皮细胞质内具有催化活性的游离铁显著增加,并且可积聚于肾近曲小管和远曲 小管细胞的溶酶体中,偶然见积聚于线粒体内。铁的积聚与蛋白尿、肾小管间质病变、 脂质过氧化、次全切除肾的肾小球滤过率、残余肾重量等病损程度直接相关。铁负荷可 增加肾缺血损伤的易感性,而肾小管上皮细胞是铁介导的氧自由基损伤的主要部位。小 管间质病变又是继发性肾单位毁损和慢性进展性肾功能衰竭的主要决定因素。在肾小管 细胞内铁催化的氧自由基反应是缺血性和中毒性肾脏病变发生的重要步骤, 其作用机制 涉及氧化损伤、缺血损伤和耗竭、溶酶体损伤、尿液中其他蛋白的相互作用、抗氧 化酶活性减弱等。脑部的铁过载与许多的脑部疾病也有着密切的关系,其中帕金森 病是以脑中多巴胺能神经系统病变和损伤为主要病理改变,以震颤、肌肉僵直、运动困 难、姿势反射为特征的综合症;阿尔茨海默症是以神经元纤维缠结和颗粒泡样变性为病 理改变,以思维、语言、记忆、运动障碍为特征的神经系统疾患。脑组织中含有高浓度 的不饱和脂肪酸,而自由基清除功能却相对缺乏,某些特殊脑区内铁的含量较高。多巴 胺代谢的氧化产物有过氧化氢,由于铁离子存在时,过氧化氢转化为危害更大的羟自由 基,导致细胞膜的脂质过氧化。其它一些脱髓鞘疾病如多发性硬化症等也与铁内环境稳 态破坏有关。 另外铁与睡眠有着密切的关系【引,以前的研究发现铁过载的病人通常伴随着失眠、 睡眠时间缩短以及难以进入深度睡眠的症状。通过给小鼠喂食高铁食物发现小鼠的总体 活动频率显著增加,特别是小鼠在休息时间内 的活动频率增加。这些 睡眠上的变化与衰老个体睡眠特征相似。这些证据说明铁过载影响了睡眠相关的因素, 导致睡眠紊乱。 为了研究铁过载与机体的关系,构建铁过载的动物模型就显得十分必要了。铁过载 的动物模型目前主要有两种,第一种是通过一次性注射大剂量的右旋糖酐铁可以使小鼠铁被小肠粘膜地表皮细胞吸收,其吸收部位主要在十二指肠和空肠上段【一。 等用同位素标记后发现并证明铁主要在小肠被吸收。食物中的铁分为血红素铁 和非血红素铁两种,其吸收机制不同。膳食中%以上铁都是以非血红素铁的形式存在, 并基本上由三价铁组成的,必须在胃中经胃酸作用使之游离,被还原剂还原成二价铁后 才能被肠粘膜表皮细胞吸收。二价铁进入小肠上皮细胞是由二价金属离子转运蛋白介 导完成的。据报道,三价铁的摄取还另外有专门途径,即通过整合蛋白一游动铁蛋 白.类铁蛋白途径来实现的。血红素铁主要来源于动物性食品,并主要存在于血红蛋白 和肌红蛋白中。它的吸收不受到肠道环境条件的影响,在小肠碱性条件下呈 可溶性,故 血红素铁吸收率很高。血红素铁被小肠上皮细胞整体地摄取,然后肠腔中血红蛋白在肠 道酶作用下分解为血红素和球蛋白降解产物,血红素以完整的金属卟啉形式进入肠粘膜 上皮细胞,在胞浆中的血红素氧化酶作用下卟啉环被打开,释放出游离的二价铁,进入 非血红素铁池中,参与细胞内的铁代谢。在小肠吸收上皮细胞刷状缘处,血红素铁与非 血红素铁吸收机制不同,进入纽胞后,由细胞向血液转运过程相似。铁从细胞被转运到 血液过程中必须要有蛋白质参与,否则会导致自由基生成,从而破坏膜结构,进而导致 组织损伤。铁被粘膜细胞摄取后,当机体需求高时铁优先转运过基底膜,然后在基底膜 处被释放进入血液。铁被粘膜细胞摄取后,当铁过多时,与特异的胞浆蛋白结合而滞留 在细胞内,然后随细胞脱落后返回肠腔。