基于纳米材料构建癌胚抗原及甲胎蛋白电化学免疫传感器研究

基于纳米材料构建癌胚抗原及甲胎蛋白电化学免疫传感器研究 基于纳米材料构建癌胚抗原及甲胎蛋白电化学免疫传 感器研究 西南大学 硕士学位论文 基于纳米材料构建癌胚抗原及甲胎蛋白电化学免疫传感器的研 究 姓名:刘亚西 申请学位级别:硕士 专业:分析化学 指导教师:袁若 20100401西南大学硕士学位论文 摘要 基于纳米材料构建癌胚抗原及甲胎蛋白电化 学免疫传感器的研究 分析化学专业硕士研究生 刘亚西 指导教师 袁若教授 摘 要 癌胚抗原四和甲胎蛋白?岍是国际公认的常用的肿瘤标志物,目前被应用于 很多疾 病如肺癌,胰腺癌,乳腺癌,肝癌等的辅助诊断。因此,或?虹甲的检测具有非 常重要的临 床价值。目前,已发展了很多免疫分析方法用于或舢即的测定。电化学免疫传感器由于具 有制备简单、检测速度快、灵敏度高、价格低廉、方便等优点,近年来,越来越多关于其检 测或的研究,而制作电化学免疫传感器的关键步骤在于采用简单,快速,有效的方法 将生物分子固定于电极表面。 本文运用电沉积、静电吸附、共价键合等技术构建电化学免疫传感器,并引入纳米金, 其比表面积高,吸附能力强,可以固定大量的抗体于电极表面,另外其具有良好的生物相容 性,可以保持抗体的活性。 本论文主要从以下几方面开展研究工作: .基于电沉积制备壳聚糖.纳米金复合膜检测甲胎蛋白的免疫传感器的研究 提出了一种基于壳聚糖.纳米金复合膜和硫堇制备的新型的甲胎蛋白免疫传感器。采用电 沉积方法将壳聚糖.纳米金复合膜修饰于玻碳电极上,再利用戊二醛做交联剂将硫堇固定于电 极上,然后利用硫堇吸附纳米金以固定甲胎蛋白抗体。用循环伏安法对电极制各过程进行了 表征。并对实验条件进行了优化。在最佳的实验条件下,用该免疫传感器对 甲胎蛋白进行了 循环伏安测定,线性范围为.~. ,检测限为. 盯。该免疫传感器采用电 沉积法制各壳聚糖.纳米金复合膜,与传统的滴涂法相比,该方法更有利于控制壳聚糖.纳米金 复合膜的厚度,使免疫传感器具有良好的重现性。 .基于多孔壳聚糖膜和纳米金共修饰癌胚抗原免疫传感器的研究 采用电沉积方法制备了多孔壳聚糖膜修饰的玻碳电极,然后利用戊二醛将电子媒介体硫 堇共价交联于多孔壳聚糖膜上,进而利用硫堇固定纳米金于电极表面,并通过纳米金固定癌 胚抗体,制得了电流型癌胚抗原免疫传感器。通过扫描电镜考察了多孔壳聚糖膜的表面形态, 并通过交流阻抗技术和循环伏安法考察了电极的电化学特性,并对该免疫传感器的性能进行 了详细的研究。实验结果表明,该研究工作制备的多孔壳聚糖膜有利于提高抗体的固定量,最 西南大学硕七学位论文 摘要 终提高免疫传感器的灵敏度。该免疫传感器对癌胚抗原的检测范围为.~. ?和. ~.?,检测限为.?止。此外,该免疫传感器具有良好的选择性,重现性和稳 定性。 基于脚心.为标记的双抗体夹心免疫传感器的研制 以同时标记和甲胎蛋白抗体的纳米球作为二抗,制作了甲胎蛋白双抗体夹心 免疫传感器。在玻碳电极表面沉积氯金酸修饰上一层纳米金,通过纳米金强的吸附能力固定 甲胎蛋白抗体,采用双抗体夹心免疫分析模式,将.标记的二抗结合到电极上, 对甲胎蛋白进行测定,并与其它方法标记的二抗进行响应对比。实验结果表明,该研究工作 采用的方法能在抗.结合大量的,使免疫传感器灵敏度提高。该免疫传感器对甲胎蛋白 的检测范围为.~ ,检测限为. ?。且该免疫传感器选择性好,稳定性 佳。 关键词:癌胚抗原甲胎蛋白纳米金壳聚糖免疫传感器西南大学硕七学位论文 曼曼曼曼暑 暑量曼舅曼曼曼皇曼量曼曼曼曼曼皇曼皇曼曼皇鼍寰?? ?????????? ? ?‘ ? ?一仅一一 :: 一四, ., 心强, 。