【doc】将抗体库所获抗HBs Fab转换为全长人IgG

【doc】将抗体库所获抗HBs Fab转换为全长人IgG 将抗体库所获抗HBs Fab转换为全长人IgG ,97L ,一r|/j,.;_,} 海军总医院1999年第l2卷第1期 将抗体库所获抗HBsFab转换为全长人IgG 王琰王欲晓朱迎春刘晓琳张海荣刘群英化冰陈晓穗陈宇萍(中心实验科) 摘要目的:将大肠杆菌表达的抗乙肝表面抗原(}?)人Fab转换为真桉表达的全长^l酊1 :用重叠PcR法将人工合成的人,前导序列拼接到抗}lHs的?和Vt:上,构建人l酊1真核 表达载体.转染真核细胞,通过E].ISA,础P嘎,免疫印迹捡测抗}ms人l酊的表达.结果:用轻链 和重链同时表述的单一载体在E3qO细胞中获得了抗}?人IgG的表达.结论:通过噬菌体抗体库 所获Fab段可通过拼接人前导序列在真桉获得功能性表达 关键词己肝表面抗原^0噬菌抗体真核表达 中国图资料分类法分类号R392.11c.,0/ .———,Lx/6 coversionotAnti—FIBsHilm~nFabDerivedfrom PhageAntibodyLibrarytowholeHumanJigGMolecules Wartg"fan.WangYmuYL,~chtm.d 【C~wa]Ib.vyGeneral143spira1.Bei~ing1~(J037l AbstractObjective:ConversionoJ"an0一}?h舢Fabderivedh伽pI1ageanub0dy1i~ary"toeukaz3~ic e晰ssed"Iehumanl酊n~eoAes.M0ds:Asymhe~zedhtrmnVIeade~sequencewasspIcedr.oanti. }msvHand,byoverlapP啄.Ea0幔Lc.【pre锄vec眈swe代c0唧仃uc佗dand啪 edintosP2/0or (=H0cells.I11eexpression0fanti一瞰hL~anI酊哪test~bEI.ISA,RT-PE~andWesternm.Rest1 An|卜}mshLm'~nI目G哪0p,Ibytra~ecdngO-IOcells?仇a呕kvectorthatcontainedIxxhll血 cluInandhea~ychaingenes.(:oncli帆:FabsobtainedphageantibxlyIibr~'y?LLbeexpressedineu— karyotlccellsusingahLnunVHleadsequence KeywordsHBsH?rmnIgGP}1a昏eantibodyELIkarycexpz~saon 噬菌体抗体库技术的出现为单抗尤其是 人单抗的研制提供了有效手段…,从抗体库 筛选出来的是可在大肠杆菌表达的抗体Fab 段或单链抗体(ScFv),这些小分子抗体具有 分子量小,穿透力强,易于制备和进行基因工 程改造等优点.但因没有Fc段而不能激发 生物学效应,在某些情况下,Fc介导的生物 学效应是必不可少的,因此有必要将小分子 抗体转换成真核细胞表迭的完整I蜘分子. ? 国家863资助项目(z.墙Io1-02—03) 我们曾用噬菌体抗体库技术克隆了抗乙肝表 面抗原(}?)人Flab段,本文报道将该Fat 转移成抗}?人IgC-~分子. 1材料和方法 1.1质粒,细胞及主要试剂含有抗}?人 Fab段基因的载体质粒p3HB为本室从抗体 库所克隆,人轻链表达载体pAG4622和重 链表达载体pAH4604为美国?教授惠 2海军总医院1999年第12卷第1期 噌.二者均由鼠Ig重链启动子驱动.轻链 表达载体pAG4622含有次黄嘌呤,鸟嘌呤磷 酸核糖转移酶(gpt)基因,用霉酚酸作为选择 药物.重链表达载体pAH4604一表达人IgG1, 含有组胺醇脱氢酶基因,用组胺醇作为选择 药物,载体图示可参考文献4.可同时表达 人轻,重链的表达载体m为中科院微生 物所阎锡蕴教授惠噌,小鼠骨髓瘤细胞系 sP2/O为本室保存,二氢叶酸还原酶缺陷型中 国仓鼠卵巢癌细胞系(DHFRCT-10)为军科院 沈倍奋教授惠赠.