铁进入血液后,绝大部分与血浆中转铁蛋白结 合,经转铁蛋白一转铁蛋白受体系统运送至机体各个需铁组织。剩余的部分铁被输送到 肝、脾和骨髓中储存起来或在肠粘膜细胞内被氧化,并与脱铁铁蛋白形成铁 蛋白,便以 铁蛋白形式被储存起来。人体每日普通饮食中所供给的铁量为. ,其中%.% 被小肠吸收,吸收量约为 /天。 铁主要由胆汁、脱落粘膜细胞和少量血通过粪便排出,部分通过汗液、皮肤脱落细 胞和尿液排出【仆州。正常情况下,人体每天铁的外排的量小于吸收的量,小于 /天。 随着时间的延长,这种不平衡可能会导致铁在衰老机体中的累积。在本研究中,同样发 现在衰老的小鼠体内也出现了铁的累积,这预示着铁的累积与衰老相关疾病的发生有着 密切的联系。同时,这也说明研究铁过载对实验小鼠的影响对临床有着重要的指导意义。 铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究 博士论文 .生物节律和生物钟基因 ..生物节律 自然界中生物的生命活动、生活习性都有一定的周期性变化【巧】。生物的内在节奏 常与环境周期变化相对应,几乎都发生在固定的一段时间里,呈现了同种周期性的生活 节律,调节着生物体的行为和生理的变化,人们把这一切现象产生的原因归于生物体中 生物节律的存在。生物节律是生物在进化的漫长历程中,在体内形成的一种近似于钟摆 的体系,生物节律能够随着时间的变化,调节生物体自身的生理活动,使其在一定的时 期开始、进行和结束。生物节律的产生是通过一系列复杂的生理过程而实现的,是生物 体内复杂的化学和物理变化的结果。通过长期的观察分析,前人将生物节律分成以下几 种,以便进行相关有针对性的研究工作。第一种称为潮汐节律,是由月球引力引起的, 很多潮间带的生物的活动都表现出明显的潮汐节律;第二种称为月节律,节律周期为? 天,与潮汐节律密切相关,主要在动物的生殖和发情周期上发挥作用;第三种称为日节 律,其节律周期是小时,也被称为昼夜节律;第四种称为年节律,节律周期为一年。 这四种周期构成了基本的生物节律体系,并在一定程度上影响着地球上的各种生物。通 过归纳和分析这四种节律,人们总结出生物节律内在的三个特点:普遍存在性。在 已研究过的生物体从低等生物到高等动物以及已知的生理生化过程由整个系统、 器官、组织直到单个细胞或细胞器均已证实随着时间的变化呈现有规律的节律性变化。 内源产生性。生物节律主要由生物体或细胞内的类似于钟摆的体系所控制。这种 时间钟摆机制使生物体能够测定时间并伴随着环境条件的变化规律性的相应变化。 可同步性。在周围环境同步因子的作用下,生物节律可被调节并精确地顺应环境中的周 期性的变化,并与外界环境变化同步。这种同步性往往通过改变环境中的某些周期性因 素来实现并发挥作用。 ..昼夜节律 对于人类而言,人们往往最关心的就是生物节律中与人们生活密切相关的昼夜节 律。昼夜节律在生物体中体现在许多的生物体的行为、生理生化指标呈现出小时的 周期性变化。其不仅具备生物节律的通性,也有本身的一些特点。昼夜节律的特征包括: 昼夜节律的产生也是内源性的,其不仅受到外界环境因素的影响包括光照和温度 等,而且在外界条件一定的情况下,其拥有自己特有的运转方式。