, ?. , 姗 , , , . . , , , , .. : . .:仅一一. ? 西南大学硕士学位论文量蔓皇曼曼鼍曼曼曼曼曼曼曼曼曼寰曼曼曼曼曼寰 曼皇曼曼曼曼 . 曼曼曼曼鼍曼皇,砸? ?. , ?. .. ., . .. . 。 ? ? . . .,.嬲 . ?.. .啊 . . . , .’。.~. .~?~.,曲, 。 . /西南大学硕士学位论文 .; ;.量舅曼曼曼量曼曼鼍曼曼皇曼皇皇葛 ?一; 曼曼曼皇蔓曼曼鼍皇皇曼曼曼一一 ? . ??. . 曲/ : ?.. .即邮 ..‘ 。. 锄 . , . : ; ;; ; 独创性声明 学位论文题目:基王纳鲞越牡拉建癌逛拉厦区里膛量自皂毡堂鱼痰笾 盛墨盥珏窒 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中已加了 标注。 签字日期:加年月膨日 学位论文作者:刘亚西 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:口不保密, 口保密期限至 年 月止。 学位论文作者签名:刘委函 导师签名:分% / 签字日期:加伽年乒月加日 签字日期:汐年月玷日西南大学硕士学位论文 第一章 曼皇曼曼皇曼皇曼曼量皇鼍曼曼曼鼍皇量曼舅曼皇曼量曼皇曼皇曼曼曼曼 曼皇曼曼曼量曼量曼曼曼曼皇曼曼皇曼量曼曼曼曼曼曼量蔓 第一章绪言 生物传感器是近年发展起来的新兴高科技产品,它是将生物技术、纳米技 术、材料技术、微电子技术等结合起来的一项新型的分析测量技术【】。生 物传感 器由分子识别元件感受器与换能器相结合而构成,感受器包括抗原或抗体、酶、 微生物、细胞、细胞器、动植物组织切片、等具有分子识别能力的生物活性 物质,换能器即基础电极或内敏感器,是一个电化学或光化学检测元件【。当待测 物质经过感受器时,发生生物化学反应,传感器所感受的生物量由换能器转化为 与待测物质浓度有关的物理化学信号,再通过电子系统处理和显示,实现对待测 物质的检测【】。按分子识别元件的不同,生物传感器可以分为五类:免疫传感器、 酶传感器、细胞传感器、微生物传感器、组织传感器【】其中免疫传感器是非常重 要的一类,由于抗原和抗体的结合具有很高的特异性,因此免疫传感器具有有很 高的选择性,并展现出十分广阔的前剥’。 .纳米材料在生物传感器方面的应用 纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围的材料,如纳米颗 粒、纳米棒管、纳米薄膜、纳米块体材料等【’】。纳米材料由于具有小尺寸效 应体积效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应,表现出一系列 独特 的电学、光学,磁学、热学、力学及催化性能【.】。近年来,纳米材料已逐渐应用 于生物传感器的构建,下面介绍几种常见的纳米材料在生物传感器构建中的应用。 ..金纳米粒子用于生物传感器的修饰 陈贤光等 】报道了基于纳米金和硫堇固定酶的过氧化氢生物传感器图.。 将纳米金引入过氧化氢生物传感器的构建中,纳米金颗粒比表面积大,表面自由 能高,吸附能力强,能使过氧化物酶牢固地吸附在其表面,不易泄漏,在一定程 度上保证了过氧化物酶的稳定性。此外,纳米金具有良好的生物相容性,且有助 于电子传输,为过氧化物酶的氧化还原中心与电极之间的电子传递提供了适宜的 微环境。 等报道了以,硫堇,纳米金修饰金电极测定甲胎蛋白的免 疫传感器图.。纳米金是电的良好导体,能加快电子传递,使电极导电性增加; 纳米金良好的生物相容性能很好地保持抗体的生物活性:且纳米金比表面积高, 吸附能力强,能提高抗体在电极表面的固定量,使免疫传感器的灵敏度提高。 