利用大豆核心种质部分样本鉴定28K和30K过敏蛋白缺失材料

利用大豆核心种质部分样本鉴定28K和30K过敏蛋白缺失 利用大豆核心种质部分样本鉴定28K和 30K过敏蛋白缺失材料 第32卷第3期 2006年3月324—329页 作物 ACTAAGRONOMICASINICA Vo1.32.No.3 PP.324—329Mar.,2006 利用大豆核心种质部分样本鉴定28K和30K过敏蛋白缺失材料 张跃强1,2关荣霞刘章雄常汝镇姚源松邱丽娟 (1中国农业科学院作物科学研究所/农业部种质资源与生物技术重点开放实验室,北京100081;新疆农业大学农学院,新疆乌鲁木齐830052) 摘要:以栽培大豆(G.)核心种质经聚类随机选择样本为主,以栽培大豆保留种质和野生大豆(G.s咖)为对照,利 用小鼠单克隆抗体GlymBd30K(F5)和GlymBd28K(C5)分别检测大豆的30K和28K过敏蛋白抗原,目的是发掘过敏蛋 白缺失的品种资源,明确其分布规律和特点,检测大豆核心种质的代性,为资源和育种研究提供参考.鉴定结果表明, 在参试的6o份野生大豆和421份栽培大豆中没有发现30K过敏蛋白缺失的种质,但28K过敏蛋白缺失率分别为l3.3% 和37.8%.栽培大豆核心种质28K过敏蛋白缺失比率的变化趋势与栽培大豆保留种质总体规律基本相同,在3个生态 区的缺失比率差异均不显着,说明核心种质在28K过敏蛋白缺失这个性状上具有代表性.SSR标记分析发现,在缺失过 敏蛋白的种质中,80%相似系数在0.44以下,表明这些种质遗传基础较为广泛,可充分利用类群内或类群间差异较大的 材料作为亲本配制杂交组合,培育缺失28K过敏蛋白优质品种. 关键词:核心种质;栽培大豆;野生大豆;28K过敏蛋白;30K过敏蛋白 中图分类号:S565 IdentificationofGlymBd28KandGlymBd30KLackingSoybeanbyUsing RandomSamplingofCoreCollectioninSoybean ZHANGYue—Qiang',GUANRong—Xia,LIUZhang.Xiong,CHANGRu— Zhen,YAOYuan.Song2andQiULi.Juan- (KeyLaboratoryofCropGermplasm&Biotechnology,MinistryofAgriculture,InstituteofCropSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing 100081;2CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUninversity,Urumqi830052,Xinjiang,China) Abstract:Soybeancorecollectionisveryimportantfoundationfornovelgenemining.Partofsoybean(G.,懈)core collectionwasusedtocomparewithreservedgermplasmandwildsoybeanbyusingimmunoblotting,inordertoselectGly mBd30KandGlymBd28Kallergen— nullgermplasm,andevaluatetherepresentationofCOrecollection.result showedthatallthematerials,including60ldsoybeanand421cultivars,containedGlymBd30K,andtheabsenceratio ofGlymBd28Kincultivars(37.8%)Washigherthanthatinwildsoybean(13.3%).nledistributiontendsofG1vmBd 28KnullmaterialsinCOrecoilectionwassimilartothatinreservedcollection.nIeabsenceratiosofGlymBd28Kwerenot