昼夜节律的周期 一般为小时,但对于不同的情况,其周期很难保证是准确的小时,而且不同种类 的生物其昼夜节律周期略有不同。在正常的生理温度内,昼夜节律对温度不太敏感, 昼夜节律在一个比较大的温度范围中相对保持不变,具备对温度的补偿特性。这个特点 对于稳定昼夜节律十分重要。昼夜节律被外界环境因素干扰后,可以发生生物节律绪论 博士论文 的重新调整并复位。昼夜节律具有可遗传性,这点在哺乳动物体内尤为明显【.。 昼夜节律在哺乳动物中的作用已经被广泛认知了。昼夜节律对人体的影响也日益得 到了人们的重视。人类的许多生理活动和疾病的发病受到昼夜节律的影响。例如人体中 一许多生化指标也呈现出明显的节律性变化【,具体表现在血糖的浓度、血压、心肌的 搏动、血液中与的含量、血小板的聚集、皮质醇、胰岛素、瘦素、血管紧 张素、游离脂肪酸等等。例如:正常人的体温、心率及血压在下午时达到峰 值。另外, 疾病的发病时间也呈现出节律性,例如:心血管疾病发作具有明显的昼夜节律性,午夜 零点和清晨点之间,是心血管疾病意外发作的高峰期。血液中淋巴细胞计数在夜间是 最多的,上午最低,在艾滋病患者体内,这种淋巴细胞数目的节律性变化消失了。这个 结果说明,昼夜节律不仅可以调控人体的生理和生化过程,而且某些疾病对昼夜节律的 变化有着明显的影响。所以,研究昼夜节律对哺乳动物的作用,以及发现影响生物节律 的调控因素,成为目前的研究热点,这也是驱动我们对这一领域不懈追求的原动力。 昼夜节律的产生机制同样成为人们研究和关注的焦点。目前的研究认为,昼夜节律 .的产生是由于机体内内源生物钟所驱动的【。生物钟体系不停的自激激荡同时根据接 收到的外界环境周期性变化的信号来完成调控自激振荡,使机体的生命活动的近日节律 与环境同步,随着外界环境昼夜的变化能有节奏地、协调地进行。为了进一步研究生物 钟体系的构成和运行机制,前人在分子水平上对生物钟体系进行了长期的研 究。通过一 系列的实验发现生物钟系统在分子水平上是由输入通路、中央振荡器和输出通路三部分 组成的。输入通路将机体或细胞感受到的外界变化信息传递给中央振荡器,在后者整合 自主调节环路对生物钟基因表达的节律性调节以后,经输出通路输送给靶器官,使生 物体表现出昼夜节律性的变化。一般认为哺乳动物的中心生物钟位于下丘脑的视交叉上 核。生物钟可以通过眼睛中视网膜上特殊的光感受器感受昼夜的光强度变化,再 通过视网膜到的“视网膜.下丘脑通路的信号传入,以导引位于的主生物钟 的节律性振荡,使中心生物钟的输出节律与昼夜光线的变化一致。其中振荡器是外部信 号与内部信号联系的枢纽,振荡器内部有一系列的机制对生物钟进行调控。振荡器对于 整个生物钟系统而言相当于中央处理器,并且由一组呈现昼夜节律性表达的基因及其翻 译出的蛋白质组成。在果蝇、啮齿类和高级灵长类体内,已经发现了许多的生物钟基因 和钟控基因。这些基因的及其蛋白质产物构成的自主调节的转录和翻译的反馈环,是生 物钟运行的分子生物学机制。 ..生物钟基因调控路径 哺乳动物细胞内存在正反馈调节图.和负反馈调节图.和图.两条转录 水平的环路嘲稍,使得关键的钟基因转录的及表翻译的蛋白水平发生振荡。 和二聚体为钟基因的转录提供了最基本的动力。和通过组成碱性 、 博士论文 铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究 螺旋.