第一章 西南大学硕士学位论文 “警毋 寥 强 卜。痞 孙 ~’诗。. 。 二“‰;~ 一曲“‘ 臼 一釜.辱 毯 一一,警 . 潦淹 图.纳米金和硫堇固定酶的过氧化氢生物传感器的制作过程示意图 矗甜 咖,丹曲 。,淑。 %% ~? 《 吼国 ? 盏誊盖凿 ?荦学 国.硫堇,纳米盒修饰的甲艚蛋白免疫传盛器的制备过程示意图 哪啪四:九; ; ?皿? ?扎 ” ..碳纳米管应用于生物传惑器的研究 碳纳米管分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管“。碳纳米管具 有极高的化学稳定性、良好的传递电子性能以及催化活性的表面,近年来被广泛 用于生物传感器的制作。 王存嫦等 报道了基于碳纳米管和铁爵【酸镍纳米颗粒协同作用的葡萄糖生物 传感器。将多壁碳纳米管与铁氰酸镍纳米颗粒分散于壳聚糖溶液中,修饰于玻碳 电极表面,制得了生物传感器。实验结果表明,由于多壁碳纳米管具有优良的导 电性,促使铁氰酸镍纳米颗粒的电催化氧化还原活性得到提高,该生物传感器响应 灵敏,检测电位低。蔡称心等【“将葡萄糖氧化酶固定到碳纳米管修饰的玻碳 电极第一章 西南大学硕士学位论文 上,研究了葡萄糖氧化酶的直接电子转移。实验结果表明,固定在碳纳米管表面 的葡萄糖氧化酶没有发生变性,可以进行有效和稳定的直接电子转移,能保持对 葡萄糖氧化的稳定的生物电催化活性。 .壳聚糖在生物传感器方面的应用 壳聚糖由于具有良好的生物相容性,易成膜性等优点,被广泛用于生物传感 器的构建【幡。传统的壳聚糖膜的修饰方法一般采用滴涂法,此方法不易控制壳 聚糖膜的厚度,使得传感器不易重现。近年来,人们逐渐采用电沉积方法将壳聚 糖膜修饰于电极上,此方法更有利于控制壳聚糖膜的厚度,提高传感器的重现性 。壳聚糖含有丰富的氨基,.值约为.。当低于时,氨基质子化, 壳聚糖带正电且可溶于水。当高于时,氨基去质子化,壳聚糖不带电且不 可溶于水图.之】。壳聚糖于酸性溶液中电沉积时,付在阴极被还原为,使 阴极表面附近的逐渐升高,当高于磁后,壳聚糖变得不可溶,这时壳聚 糖可沉积于电极上图.【。在电沉积过程中,其它物质如纳米金,碳纳米管, 酶都可以与壳聚糖共沉积形成有效的生物界面结构【。 ?珏旷 图.壳聚糖的溶解度随酸度变化而变化的示意图 . 锄’ ..蚴重窒奎耋呈耋兰堡耋蚤 薹:.耋 ?耐”? ? 一,口 圈.壳聚耱韵沉鞭过程示意图 .., 一 娜夸 \? 。口 目 一 图.一步电沉积壳聚糖.碳纳米管一耐尔蓝.过氧化物酶的生物传感器示意图 印%撕 ? . 妇? .研, 等”?采用一步电沉积法将壳聚糖,碳纳米管一耐尔蓝一过氧化物酶固定 于电极表面,制作了生物传感器图 。宴验结果表明.电沉积法克服了滴涂法西南大学硕士学位论文 第一章 的费时,不易控制壳聚糖膜形成的厚度等缺点,表现出易于控制的优点,使传 感 器的重现性提高。 等【”将壳聚糖一纳米碳纤维沉积于电极表面构建了传感器图 。该 传感器结合了壳聚糖良好的生物相容性和纳米碳纤维极好的导电性.且电沉积法 易于控制,传感器表现出良好的重现性。 吐羔睦 ????? 图 基于沉积壳聚糖.纳米碳纤维的传藩器的示意冒 ., .多孔材料应用于免疫传感器 免疫传感器制作的关键步骤在于将抗体固定于电极上,抗体固定量的多少直 接影响免疫传感器的灵敏度,因此人们采用了很多方法对抗体进行固定,如引入 纳米粒子固定抗体】,希望可以提高抗体的固定量。近年来,人们运渐将多孔 材料运用于免疫传感器的制作中,由于多孔材料可增大电极的表面积,从而提高 抗体的固定量,使免疫传感器的灵敏度提高【”。 