significantlydifferentinthreeecotyperegionsofbothCOrecollectionandreservedcollection,whichindicatedthattheCOre collectionhasperfectrepresentative.SSRmarkeranalysisshowedthatsimilarityindexamong80%cultivarslackingGlym Bd28Kwaslessthan0.44,whichindicatedthesegermplasmshadabundantgeneticdiversityandcouldbeusedinthe breedingofGlymBd28Klackingcultivars. Keywords:Corecollection;Cultivar;WildSoybean;GlymBd28K;GlymBd30K 大豆蛋白是重要的植物蛋白来源之一,富含人 体必需的各种氨基酸,且具有良好的乳化性,凝胶性 等加工品质….但大豆种子含有多种过敏蛋白,可 导致人体过敏,Ogawa等对有食物过敏史的人检测发 现,14.0%的人对大豆过敏,仅次于对蛋清的反应 (26.7%)E2-61.近年来包括中国在内的世界各国对大 豆的消费迅速增长,增加了大豆蛋白引发过敏的几率. 引起过敏的大豆蛋白主要有60K,30K和28K3 种.60K过敏蛋白是8伴球蛋白的ct亚基]. 30K过敏蛋白(P34)是大豆种子的液泡蛋白,属木瓜 蛋白酶家族的包囊蛋白酶..,目前还不清楚其 功能.28K过敏蛋白是大豆球蛋白的微量组分,它 基金项目:国家重点基础研究发展(973计划)"大豆应用核心种质及其基因多样性分析"i~(2004CB117203);国家科技攻关计划"豆 类基因资源保护与种质创新利用研究"课题(2004BA525B06);作物种质资源保种项目(NB04.23.2). 作者简介:张跃强(1976一),男,新疆奇台县人,硕士研究生. 通讯作者(co_p0ndi"gauthor):邱丽娟,女,研究员,博士生导师,从事大豆遗传资源研究.E-mail:qiu—lijuan@263.net Received(收稿日期):2005-04—20;Accepted(接受日期):2005—07—26. 第3期张跃强等:利用大豆核心种质部分样本鉴定28K和30K过敏蛋白缺失材料 与木瓜膜蛋白MP27.MP33是同一家族.以往大 豆加工用酶处理,化学方法等对过敏蛋白进行处理, 但这些方法的效果并不理想,且增加了加工成 本nI1.Samoto等在过敏蛋白的研究中找到了p伴 球蛋白.a,a缺失的突变体.Hajika等在日本野生 大豆中发现缺失B伴球蛋白的突变体,并认为这种 突变是受单一基因Scg.J控制引.目前还没有筛 选到30K过敏蛋白自然缺失的大豆品种,美国采用 转基因的方法对30K过敏蛋白基因进行修饰,从而 获得30K过敏蛋白基因沉默的转基因大豆…. 本研究以免疫学方法对我国大豆核心种质样本 进行28K,30K过敏蛋白分析,同时用野生大豆和保 留种质为对照,目的是鉴定出缺失过敏蛋白的种质, 并对这些种质进行多样性分析,明确缺失过敏蛋白 的大豆资源的分布规律,为育种家选育缺失过敏蛋 白的新品种奠定基础,同时对我国大豆核心种质的 代表性进行检验. 1材料与方法 1.1材料 大豆种质资源481份,其中栽培大豆核心种质 220份(经聚类后随机选择样本),栽培大豆保留种 质201份,野生大豆60份. 1.2方法 1.2.1十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS. PAGE)用SDS.PAGE(10.5%的分离胶,10.5%的 浓缩胶)分离7s伴球蛋白的a,和B亚基,11S球蛋 白的酸性(A),碱性(B)亚基等大豆蛋白组分等大豆 蛋白组分.称取待测豆粉5rag,加500LpH8.0蛋 白提取液(0.05mol/LTris,0.2%SDS,5mol/LUrea) 和10的巯基乙醇,用涡旋仪振荡20min,4?静置 2h,1000转离心2min,取上清液6/.tL进行电泳,蛋 白在浓缩胶电泳时,恒压100V,待指示剂进入分离 胶后将电压调至150V,电泳3,4h(胶大小为16 mm×16mm×1mm). 