各种分子生物学工具酶购 自Pr~nega公司.L[pofe~m和L~pofectAMINE plus购自G[bcoBILL公司. i.2寡核苷酸vK前导序列:LE1:CC 【:AXAA(X:(XX:A(X: C'TA(qL~E,GCq'UCCAGATACC(r【XX: U:()C(XX:A(XHXX(X (:A;AGG.LE1和u翌为互补序列,两端 分别有BamHI和BclI酶解部位(下划线处), 中间6O个碱基编码一个人链前导序列的 2O个氨基酸.将大肠杆菌表达载体中Fab 的?和VF~与前导序列拼接起来的引物; IBI:(XXgA53ATACYSACqGGAGAGGqr.JCAC~q'CA TCG-A;LEK:CCCAGATACCACqW.3AGAGCq'CAC S(:A(x,,这2个引物的前l6个碱基与前 导序列的3端互补,后l7个碱基与?或?c 5端互补.扩增带有人前导序列的?和Vr~ 引物:5端引物:s培:(CqLY3AGATATL'TAGA 此引物3端 18个碱基与前导序列5端互补,带有起始密 码子ATG,下划线处为限制酶位点XhoI, EcoRV和Xbal,以利于向不同载体克隆;3端 引物:HBH: ((::HBK GATCq'(Y~,位于VII和VF~的J—c交界部位, 分别含有NheI和SaII部位,用于向pAH4604 或pAG4622插入,HBK中含有pAG4622所需 要的RNA剪接信号将VH和v转移到 m中的引物:5端引物使用上述的sig,3 端引物:VK3: KA'ITI~A和VH3H?1A兀( (((:,分别含有HindlII和t3arnHI位 点(下划线处)及RNA剪接信号(斜体字). 1.3真核细胞转染se2/o的转染:取载体 DNAl培溶解于100无血清Rt:~fl1640 中,与含有2O"ILipofecfin的100ILL无血清 RRMI1640混合.室温放置45mln,逐滴加入 到1×10s~,2/o(于800I无血清RRMI1640 中).(]孵箱培养过夜,补加4ml含l5% FCSRRMI1640培养液.24h后取上清2?d 进行F_LISA检测.同时换选择培养液(轻链: 加霉酚酸lljgfml;重链:加组胺醇7m;轻 链+重链:加霉酌酸l,组胺醇7 ~mo1),4,5天后于96孔板进行克隆化培 养.C'klO细胞的转染:取载体DNA0.4, 加到含4pIus的25出无血清C~皿?中,混 匀,室温放置15roan;另取LipofectAMINE1ILL 溶解于25出无血清Dlv~M.二者混合,逐滴 加入到l×1OC7-10细胞(于200l无血清 Dlv~M中).?孵箱培养3h,补加含10% FBS的非选择培养液(即每毫升Dlv~M含次 黄嘌呤,胸腺嘧啶各4倨).大约72h左右, 取上清进行I~Z/SA检测.同时传代并进行克 隆化培养(换选择培养液即不含次黄嘌呤,胸 腺嘧啶的DMEM). 1.4I~Z/SA检测人I的表达:以羊抗人 IgGFab(Signa)包被ELISA板,1%BSA封闭, 加待测样品及人IgG后HRP一羊抗人 IgG(si蛐)进行结合反应,OPD显色,删A. 检测抗体与抗原的结合:用重组HBS(长春生 物制品研究所惠赠)包被ELISA板,其余步骤 同上. 1.5RT-P【用Tfizol(GibcoBI),按产品 说明书提取转染细胞的总RNA,以d(不 为I物逆转录合成单链cDNA.操作程序同参 海军总医院1999年第12卷第1期3 考文献2.以单链cDNA为模板,选择适当引 物用P【R分别扩增人链和重链的Fd段,铰 链区加CH2段,铰链区加C7-12和?段,以 及完整重链,检测转染细胞系中是否存在人 I曲轻链和重链的mRNA,所用引物及操作程 序同参考文献2. 16免疫印迹实验(WesternBlot)将初步 亲台层析纯化的抗HBSIgG行常规SDS- PAGE电泳,电转移至硝酸纤维素膜,以HRP- 羊抗人lg(5为二抗进行染色 2结果 2.1完整人I表达载体的构建将LE1 和LE2(编码人前导序列)退火后组建到 pUC载体的Ba枷位点中,得到pUCL,测定 DNA序列加以核实.