等”研究了多孔金制作的免疫传感器。将多孔金引入免疫传感 器的构建中,用以固定抗体。实验结果表明,多孔金可大大增大电极的表面积, 提高抗体的固定量,响应信号增大,免疫传感器的灵敏度大大提高。等 制作了基于多孔纳米金膜的癌胚抗原免疫传感器。结果发现,与平面电极相 比, 多孔纳米金膜由于具有高的比表面积,使癌胚抗体的固定量大大提高,免疫传感 器的灵敏度可达到 一。 .本论文的创新点 本文从壳聚糖膜的修饰,多孔材料的制各,纳米材辩的引入等方面进行了以 下几方面的研究: 、基于壳聚糖的溶解度随酸度的变化而变化的特性,采用电沉积方法将壳聚 糖一纳米金膜修饰于玻碳电极表面,与传统的滴涂法相比,电沉积法更有利于控制第一章 西南大学硕士学位论文 壳聚糖.纳米金膜形成的厚度,使免疫传感器的重现性提高。利用纳米金固定抗体, 由于纳米金具有高的比表面积和强的吸附能力,可以使抗体牢固地固定于电极表 面;另外,纳米金良好的生物相容性可以有效地保持抗体的的活性。 、基于多孔材料的优点,将壳聚糖.二氧化硅纳米粒子电沉积于电极表面,用 氢氧化钠除去二氧化硅纳米粒子,制得了多孔壳聚糖膜,其表面形成很多纳米级 小孔,具有高的比表面积,使电极的表面积显著增大,有利于提高抗体的固定量, 使免疫传感器的灵敏度提高。 、在玻碳电极表面沉积氯金酸修饰上一层纳米金以固定甲胎蛋白抗体,采用 双抗体夹心免疫分析方法,制作了高灵敏的甲胎蛋白免疫传感器。以同时标记 和甲胎蛋白抗体的纳米球作为二抗,使二抗上的固载量增大,响 应信号显著增强,免疫传感器的灵敏度提高。 西南大学硕士学位论文 第二章 第二章基于电沉积制备壳聚糖一纳米金复合膜检测甲胎蛋白 的免疫传感器的研究 甲胎蛋白?卿是一种分子量约为的酸性糖蛋白,是~种重要的肿瘤标 志物,的测定对临床医学来说有着非常重要的意义【州近年来,越来越多 关于利用免疫学方法来检测的电化学免疫传感器的报道,其表现出检测限低、 灵敏度高、检测范围宽等优点【“。 壳聚糖具有易成膜性、无毒、可生物降解、易于衍生化、生物相容性好 等优点,近年来,将壳聚糖用于免疫传感器的研究已越来越多【蛤】。在以往的报 道中,壳聚糖通常采用滴涂法来修饰在电极上,此方法简单但耗时,且壳聚糖膜 的厚度不易控制,最终导致免疫传感器的重现性不佳。为了提高免疫传感器的重 现性,近年来逐渐有关于采用电沉积方法来制备壳聚糖膜的报道.。与传统的 滴涂法相比,电沉积法更有利用控制壳聚糖膜形成的厚度。而且,在电沉积过 程 中,其它物质如纳米金,碳纳米管,酶等都可以与壳聚糖共沉积形成有效的生物 界面结构。 近年来,纳米金由于其独特的物理和化学性质被广泛用于免疫传感器的构建 。纳米金具有良好的导电性,有利于电子的传输;纳米金具有高的比表面积 和表面自由能,吸附能力强,可以牢固地固定更多的抗体;另外,作为一种具有 良好的生物相容性的材料,纳米金可以为有效地保持抗体的活性。 本研究工作采用电沉积方法将壳聚糖.纳米金膜修饰于玻碳电极表面,与传统 的滴涂法相比,该方法更有利于制备厚度可控的壳聚糖一纳米金膜,可提高免疫传 感器的重现性。然后以戊二醛做交联剂固定带有两个的硫堇作为电子媒介体, 再通过共价键合和静电吸附固定纳米金以吸附甲胎蛋白抗体,最后用封闭电 极上可能存在的非特异性活性位点,制得了性能优良的电流型甲胎蛋白免疫传感 . 器。 .实验部分 ..仪器与试剂 电化学工作站上海公司,.型酸度计成都方舟科技开发 公司,超生清洗仪德国 乙~..公司, .型超级数显恒温器重庆四达实验仪器厂,一电子天平瑞士 公司。 、 壳聚糖%脱乙酰度,甲胎蛋白抗体及抗原.