1.2.2蛋白转移SDS-PAGE电泳后,将凝胶放人 转膜缓冲液(0.1mol/LTris,0.192mol/LGlycine,20% Methano1),温和摇动15min;在蛋白转移仪上叠铺2张 湿滤纸(用转膜缓冲液浸泡),滤纸上再铺1张PVDF膜 (Immobilon-P,Millipore)(PVDF膜先用甲醇浸泡10s, 再放人转膜缓冲液,浸泡20min备用),膜上铺凝胶, 凝胶上再铺2张湿滤纸;恒流200mA,电泳2h. 1.2.3免疫印迹用单克隆抗体GlyInBd30K (F5)和GlyInBd28K(C5)检测30K,28K过敏蛋白, 小鼠单克隆抗体由日本作物研究所旱田作物研究部 豆类育种研究室的高桥浩司提供.30K,28K过敏蛋 白的检测分别用Samoto等和Tsuji等副的方法. 1.2.4统计分析数理统计采用2样本百分数相 比较的假设测验(u测验),参见盖钧镒的方法. 用59对SSR引物对131份缺失28K过敏蛋白 的种质进行分析(包括核心种质80份,保留种质51 份,SSR分子数据来自本实验室的数据库).根据每 将标记以1,0记载, 个SSR标记的等位变异的有无, 用NTSYSV2.1软件计算品种间的相似系数,采用 UPMGA聚类分析,建立树状聚类图. 2结果与分析 2.130K与28K过敏蛋白缺失分析 对481份种质进行30K过敏蛋白的鉴定,所有 种质均含有30K过敏蛋白,但栽培大豆核心种质, 保留种质以及野生大豆3种类型种质的30K过敏蛋 白含量存在差异(图1).不同类型种质中都鉴定出 28K过敏蛋白缺失的材料(图2).栽培大豆核心种 质,保留种质以及野生大豆种质28K过敏蛋白的缺 失比例分别为36.3%,39.3%和13.3%. 30Kofsoybean 图13oK过敏蛋白免疫杂交分析 Fig.1Westernmotanga曲IofGlymBd3oK 28Kofsoybean .图228K过敏蛋白免疫杂交分析 Fig.2Westernmotanga曲IofGlymBd28K 2.2野生大豆与栽培核心种质28K过敏蛋白缺失 比较 参试的60份野生大豆分别来自黑龙江,吉林和 辽宁,28K过敏蛋白的缺失比率分别为21.4%, 7.3%和40.0%,总体缺失比率为13.3%.与栽培大 豆核心种质的随机样本相比(表1),黑龙江和辽宁 地区的野生大豆28K过敏蛋白的缺失比率较高,而 吉林的野生大豆缺失比率较低,但经2样本百分数 假设测验(u测验),野生大豆和核心种质28K过敏 蛋白缺失比例的差异不显着. 326作物第32卷 取样数NumberofsarIe 缺28K样本数 Numberofabsence28K 缺失比率Absenceratio(%) ?测验?test l4 3 21.4 2l 2 9.5 41 3 7.3 l5 4 26.7 5 2 40 23 3 l3.O 60 8 l3.3 59 9 l5.3 Note:WS=wildsoybean.C:corecollection 2.3大豆核心种质及保留种质的28K过敏蛋白缺 失的分析 2.3.128K过敏蛋白缺失种质在3个生态区的分 布周新安等将中国大豆栽培区划分为3个大 区,即北方春大豆栽培区,黄淮流域夏大豆栽培区和 南方大豆栽培区.220份栽培大豆核心种质样本 中,北方春大豆128份,占58.2%;黄淮流域夏大豆 和南方大豆92份,占41.8%.3个区28K过敏蛋白 缺失比率分别为21.1%,61.5%和49.4%.201份 保留种质中,东北春大豆,黄淮夏大豆和南方大豆 28K过敏蛋白的缺失比率分别为21.7%,46.2%和 56.9%(图3).核心种质28K过敏蛋白的缺失比率 的变化趋势是北方春大豆栽培区最低,黄淮夏大豆 栽培区最高;而保留种质中呈现由北向南升高的趋 势,即北方春大豆栽培区最低,黄淮夏大豆栽培区次 之,南方大豆栽培区最高.无论是核心种质样本还 是保留种质,北方春大豆栽培区与黄淮流域夏大豆 栽培区,南方大豆栽培区间差异极显着,而黄淮流域 夏大豆和南方大豆栽培区间的没有显着性差异,3 个生态区28K过敏蛋白缺失表现相同的规律. 