环。螺旋蛋聚体结合到.上从而激活基因转录,诱导表达、 和蛋白质,以及和两种蛋白质。蛋白质和转运到核内 与和形成稳定的抑制性复合物,通过直接与幻『作用,来抑制凡以 一 和尸力的表达图.。 图.哺乳动物生物钟基因调控的核心环路和的异源二聚体在激活 转录的同 时,也通过激活 和孤儿核受体 基因的转录,蛋白则通过与 &湘互作用来抑的转录。因此,当和转运到核内与和 形成稳定的抑制复合物,通过直接与或聚体作用,在抑制订和尸力 表达的同时,也抑制了的转录,使得的转录解除抑制,那么蛋白 增加并进入到下一个循环图.。 另一条则为蛋白复合体由、和组成与蛋白形成的辅助调节 环路和的异源二聚体使得印基因表达增加,增加的蛋白使 /二聚体对/诱导转录的效率增强。但由于.复合体对 /的抑制作用,又产生了对幼基因转录的抑制;相反,贝使 /对/诱导转录的效率下降。与核受体结合则产生了 对转录的抑制作用。因此,蛋白被/诱导转录及表达,在白天 时促进的转录表达,而在夜间将近的时候大量表达来抑制心,的转录图.。 绪论 博士论文 图.哺乳动物生物钟基因调控的辅助环路一 图.哺乳动物生物钟基因调控的辅助环路二 ..生物钟基因 基因是最早克隆并分离出的生物钟基因,全长,它于年由 大学和大学的两个研究小组分别克隆和分离【‘。基因有 个外显子,转录产物为. 的,蛋白总长个氨基酸。利用诱变, 博士论文 铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究 等筛选出了果蝇的个变异的等位基因,儿长周期基因,短周期 基因,,去周期基因进行分析,儿突变型具有延长的昼夜节律.小时; 凡心突变型昼夜节律明显缩短;而则缺乏昼夜节律,揭示了节律缩短、延长、 或 消失的分子基础:上述的实验结果证实了基因是生物节律不可或缺的组成部 分。 为了进一步研究为什么这三个等位基因拥有不同的作用,人们对蛋白进行了 分析 发现,基因含有结构域。结构域在感光作用和昼夜节律基因反应中发挥 着重要作用。通过分析三个等位基因的产物,发现在重复的上游有一个终止 密码子,即由突变成,产生一段约为个氨基酸的未成熟的肽段,导致昼 夜节律性的消失。凡心与野生型的区别在于一个丝氨酸错义突变成天冬氨酸,该突变发 生在,.突变位点和重复区之间。这个丝氨酸是野生型蛋白的一个磷酸化位 点,该位点磷酸化对产物活性有反向的调节作用,起着维持正常昼夜节律的作用。丝氨 酸突变为天冬氨酸后,这个位点不能磷酸化,导致昼夜节律加快。儿中有一个核苷酸 置换使撷氨酸变为天冬氨酸,这种替换使节律延长的原因是氨基酸的置换导致蛋 白的活性或稳定性降低。肋和儿突变都发生在结构域内一,凡心突变发生在 结构域的下游。上述结果能够一定程度上解释人群中的昼夜节律周期长度的差异。 在果蝇体内,特定部位的,.基因的和相应的蛋白产物的量,以大约的 周期循环变化。在成年果蝇脑中,通过蛋白的表达定位研究显示,在脑中央和视叶之间 的侧神经元处,,.基因呈周期性表达,因此认为侧神经元是支配成年果蝇日活动的可 能起搏部位。在鼠类和人体内也发现了类似于果卿,.的基因,小鼠和人的基因约 ,含个外显子,它们的结构具有很强的同源性。,.基因的’端鉴定了个高保守序 列,有%.