岍,、乙肝表面抗 原郑州博赛生物技术研究所,牛血清白蛋白、硫堇、氯金酸、西南大学硕士 学位论文 第二章 柠檬酸三钠美国公司、醋酸缓冲溶梭由和溶液配制。其它试 剂均为分析纯试剂。实验用水为二次蒸馏水。壳聚糖按文献方法?配置为. 叭%的溶液备用。纳米金采用柠檬酸三钠还原法制备九,粒径约为。 ..修饰电极的制备 和 将西 的玻碳电极分别用粒径为. 岍的粉抛光成镜 面,二次蒸馏水冲洗除去抛光粉,然后依次在 、无水乙醇和蒸馏水中趣 声清洗约 /次。取出后用二次蒸馏水冲洗干净。 下电 将处理好的玻碳电极置于壳聚糖一纳米金:混合物中,于一 沉积 ,冲洗晾干,随后放入批的戊二醛溶液中浸泡 ,再将电极 ,取出用二次蒸馏水冲冼干挣晾干,再将电极放八 置于硫堇溶液中浸泡 溶液中浸泡约 ,洗净晾干.然后放入溶液中于?浸泡过夜, 以封闭电极表面 最后将修饰电极置于.%的溶液中在?条件下浸泡 可能存在的非特异性活性位点。修饰好的电极置于?冰箱中保存待用。免疫 传 感器的制备过程见图。 匿三畦嚣手畦饕 囝.免疫传感器的制备过程 ..测定方法 采用循环伏安方法对浓度进行测定。由于与?形成免疫复合 物阻碍电子传输,峰电流随抗原浓度增加而减小,井在一定范围内呈正比.根 据 此实现对的定量测定。循环伏安测定的电位范围为,测试底液为 。?。 的.缓冲溶液,扫描速度为. 第二章 西南大学硕士学位论文 .结果与讨论 ..电极的电化学特性 用循环伏安法表征了电极在修饰过程中不同阶段的电化学特性,所得循环伏 安曲线如图.所示。图.和.分别为裸玻碳电极和修饰的电 极在缓冲溶液中的循环伏安图,均无氧化还原峰。当电极固定上 后,出现一对的可逆氧化还原峰图.。说明成功固定在电极表面,能 发生较好的可逆反应,可以有效的传递电子。当在电极上进一步固定后,氧 化还原峰电流均增大图.,这是由于纳米金有助于电子的传输。当修饰电极进 这是由于抗体是蛋 一步固定上后,氧化还原峰明显电流减小图., 白质生物大分子,其吸附在电极表面阻碍电子传输,说明抗体成功地固定在 了电 极的表面。当用封闭电极表面可能存在的非特异性活性位点后,峰电流进一 步降低图.。当修饰电极结合上抗原分子后,峰电流进一步明显降低图.曲, 原因是生成免疫复合物堵塞了电极表面更多孔径通道,进一步阻碍电子传 输。 图.电极修饰过程的循环伏安表征 : ..,. /,//,//, ////,?///?/,曲 ///// ?脚 .的醋酸缓冲溶液中的循环伏 图.是免疫传感器在不同扫描速度下于 安图。结果表明,随着扫描速度从~ ?.变化,氧化峰电流和还原峰电流 不断的增大图.插图,且峰电流与扫速成线性关系,说明免疫电极上的氧化还 原反应受表面控制。 第二章 西南大学硕士学位论文 图.免疫传感器于不同扫描速度下的循环伏安图 雠 :,,,,,, .. 坩.. ,,,,, ?. ;: .实验条件的优化 ..缓冲溶液的优化 图.免疫传感器于不同的醋酸缓冲溶液中的循环伏安图. ?. 咖黜 ...? : ., ., ., ., 在本研究工作中发现,溶液值对免疫传感器电化学行为的影响较大,免疫 传感器在酸性缓冲溶液中响应较好。由图.可见,随着溶液从.增加到 .,循环伏安图谱的氧化还原峰电流逐渐减小,说明在一浓度大的条件下有利 于 电子媒介体硫堇发生氧化还原反应。但较高的酸度不利于保持生物分子的活 性和 西南大学硕士学位论文 第二章 .的 延长免疫传感器的使用寿命。综合考虑以上因素,在本研究工作中,选择 醋酸缓冲溶液为测试底液。 ..孵育温度和孵育时间的优化 温度对抗原抗体的充分结合有着显著影响。一般来说温度升高,免疫反应速 率增加,抗原抗体的结合程度增加,但过高的温度会导致免疫蛋白分子失活或流 失。在本实验中,考察了该免疫传感器在?