70.o0 6000 5000 4000 3000 20.00 l0o0 0.o0 Ecologicalregion 口Corecollection?Reservedcollection 图3220份核心种质和保留样本28K过敏蛋白缺失比辜比较 rig.3Absentratiocomparison0fGlymBd28Kbetweea corecollectionandrmervedcollection BFC:北方春大豆,HHX:黄淮夏大豆,NF:南方大豆,zr:总体 2.3.228K过敏蛋白缺失种质在地方品种与选育 品种中的分布在核心种质和保留种质中,地方 品种28K过敏蛋白的缺失比率分别为36.8%和 46.0%,而选育品种28K过敏蛋白的缺失比率分别 为25.O%和37.3%,2个样本中地方品种的28K过 敏蛋白缺失比率均高于选育品种,保留种质中地方 品种和选育品种的28K过敏蛋白缺失比率均高于 核心种质(图4),但差异不显着. 一 8 g 兰 日 0 宝 篇 coltivarorlinelandracc Typesofsoybean 口Corecollection?Reservedcollection 图4核心种质与保留种质中地方品种和 选育品种的28K过敏蛋白缺失比率的比较 Fig.4ComparisonofGlymlid28Ka嘲lceratiobetw~m landraceandculfivarinbothcorecollectionandrmervedcollection 2.4过敏蛋白缺失种质资源的利用 利用59对SSR引物对80份核心种质和56份 保留种质进行分析.核心种质和保留种质的 Simpson指数都为0.10.核心种质样本间的相似系 数为0.02—0.79,平均为0.17,且81.3%的品种间相 似系数小于0.25;而保留种质样本间的相似系数为 0.05—0.6,平均值为0.24,品种间相似系数小于 0.25的品种占53.1%.在所有缺失过敏蛋白的种 质中,80%种质间的相似系数在0.44以下,表明缺 失28K过敏蛋白种质的遗传差异较大,遗传基础较 如??m50 一一88?鼍Jo0耍 第3期张跃强等:利用大豆核心种质部分样本鉴定28K和30K过敏蛋白缺失材料 327 O14O310.47063 Coefficient 7ZDD06638贵州 6Z.DD14981贵州 7ZDD16556贵州 7ZDD17375云南 6ZDD15135贵州 6ZDD14859贵州 6ZDD14887贵州 6ZDD14983贵州 3ZDD12944四川 6ZDD06676贵州 3ZDD13030四川 3ZDD1303硒川 6ZDD15619贵州 3Z.DD20676四川 7ZDD17106r一西 7ZDD17143广西 7ZDD22816r一西 7zI)D22318广西 7ZDD22123湖南 7Z.DD0f,447安敏 6ZDD1酊84广东 5ZDDo418缸苏 7zDD12112E 7ZDD21578~建 7ZDDo458g江苏 7ZDD13310四川 7ZDD06101浙江 6zDD21517福建 7ZDDo4875江苏 7ZDD057llE 7zDD05846;古E 7ZDD05532删E 7ZDD05883E 7ZDD05865;古E 7ZDD0590粥匕 7zDD05766}古E 7zDD12204~ 7ZDDll951E 4ZDD0374缸苏 4ZDD0375虹苏 4ZDD03771江苏 7zDDo4959安徽 5zDD05166安徽 3ZDD13841浙江 5ZDD02675LU东 5ZDD1088嗽西 7ZDD12419四川 7ZDD12400四川 7ZDD2叮36四川 1ZDD01叭7辽宁 6Z.DD14158福建 2ZDD07964F弼赛古 2ZDD09169Lu西 2zDD0卯舛山西 5zDD0343再可南 2ZDD1036嗽西 1ZDD18343F|}占 2ZDD0868乱U西 2ZDD0913乱U西 2ZDD0915西 2ZDD1035嗽西 1Z.DD01419辽宁 1zDD01488辽宁 1ZDD01515F|}占 2ZDD0221乱U西 2ZDD0961扎U西 2ZDD0224 