分别用I.EH+HBH和 IZ.,K+HI为引物以p3HB为模板,P(扩增 抗HBs的人VH和Vs:基因段.用重叠FL'R 法将m中的人V前导序列与所扩增的 vH和拼接在一起(图1),经EcoRV+Sail 或EcoRV+eI酶解后分别组装到轻,重链 =… C-羔--3一 =—;一 C重pUCD==)一【 l?pPc ======;==一VKVH /\ h?h… — 工与面LL气 表达载体中得到轻链表达载体pAG4622一lib 和重链表达载体pAH4604-liB(图1).经限 制酶图谱核实.为改善抗体的表达,我 们又构建了同时含有轻,重链基目的单一表 达载体:分别用sig+VK3和s瞎+VH3为引 物,以pAG4622一lib和pAH4604+FIB为模板. 扩增带有前导序列的抗HBsV和VH基因, 经?IaI+B~amHI或XhoI+I1d?I酶解后重组 到pdI-L相应限制酶位点中得到皿HB(图 2),该载体上基因由小鼠金属硫蛋白I启 动子驱动,含有二氢叶酸还原酶(I~IFR)选择 基因. 囝2表达载体pd}?,}m示意图 帅:小鼠金碡硫蛋白I起动于 P$'V40:SV40病毒早期起动于 2.2真核细胞转染及抗体表达我们先用 双载体进行转染,将pAG4622.FIB转入sP2/O 细胞,用霉酚酸进行选择,检测转染后48h 的瞬时表达及选择培养液选择出的转染细胞 系,可检测到微量的人链表达(每毫升仅1 , 3ng),继续转染重链后,未能测到完整人 抗体表达换用pHB转染CT-K)细胞. 在转染后48h培养上清(瞬时表达)及选择 培养液选择出的转染细胞培养液上清中均测 出了人lgO的表达,瞬时转染表达量约5r 围1抗HBs真核表达载体的构建图ml,稳定转染细胞表达量约2【l(表1). 表1转染细胞人酥表达量的EI.ISA结果(^) 2.3mR.NA的检测为核实人lag的表 达,从转染的(提取总RNA,RT-t*.~扩增 人链和重链各种不同片段,经琼脂糖电泳, 可见到约700bp的链和Fd段扩增带(图3 海军总医院1999年第l2卷第1期 A第1,2道),约300多bp的铰链区加CH2 扩增带,约800bp的铰链区+C7d2+CH3的 扩增带以及约1400bp的完整重链扩增带 (图3B第1,2,3道),由于从扩增带的长度 可推断出表达载体上轻重链基因所含有的内 含子序列已被剪切,表明转染细胞中存在人 链和IgGl重链的mRNA~ MI:DNABstEl1分子标准 M2:PB322Bs分子标准 2.4免疫印迹实验为进一步核实人 蛋白的表达,进行了免疫印迹实验,图4中第 一 道为正常人蚰对照,第二道为我们所表 达的样本,证实有人蛋白的表达. 圉4人lag表达的免疫印迹植襁f 2.5抗原结合活性的检测用}璐包被 E1.1.qA.板,检测所表达的人IgO与抗原的结 合活性,结果如表2所示,所表达的人lgO可 与FIBs结合. 表2转染细胞所表达lgG与}正的结合 3讨论 噬菌体抗体库技术已被越来越广泛的用 于特异性抗体片段的制备,尤其是人源性抗 体片段,大肠杆菌表达的抗体片段在许多情 况下可以满足应用需要并有其一定的优越 性…,但某些场合需要完整抗体分子.迄今 大肠杆菌表达完整抗体分子并不成功且由 于所表达的抗体分子没有糖基化而影啊抗体 的生物学效应功能,因此有必要将大肠杆菌 表达的抗体分子片段(Fab或ScFv)转移成真 核表达的完整抗体分子,这种转换除了需要 真核表达载体外,关键是给大肠杆菌表达载 体中的v基因补充上的前导肽序列.迄 今国外有3篇类似工作的报道,Ames等报道 了鼠单抗的转换,对我们的工作借鉴不大. Bender等报道了一个抗破伤风类毒素的Fab 段的转换J,他们根据所涉及的人v区亚群 选择了同源性最强的前导序列,以保证有效 的分泌表达及前导肽酶对前导序列的切除, 但按这个原则很难构建通用的表达载体. Persic等则用一个小鼠VH前导序列构建了 通用的转换载体,并成功地表达了2个完 整抗体分子.提示尽管免疫球蛋白的前导序 列具有较高的序列多样性,但其功能具有较 大的通用性.我们选用了据报道有功能活性 的人前导序列,成功地介导了抗FIBs人 VH和的分泌表达.