%的同源性,并具有几个调控作用很强的部分,包括个.和个环状 的反应元件。尽管基因通过转录抑制而调控的周期变化,但由于蛋 白缺乏结合区,故蛋白与之间不太可能发生直接交互作用。在小鼠、大鼠 和人体中,存在着,久厂、三种亚型,通过突变的力等位基因编码的蛋白质, 其结构域羧基部分丢失了个残基。该突变型纯合子小鼠活动的昼夜节律周期变短; 视交叉上核中的、厂 节律减弱,振幅严重减少; 的峰值被压低 约%: 水平提前上升,其峰值顶端被截短; 水平不变。心刀 基因缺失小鼠的尸, 的节律不变;基因缺失小鼠的心?、,、和 的节律不变,而且它们行为的昼夜节律继续存在。上述结果说明,.在中维 持节律的稳定性、精确性,与节律的周期与振幅关系不大,在外周器官中主要起调控节 律的周期和振幅。以在处,与节律的周期及振幅维持有关,几乃与节律关系不大。 近几年的研究发现蛋白可以被磷酸化并被降解。年意外发现了叙利亚仓鼠 突变,该型突变纯合子仓鼠的睡眠.觉醒周期由.时缩短为时。该位点基 因定位于小鼠的第号染色体,定位于人的第号染色体,它是一种蛋白激酶。该激酶 绪论 博士论文 能与结合并对瞄行磷酸化。一旦磷酸化后.被滞留于细胞浆中不能进人细 胞核中,促进堪因的转录.蛋白稳定性降低,在胞浆中被蛋白酶系统所降解。 这些实验结果说明酪蛋白激酶对生物钟有着重要的作用。 一 生物钟基因以是基因家族中的一个重要组成部分,其主要在 大脑中表达,同时在外周组织中也有存在【?毗。凡力基因的发现是通过数据 比对生物钟基因尸‖发现并识别的。通过定位实验发现人体的生物钟基因,在号 染色体上。斑马鱼、负鼠和黑猩猩的力基因也在号染色体上。然而并不是所有生 物体的力基因都在号染色体上的。小鼠的力基因在号染色体上,大鼠的凡力 基因在号染色体上,恒河猕猴的,基因在号染色体上,非洲爪蟾蜍的心门基 . 因在染色体骨架上。力的类似物在鸟类、蜥蜴、鼹鼠、田鼠、马、绵羊体内都有 存在,但是其具体的定位在哪里仍然不确定.通过分析人类和小鼠的心门基因发现, .。都包含着个外显子,人体中的,基因和蛋白分别是由 个碱基和 个氨基酸组成,小鼠的,基因和蛋白是由 个碱基和个氨基酸组 . 成,这说明两者具有极强的相似性。 凡门基因转录的调控目前有两个主要方式,其中之一就是通过,二 聚体驱动.来实现;其二就是通过/二聚体驱动.来实现。另外还 有一些信号通路也能够影响凡,基因的转录,其中包括.结合在心,的启动子 区域起到转录调控的作用;血红素也对门基因的转录有着明显的调节作用; 向小鼠体内注射血红素或用血红素处理细胞都会导致生物钟基因厂转录水平降低。 这可能与血红素诱导细胞内的血红素分解增加有关。进一步的研究发现/ 复合体与力基因的启动子区域结合抑制凡刀基因的转录;/ 通过结合力 基因的启动子区域对力的转录有促进作用等等。 之前的实验证据证实其,基因在许多的生理生化过程中起着重要的作用。力 基因与肿瘤有着密切的联系。缺失蛋白功能的小鼠呈现出自发性肿瘤,同时改变 了一系列细胞周期和肿瘤抑制基因的表达,包括 、 、和。 其中受到蛋白的直接调控。因此被认为也通过调控损伤反应元 件实现其对肿瘤的抑制。在肺癌中发现凡,.,,和刀基因转录下降。过表达生物 钟基因厂会导致肿瘤细胞凋亡,从另一方面证实了前人的研究。这些研究发现说明 生物钟基因凡,对肿瘤有着明显的抑制作用。