2ZDD02315山西 2ZDD09293dli-~i 2ZDD096ll山西 2ZDD02539山西 2ZDD叮92嗪信 2ZDD07824F弼赛古 2ZDDll097E打啊 1ZDD00691吉林 1ZDD叮181黑龙江 1Z.DD07010黑龙江 1ZDD07254吉林 1ZDD叮217吉林 1ZDD18028吉林 079 图5核心种质SSR数据按生态区聚类图 ng?5Dendr0gmofclusteranal~isbasedo?SSRdataofcorecoileeUonandecologicalregion 1:东北春大豆;2:北方春大豆;3:长江春大豆;4:黄淮春大豆;5:黄淮夏大豆;6:南方春 大豆;7:南方夏大豆. 1:East-Northspringsoybe,aa;2:North,pingsoybean;3:Changiiaagspringsoybe,aa;4:Hua nghuaiapingsoybean; 5:Huanghuaisummersoybean;6:Southspringsoybean;7:Southswtnilo~rsoybean. 328作物第32卷 为广泛,而且核心种质的遗传基础较保留种质广泛. 在核心种质中,南方大豆品种马山周六本地黄和高 州青豆相似系数最高,为0.79.小青豆和绿广豆的 相似系数为0.72.保留种质中来自湖北省的汉川 八月炸和松滋茨衣子的相似系数最高,为0.60.来 自江苏的南方夏大豆种质溧阳青烂子和江阴蛇青豆 乙相似系数为0.55. 用NTSYS对核心种质进行聚类分析,相似系数 约为0.17处,核心种质首先按照生态区聚成3大 类.第1大类为东北春大豆;第?大类主要为北方 春大豆;第?类为混合类群,可进一步划分为3组, m.1为南方春大豆和长江春大豆;?.2主要为南方 夏大豆;m.3主要为黄淮夏大豆.生态区内产地相 同或相近的品种聚在一起(图5). 3讨论 Yaklich等对能够代表大豆育成品种95%遗传 基础的祖先亲本,高蛋白品系,多年生野生大豆和栽 培大豆进行30K过敏蛋白研究,结果表明,这些种 质都含有30K过敏蛋白.本研究也未发现30K 过敏蛋白缺失种质,但30K过敏蛋白的含量存在 差异. 日本大豆品种28K过敏蛋白缺失比例约为 80%[222 ,关荣霞等研究发现,中国大豆品种28K过 敏蛋白缺失比例为44.0%,远低于日本大豆.而 本研究中,大豆品种的28K过敏蛋白缺失比例则更 低,仅为37.8%,且核心种质(36.3%)低于保留种质 (39.3%),这与所用品种遗传多样性高有关.因为 遗传多样性越高,所包括单个性状的频率就越低. 这也说明核心种质对28K过敏蛋白缺失这一性状 具有代表性.本研究中保留种质缺失28K过敏蛋 白的分布规律为由北向南呈升高趋势,与关荣霞等 研究结果一致.而核心种质缺失28K过敏蛋白 规律则不尽相同,表现为北方春大豆最低,黄淮夏大 豆高于南方夏大豆,但与生态区内保留种质的28K 过敏蛋白缺失均没有显着差异,这与该性状的高频 率表达有关,只有低频率表达性状才会随取样数目 减少而显着降低. 过敏蛋白缺失在栽培大豆中表现为,育成品种 低于地方品种,北方品种低于南方品种,其差异可能 与品种的演变,自然选择和利用方式有关.南方的 大豆多直接食用,而北方大豆主要用于榨油,所以, 南方一般注重高蛋白的选择,而北方更注重高油品 种的选择,虽然没有对28K过敏蛋白进行有目的的 检测,但对蛋白质和食用品质的选择导致对28K过 敏蛋白性状的间接选择. 利用SSR标记对28K过敏蛋白缺失种质进行 分析,发现这些种质的相似性较低,遗传变异较为丰 富,可以考虑直接在亚群中或在同一大类群的不同 亚群间选配优良组合,以拓宽品种的遗传基础.本 研究首次对中国野生大豆进行过敏蛋白的分析,鉴 定出8份28K过敏蛋白缺失的野生大豆,为扩大野 生大豆的利用范围开辟了新的途径. 致谢:感谢日本作物研究所的高桥浩司先生提供 的实验指导及抗体;感谢本实验室的王丽侠,关媛, 朱莉,李林海,闫哲,朴E1花,宁学成,马岩松,张海 燕,董志敏等同学提供的部分SSR分子数据. 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