~?范围内对相同浓度的的 电流响应特性。如图.所示,随着测试温度的升高,响应电流值逐渐减小,说明 免疫反应的程度逐渐增加,并在?时达到反应的最大值,之后电流响应值有所 增强。这是由于?最接近人体环境的温度,最利于免疫反应的充分进行。但由 于长时间处于较高温度下对传感器的寿命有较大影响,且考虑操作方便等因素, 本研究工作中选择?作为免疫传感器的孵育温度。 抗原和抗体免疫反应完成的程度与孵育时间也有关系。将免疫电极与一定浓 度的反应,,,,,,,, ,并进行循环伏安测试,研究 与.结合达到饱和的时间。如图.所示,在最初的 ,峰电流随反 应时间的增加而急剧减小,免疫反应的程度增强,在 后,电流值基本保持 不变,说明电极上结合的达到饱和,故选择 为免疫电极的孵育时间。 图.孵育温度和孵育时司对免疫传感器的影响 . .. 撕.免疫传感器的性能 ..线性范围和检测限 在以上选定条件下,用该法制备的甲胎蛋白免疫传感器分别与不同浓度的 .的醋酸缓冲溶液中的循环伏安图。如图.插图 抗原反应,测试其在 所示,峰电流随抗原浓度的增加而减小,这是由于抗原抗体发生特异性结合, 堵 塞了电极表面的孔径通道。如图.所示,在.一. ?。范围内,峰电流第二章 西南大学硕士学位论文曼鼍?? .... .... 皇曼曼曼曼皇曼曼量曼罡 值与抗原浓度呈现良好的线性关系,回归方程为:一..,相关系数为 ..。检测限为. 。 ,轴眦’ 图.免疫传感器对的响应 .: .. . :,嘞.,.,., 国.. ?. ..免疫传感器的选择性 免疫传感器的选择性好坏是决定其是否具有实用性的重要因素之一。考察了 该免疫传感器的选择性,先将免疫传感器与含有一定浓度抗原的溶液孵 育 ,进行循环伏安检测;再将电极置入含有抗原以及人体环境可能存 在的干扰物质的溶液中孵育 ,同样进行循环伏安检测。加入的干扰物质有: 乙肝核心抗原、乙肝表面抗原、、半胱氨酸等。比较两次所得响应电流值, 结果发现,两次的测量误差小于.%,说明该免疫传感器具有良好的选择性。 ..免疫传感器的重现性和稳定性 分别取不同时间、不同批次制备的甲胎蛋白免疫传感器对同一浓度的标准溶 液进行检测,其电流响应的相对标准偏差血小于.%,表明该免疫传感器具有 良好的重现性。这是由于在本研究工作中,采用电沉积方法制备壳聚糖一纳 米金膜, 与传统的滴涂法相比,电沉积方法更有利于控制壳聚糖一纳米金膜的厚度, 提高免 疫传感器的重现性。 研究了连续测定对免疫传感器稳定性的影响,对电极进行了连续圈循环伏 安测定。实验结果表明,第圈和第圈的峰电流之差仅为.衅。在电极不 使用时,于?下悬置于磷酸缓冲溶液上方,每隔~天测试一次,结果表明此 西南大学硕士学位论文 第二章 ... . 。 皇曼 免疫传感器在内,电流响应值基本保持不变,说明该免疫传感器具有良好的 稳定性。 ..免疫传感器的再生性能 免疫传感器的再生性能也是衡量其实用性的~个重要指标。本研究工作中采 用 的尿素溶液作为洗脱液,将免疫电极插入尿素溶液中 以使抗原抗体 复合物解离。实验发现,采用尿素溶液可使免疫传感器重复使用约次,次测定 的相对标准偏差为.%。 ..免疫传感器用于人体血清的检测 为了研究本研究工作制作的免疫传感器的可靠性,将此免疫传感器用于检测 人体血清中的?姗含量,并与酶联免疫法进行比较。如表.所示,该方法制备 的免疫传感器与酶联免疫法的测定结果基本相符,表明该免疫传感器有望应用于 人体血清中的直接检测。 表.免疫传感器与酶联免疫法的测定结果进行比较 .?.结论 本研究工作采用电沉积方法在玻碳电极表面修饰上壳聚糖.