qPCR原理与分析方法-以OneShine SybrGreen preMix为对象分析

qPCR原理与分析方法-以OneShine SybrGreen preMix为对象分析 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 从RNA提取到荧光定量 ― qPCR系统 1 实时荧光定量PCR原理 1.1 实时定量PCR技术的概念 1.1.1实时定量PCR技术 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始进行定量分析 与常规 PCR技术比较: 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 1.2 实时荧光定量PCR技术涉及的概念 1.2.1 扩增曲线 荧光基团 荧光检测元 件 扩增曲线图: 横坐标:扩增循环数(Cycle);纵坐标:荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 1.2.2 荧光域值 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com , 荧光信号的域值(threshold ): , 前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline)，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧 光值 , 荧光域值的缺省设置是3,15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 , 手动设置:原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进 入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 , 真正的信号:荧光信号超过域值 1.2.3 Ct值 1)Ct值的定义: PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 2)Ct值的重现性 纵 轴 , 荧 光 信 号 量 横轴,PCR反映循环数 Ct值的特点: ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定; Ct值极具重现性 3)Ct值定量数学原理 理想的PCR反应 nX,X* 2 n0 n:扩增循环数 X :起始模板数量 0 X:第n次循环后扩增产物数量 n 4)Ct值定量数学原理 非理想的PCR反应 nX,X0 *(1，En)(En:扩增效率) n n:扩增循环数 X0 :起始模板数量 Xn:第n次循环后扩增产物数量 5)Ct值定量数学原理 在扩增产物达到荧光阈值时 CtX,X*(1，En),M (1) Ct0 XCt :荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M 方程式(1)两边同取对数得: Ct LogM,LogX*(1，En) (2) 0 整理方程式(2): LogX ,Log M ,CtLog(1，En) 0 6)Ct值定量数学原理 LogX0 ,Log M,CtLog(1，En) 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系 2 实时荧光定量PCR技术的应用 , mRNA表达的研究:如细胞因子、肿瘤耐药基因表达分析 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com , DNA拷贝数的定量:如易位基因的检测 , 单核苷酸多态性(SNPs)分析 , 基因型分析:杂合或纯合子 , 临床检测:病毒感染的定量监测 2.1 常用荧光标记方法 非特异性荧光标记: 1.SYBR Green 特异性荧光标记: 2.TaqMan 3.Molecular Beacon 2.2 TaqMan方法 2.2.1 TaqMan---水解型杂交探针 5′端标记有基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′?3′外切核酸酶活性，可水解探针 2.2.2 TaqMan探针工作原理 2.3 分子信标(Molecular Beacon) , 标记荧光的发夹探针 , 环与目标序列互补 , 茎由互补配对序列组成 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 2.4 SYBR Green 法 SYBR Green 结合到DNA小沟部位示意图 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 2.4.1 几种方法的应用比较 方法 优点 缺点 适用范围 适用性广 适合科研中对各种目SYBR Green I 方法 灵敏 引物要求高 的基因定量分析，基 方便 易出现非特异性带 因表达量的研究，转 便宜 基因重组动植物的研 究 特异性高 价格高 病原体检测，疾病耐 TaqMan 方法 重复性好 只适合特定目标 药基因研究,药物疗 效考核 遗传疾病的诊断 Molecular Beacon法 高特异性 只适合特定目标 特定基因分析 (分子信标) 荧光 困难 SNP分析 背景低 价格高 2.4.2 SYBR Green 法的应用 , 起始模板的测定 , 基因型的分析 , 融解曲线分析:可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer 的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物 2.4.3 定量的方法 , Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线, 即得到该扩增反应存在的线性关系 , 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 2.4.4 融解曲线—分析产物的特异性 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT) 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT) 2.4.5 融解曲线分析 2.4.6 SYBR法实验及注意事项 2.4.7 SYBR法实验流程及注意事项 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 2.4.8 SYBR法实验流程及注意事项 2.4.9 SYBR法实验流程及注意事项 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 2.4.10 SYBR法实验流程及注意事项 2.4.11 SYBR法实验流程及注意事项 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com 2.4.12 SYBR法实验流程及注意事项 ONESHINE试吧商城-往圣生物科技 shibamarket.com