根据Kc~ak的报 道,我们在前导序列起始密码子舶前面 设计了真桉糖体结合序列cAcc(Kc~ak序 海军总医院1999年第l2卷第l期5 列).对于抗HBs人Ig.S-的表达,我们尝试了 2种表达体系,一种是s?教授提供的 轻,重链分别表达的载体,该载体内的 基因由小鼠重链启动子驱动,在骨髓瘤细胞 系中表达,我们已使用这一组载体构建了4 种不同抗体,但表达量都很低(参考文献4及 来发表资料),给实验带来很多麻烦,因有关 这组载体的报道中未提到表达量.故不知 是这组载体的固有缺陷还是我们所获得的载 体有问题;我们叉尝试了另一种轻链和重链 共同表达的载体,在CHO细胞中进行表达, 获得了近20-的表达量,这是常规细胞 培养传代时收获的上清.如提高细胞接种密 度,有可能进一步提高.但这个表达量仍然很 低,需大幅度提高 近来闻玉梅教授发现皿s疫苗与抗ms 抗体形成的免疫复合物对慢性乙肝病人有治 疗效果",因此重组抗}?k人的制备成 功将有可能用于治疗性乙肝疫苗的研制. 参考文献 【WinterG,GrimillsAID.Hawki~REMakingamlb.dIes Hphagedi~*lay【AnnuRevIrmtum1.1994,【2: 433 2陈竞华,王璇,剖群英等人源性噬苗体抗体库的柯建 及卸』,单抗的筛选中华微生钧相电疫学杂志, 1995.15(13):158 3【oma?,HaTtir~A,W珥IAa/【b瓣forthe .s啪armb0由mecesusingvariableregi~genes1 edby?bm啦chamrea吐日n.Jh?n,I.t52:99 4李竞,王琏,李全喜等抗胃癌鼠单抗3HI】v区基因 的克隆及』,一鼠嵌台抗体轻链的表达中华微生物学和 免疫学杂志,1997,17:227 5Gillies?.Ln?,wd^矗IJ.】J)中I册 chimericancib.d1usingadap?dcF/',/Avariable? Jb1mMethods,1989,125:191 6RS,TctrettaMA.D朗KdConvexly,0fmurine 陆i-,datedacombinatorialphdisplayJibrarytofull I耐~lgldmlinJhT1M,1995,】84:177 7BenderE.WodJM,AktlnJDdat"Re~thmanthumanan dlxxlies:link~eanFab在a?"?n【矗0rnao】nbli. bmrytoandFch0TId?/orexpressmninmacrmmIiancellcul 1ul'eHumAtmlxxliesHybridcrnas,1993,4:74 8pe~icI陆l乜A,Wil~nJd.Anintegratedvecnsys. 旧/orthenac.4iD兀ofanub.d…~helrh蟮. n?r~lectionfir~np}日display【Ibm…Gene, 1997,187:9 9KozakMPHeroleofflankingnuele0tldesinrecngui~nof tALEini6amrcodonbyeukaryoticnb口【NucleicAc idsRes.1981.9:5233 10WYM.Wu?,HDC.atHepatitisB~ccineandan. n4-[Bs旺rrIpIasap/~oach/orv~ccinetherapy1邡t, 1995,345:1575 (收祷日期】998】2-22) 9 肾上腺髓质素前体N端20肽在高血压中的临床意义 兰兰苏加林费宇秆马健吴旭辉丰智明徐洪涛堂塑(心内科) 摘要目的:探讨肾上腺髓质素前体N端20肽(PAM)的心血管教应及原发性高血压(EH) 患者血浆pAIV~浓度变化的临床意义方法;静注pAIV~.现察其对大鼠的血压,心率,左室收鳍峰 压及舒张血管平滑肌的作用.用放免法测定EH患者的血浆pAIV~浓度.结果:PAIV~可以降低血 压.并呈剂量依赖性地舒张大鼠主动脉环张力;EH患者血浆pAIV~含量明显高于对照组,与平均动 脉压呈正相关:结论~PAMP是一种舒血管肤;EH血浆PAIV~浓度升高可能是机体维持自稳惫的一 北京压科大学第一压院