纳米金膜,以戊二醛 为交联剂固定硫堇作为电子媒体,再通过硫堇共价结合和静电吸附纳米金,利用 纳米金大的比表面积固定甲胎蛋白抗体,制备了电流型甲胎蛋白免疫传感器。本 研究工作的特点是利用电沉积方法制备壳聚糖.纳米金膜,与传统的滴涂法相比, 电沉积方法更有利于控制壳聚糖.纳米金膜形成的厚度,从而提高免疫传感器的重 现性。另外,纳米金比表面积大,可增大甲胎蛋白的固定量,提高免疫传感器的 灵敏度。实验结果证明,该免疫传感器重现性好,灵敏度高,性能稳定。第三章 西南大学硕士学位论文 第三章基于多孔壳聚糖膜和纳米金共修饰癌胚抗原免疫传感 器的研究 癌胚抗原是癌细胞膜上一种极为复杂的酸性糖蛋白,其分子量约为 ,正常成人血清含量极低,消化道恶性肿瘤、胃癌、肺癌、卵巢癌、 大肠癌及乳癌患者的血清含量显著升高【,。作为目前国际上公认的肿瘤标 志物,血清的检测在恶性肿瘤诊断上具有重要意义【.】。目前已经发展了 多种分析方法用于血清中含量的测定,如常用的酶联免疫法、放射免疫法、 电化学发光法等【.】。近年来又发展了一些测定的方法,其中免疫传感器分 析法引起了人们极大的关注,免疫传感器是基于抗原.抗体结合前后多种信号的改 变而制作,兼有免疫反应的高选择性和测定技术的高灵敏性,具有广泛的应用前 兽沁 。 爪 在免疫传感器的构建中,生物分子的固定化方法是影响传感器性能优良的一 个非常重要的因素【。近年来,采用纳米粒子固定生物分子越来越受到人们的青 睐,由于纳米粒子比表面积大,可以增大抗体的固定量,而抗体的固定量又直接 影响免疫传感器的灵敏度,使灵敏度得以提高【。最近,多孔材料也因为其高 的比表面积而被逐渐运用于免疫传感器的构造,多孔材料可增大电极的表面积, 从而固定更多的抗体,提高免疫传感器的响应信号【枷】。如 等【】 报道了制备多孔金以增加抗体分子固定的研究, 等【】报道了多孔纳米金 膜用于免疫传感器的研究,结果表明,多孔材料由于具有高的比表面积,其修饰 的免疫传感器灵敏度提高。 壳聚糖由于具有易成膜性和良好的生物相容性,在生物传感器中的研究 已受到重视【幡。壳聚糖含有丰富的氨基,值约为.。当低于磁时,其带 正电且可溶于水。当衅高于瞰时,则不带电且不可溶于水【。。因此有大量文献 根据壳聚糖的这个性质将壳聚糖或壳聚糖与葡萄糖氧化酶,碳纳米管等的复合物 电沉积于电极上,形成有效的生物界面结构。其机理为,壳聚糖于酸性溶液 中电沉积时,’在阴极被还原为,使阴极表面附近的逐渐升高,当高于 后,壳聚糖变得不可溶,这时壳聚糖或壳聚糖与其它物质的复合物可沉积于电极 上。 基于多孔材料的优点以及壳聚糖的溶解度随酸度的变化而变化的特性,本研 究工作利用电沉积方法制备了多孔壳聚糖膜,其表面形成很多小孔,具有高的比 表面积,有利于共价交联固定更多的硫堇砸,进而共价结合和静电吸附更多 的 纳米金,再利用固定癌胚抗体.,最终提高?的固定 量,提高了免疫传感器的灵敏度。通过扫描电镜、交流阻抗技术和循环伏安法考 西南大学硕士学位论文 第三章 察了电极的表面形态及电化学特性,优化了实验条件,并对该免疫传感器的性能 进行了研究。该传感器灵敏度高、检测范围宽、稳定性好、检测限低、抗干扰能 力强等优点。 .实验部分 ..仪器与试剂 电化学工作站上海公司,型交流阻抗测试系统德国 公司,扫描电子显微镜日本 公司。 壳聚糖%脱乙酰度,正硅酸乙酯,%,癌胚抗原及抗体队 ?、甲胎蛋白抗原、乙肝表面抗原郑州博赛生物技术研究 所,牛血清白蛋白?、硫堇、醋酸缓冲溶液和溶液配制,磷 酸缓冲溶液扫和溶液配制。其它试剂为分析纯试剂。实验用水为 二次蒸馏水。壳聚糖按文献方法【】配置为. %的溶液。二氧化硅纳米粒子 按照方法【叫制各。纳米金采用柠檬酸三钠还原法【】制备。 ..