最近的研究发现生物钟基因心刀与免疫 系统的关系十分密切。研究结果显示力基因缺失小鼠脾脏中吖的表达失去了节 律性,说明心门基因对于吖的节律性有着明显的调控作用。力基因缺失小鼠能 够抵抗由诱导的内毒素休克,伴随着血清中吖和.的水平的下降,这些实 验结果说明凡门基因对于免疫因子的产生起着重要作用。其外,以基因缺失会导致 心血管系统的异常。在高血压模型小鼠中,,基因的表达发生了明显的变化,这一结 博士论文 铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究 果暗示着生物钟基因凡,在心血管疾病发病过程中起到的重要作用。后来进一步的研 究发现,门基因敲除小鼠的血管分泌一氧化碳减少,增加了.的分泌, 其血管更容易衰老并且伴随着血管的功能下降。基因的表达水平与机体的基础代谢 也有着密切的关系。凡,基因缺失小鼠的奔跑耐力明显减弱,对其肌肉研究发现肌肉中 糖酵解的酶酶活上升,说明其获得能量更多的依赖无氧呼吸,说明其有氧代谢效率下降。 后来的研究发现凡力基因缺失小鼠的肌肉力量明显减少,在绳子上的耐力明显减弱, 时间缩短。这暗示,基因影响了基础代谢的类型。进一步研究认识到力基因缺失 会影响神经系统。一系列的研究发现,刀基因缺失小鼠对食物没有明显的饱足感,大 量摄入食物,没有节制。进一步发现,力基因与睡眠相位前移症候群也有着密切的联 系。另外有研究发现心力基因缺失小鼠影响了谷氨酸转运子的表达,导致 小鼠对酒精大量消耗。此外,最近的研究也发现了凡刀基因在皮肤过敏中的重要作用。 血液系统对于维持机体的正常功能有着重要作用,目前的研究对心刀基因对血液系统 的影响没有相关的报道,因此研究心力基因对血液系统的影响显得非常必要。 , ?? ‘ .衰老对生物钟系统的影响 随着年龄的增加,生物体出现衰老的症状。表现为器官萎缩、新陈代谢下降、记忆 力衰退,许多生理和行为的节律包括运动、睡眠、体温节律等也发生了不同程度的 变化。通过对这些现象研究分析,结果发现衰老对生物钟的输出通路、振荡器等有着不 同程度的影响【‘ . ..衰老对生物钟输出通路的影响 衰老对生物钟输出通路的影响表现在以下几个方面:衰老对生理和行为节律的 振幅及稳定性的影响:衰老使生物体内各种生理和行为节律的振幅减弱,并使其稳定性 下降。等记录年老大鼠的体温和睡眠节律,发现老年大鼠的日平均体温比年轻小鼠低, 体温节律也不稳定,振荡幅度降低,同时慢波睡眠时期和快速眼动时期的振荡幅度也降 低了。此外,老年人的激素水平节律、睡眠、觉醒节律、体温节律也出现了振幅减弱现 象。衰老对生理和行为节律运转周期的影响:衰老影响生物体行为节律的自由运转 周期。先前的研究发现,年老的大鼠和仓鼠行为节律自由运转周期缩短。研究还揭示了 老年仓鼠行为节律的自由运转周期不受年龄的影响。另外,有关衰老对小鼠行为节律自 由运转周期影响的报道也不一致。研究表明在:的条件下,/和/ 老年小鼠的行为活动节律的自由运转周期延长,而在持续黑暗条件下研究发现/ 老年小鼠和/老年小鼠行为节律周期缩短,因此衰老对小鼠行为节律自由运转周期 的影响与实验所采用的光条件以及实验小鼠年龄和品系有关。衰老对生理和行为节 律生物钟时相及同步速率的影响:老年动物行为和生理上许多生物节律时相性发生前绪论 博士论文 移。在大鼠体温和行为节律的研究中发现,在:光一暗周期下老年大鼠体温和行 为节律生物钟时相前移,当光一暗周期从:变为:,即光照时间缩短 个小时后,老年大鼠体温和行为节律生物钟时相向后移动了小时。另外的研究结果显 示,与正常光一暗周期:相比,老年大鼠夜间开始活动时间和体温开始升高时 间比年轻大鼠明显推迟。通过对人类的研究发现,老年人睡眠.觉醒的节律中时相前移 也是一种普遍现象。 ..衰老对中心生物钟的影响 许多研究揭示了大脑的下丘脑视上核受到衰老的影响。等检测老 年大鼠内基因的表达节律,发现在体外超过周的时间内培养物振荡节律虽 然不变,但其自由运转的周期缩短。在等的研究中,将大鼠的胚胎组织移植入 雌性中年大鼠,雌性中年大鼠的恢复了昼夜振荡能力。以上研究揭示了衰老对 产生了不可忽视的影响。衰老影响了的以下几个方面:衰老对经递质及 其自发放电节律的影响:通过对老年大鼠内部结构的研究发现,老年大鼠分泌的 神经递质数量发生了变化。等发现雄性老年仓鼠血管活性肠多肽?的 的含量表现 表达量明显降低。在等的研究中,雌性大鼠年轻时中 出显著的昼夜节律,到中年后的表达节律消失,同时研究发现年轻雌性大鼠白天 和黄体生成素含量几乎同时达到峰值,如果用反义核苷酸或抗体抑制 年轻雌性大鼠体内表达,峰值出现的时间将延迟,同时振荡幅度也被削弱。因此 中年雌性大鼠 兰天峰值的缺失与峰值出现时间延迟和振荡幅度削弱有关。 等报道雄性老年仓鼠和大鼠内 衰老对内精氨酸加压素也有影响 振荡节律不受年龄影响,并认为这与老年动物室旁核勾促肾上腺皮质 激素释放激素节律消失,肾上腺皮质酮有昼夜振荡能力现象有关,因为作为的 一个输出信号,其作用位点包括皮质类固醇生成区。但对灵长类的研究显示老年动物 中和数目增加,自由运转周期缩短。衰老改变中生物钟基因的表 达:近年来,哺乳动物生物钟基因的发现为研究衰老对生物钟基因的影响奠定了基础。 和作为分子振荡机制负反馈回路的主要成分,对生物钟调节起着重要作用。 等对年轻和老年大鼠中心以、力、 昼夜节律进行检测,发现除了 的振荡幅度有轻微下降外,以、,、的表达量并不受到衰老影响。 另外,衰老对和基因的表达影响较大。等利用原位杂交技术发现老年 仓鼠中心柳门表达节律不变,觚和以基因表达减少。等发现在实 验小鼠中只有心,基因表达衰弱,、及并没有明显变化。老年大鼠 下丘脑室旁核和松果体组织中,.『、力表达不受年龄影响,但对老年大鼠肝脏 和心脏进行研究发现,老年大鼠肝脏和心脏中心,.基因表达水平低于中年大鼠,心脏中 ‘ 铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究 博士论文 基因含量高于中年大鼠。因此,衰老对生物钟的影响可能正是通过和 基因表达的变化来实现的。研究表明,光信号对生物钟基因的诱导表达效果受到年龄影 响。等对年老的仓鼠和大鼠进行研究发现光信号引起的内快速表达不变, 但几订的诱导表达量减少。众所周知,,,基因启动区存在反应元件, 反应元件结合蛋白对凡朋拘启动表达十分重要,老年动物光诱导的心订表达量减 少可能与光对磷酸化作用减弱有关。同时,等的研究表明老年仓鼠由视网膜 /.%,因此衰老对视网膜信号传输的影响也可能导致光诱导 传送的光信号减少了 的表达量减少。此外,和门表达量的增加对光诱导的生物钟时相移动十分重 要。等研究发现,在小鼠体内注入凡,.,和力的反义核苷酸能明显削弱生物 钟时相移动能力。等对小鼠的研究发现在光诱导的行为节律生物钟时相前移和 后移中,中心,.,均快速表达,尸,只有在时相后移中才强烈表达。因此,订 被认为是光诱导的时相前移一个调控因子,老年动物行为节律生物钟时相移动能力的减 弱可能与光诱导的内,.基因表达能力下降有关。 ..衰老对外周生物钟的影响 研究发现衰老对外周组织的影响程度具有组织差异性。通过体外组织培养发现,与 年轻大鼠相比,老年大鼠角膜、垂体、肾脏、松果体、室旁核、肝脏、弓状核昼。 夜节律变化较小,但右冠状动脉和肺振荡节律消失,用.激活剂毛喉素刺激 可诱导其重新产生节律,表明这些组织仍有振荡能力,但体内不能被有效驱动,这 可能与老年动物输出电信号和神经递质的变化有关。衰老对外周组织生物钟时相及 其重设速度也有影响。研究发现,老年大鼠、松果体和肾脏生物钟时相明显前移, 光周期变化后,肝脏生物钟同步作用被严重打乱,生物钟时相重设速度十分缓慢,而弓 状核和松果体生物钟时相重设速度反而变快。研究认为老年动物自身变化后,对外 周组织的调控作用减弱,导致一些外周组织振荡快速削减,生物钟时相及其重设速度发 生改变。此外研究表明外周组织钟基因表达也受衰老影响。老年大鼠下丘脑室旁核 和松果体组织中、门表达不受年龄影响,但对老年大鼠肝脏和心脏进行研究发现, 老年大鼠肝脏和心脏中基因表达水平低于中年大鼠,心脏中口刀基因含量高于中年 大鼠。此外,衰老对松果体功能及水平影响较大。研究表明,随着年龄增长雄性野 兔体内松果体退化,松果体细胞数目逐渐减少,这可能是由于其细胞凋亡造成。同时, 由松果体分泌的含量及生物钟振荡幅度明显下降,对人类的研究发现,老年人和 阿尔兹海默病患者体内水平被严重扰乱,这可能与松果体细胞数减少及分泌功 能降低有关。研究表明老年动物受体也发生了改变,与年轻小鼠相比,老年小 鼠体内受体数目明显减少。此外,当小鼠离体切片用垂体.激活肽 处理后,年轻和老年小鼠体内转录因子的磷酸化水平并没有显著性差异,当再用绪论 处理后发现年轻 观察不到此现象。 动物某些反应中, 有关。 为了进一步研究衰老对生物钟基因表达的影响及其机制,越来越多的研究将衰老细 胞作为研究的对象。通过研究人类的大动脉平滑肌细胞发现,衰老的细胞中生物钟基因 尸以和』的表达明显削弱,对心力和有着重要调控作用的其磷酸化减少, 活性降低。通过激活蛋白,可以恢复凡力和的表达。说明细胞衰老导致的生 物钟基因门和表达减弱可能是由于蛋白磷酸化下降,活性减弱所导致的 【。另外还有研究表明衰老细胞分泌的减少是导致生物钟基因表达减弱的重要原因博士论文 铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究 形成原始的巨核细胞,又进一步成为成熟的巨核细胞。成熟的巨核细胞膜表面形成许多 凹陷,嵌人细胞质之中,相邻的凹陷细胞膜在凹陷深部相互融合,使巨核细胞的部分细 胞质与母体细胞分开。最后这些被细胞膜包围的与巨核细胞的胞质分离开的成分脱离巨 核细胞后,经过骨髓造血组织中的血窦等处进入血液循环成为血小板。 图.巨核细胞生成血小板的过程? 具体来讲,巨核细胞由骨髓造血干细胞首