修饰电极的制备 将痧 的玻碳电极用粉抛光成镜面,、然后依次用、无水乙醇和蒸馏水超声清洗。 将. 与. 溶液超声混合形成 纳米复合物。再将电极放入其中于.. 下电沉积 ,取出冲洗晾 ,洗净晾干,然后将电极放入. 干,置于.%的戊二醛溶液中浸泡 。的溶液中浸泡以除去,取出洗净晾干后,制得多孔壳聚糖膜 ,洗净后 修饰电极/。将制备好的/放入溶液中浸泡 将电极浸入溶液中约 ,充分吸附颗粒,随后置于溶液中于 ?下浸泡 ,最后将此电极在.%的溶液中于?下浸泡埘电极上可能 存在的非特异性活性位点进行封闭。免疫传感器的制备过程见图.。制备好 的电 极置于?冰箱保存。 为了比较多孔壳聚糖膜与平面结构壳聚糖膜对电极响应性能的影响,我们在 相同条件下制备了平面结构壳聚糖膜修饰的电极,即在玻碳电极表面只沉积 壳聚 糖,其它步骤同上。 ..测定方法 采用循环伏安法对浓度进行定量测定。由于与.形成免疫复合 物阻碍电子传输,峰电流随抗原浓度增加而减小,并在~定范围内呈正比,据 此 实现对的定量测定。循环伏安测定在 .的缓冲溶液中进行,电 位范围为一。~. ?。 ,扫描速度为塑霎奎茎至耋茎堡墼耋 薹三耋 隅 竺 靼 啦 学医等 ?五蚪 睾隧三孚睡睾睡 图.免疫电极的制备过程 一四?:、 ‘; 口邵; ; ;; .结果与讨论 ..扫描电镜表征多孔壳聚糖膜的形态 扫描电镜是一种表征电极在组装过程中不同阶段的表面形貌的有效手 段。图 是在玻碳电极上沉积.后的,纳米粒子规则均 匀地分布于壳聚糖膜中。当用戊二醛处理后,戊二醛的醛基与壳聚糖的氧基 反应, 使壳聚糖分子互相交联并形成牢固的壳聚糖网状结构,再用溶液除去嵌入的 纳米粒子,就得到了均匀的多孔壳聚糖膜结构圈 。由图可以看出,在本 研究工作中成功制得了多孔壳聚糖膜。 图.壳聚糖一二氧化硅与多孔壳聚糖膜恬饰的电极的扫描电镜囤 ? . 电极的电化学特性话南大学硕士学位论文 第三章 交流阻抗是一种对电极的修饰过程进行表征的有效手段【】。图.为电极在修 饰过程中的交流阻抗谱图。图.为裸玻碳电极的交流阻抗谱图,近似为一条直 线, 表明电子传递到裸玻碳电极表面受扩散控制。当电极表面沉积了 后,由于阻碍电子迁移,其阻抗值大大增大图.。然而当形成多孔壳 聚糖膜后,阻抗值明显下降图.,说明阻碍电子传输的】汀已成功除去,壳 聚糖膜层存在均匀的孔道结构,大量的孔隙有助于离子通过而到达电极表面 【】。 当固定于多孔壳聚糖膜表面后,阻抗值进一步下降图., 说明具有较 好的传输电子的能力。当结合到电极表面后,修饰电极的阻抗值继续下降图 .。当电极再结合后,阻抗值明显增大图.,说明抗体已被成功固 定到电极表面。最后用封闭非特异性结合位点后,阻抗值进一步增大图.。 图.电极在修饰过程中的交流阻抗图 .. :, /,/,//,///,? . ?. ///,曲///// ?. . 州胡一. . 用循环伏安法进一步表征了电极在组装过程中不同阶段的电化学特性,所得 曲线如图.所示。由图可知,裸玻碳电极图.和多孔壳聚糖膜修饰的电极图 .在缓冲溶液中均无氧化还原峰。当在多孔壳聚糖膜上共价结合了 后,出现一对明显的氧化还原峰,如。/舻图.。说明进入多孔壳聚糖膜里的 可以有效的传递电子。图.是在电极上进一步修饰后的循环伏安图, 塑窒奎茎呈耋耋堡耋圣 垂三茎 圉.电极在修饰过程中的循环伏安图..:,/?, //,////:///,?加加几珈卿?,?/// .? ; ,, 纳米金具有的良好导电性使氧化还原峰电流均增大。当利用纳米金与抗体之 间强 的相互作用固定上后,氧化还原峰电流减小图.,这是由于大分子抗 体蛋白是非导电性物质,而利于电子传输,表明.成功地固定在了电极表面。 当用封闭后,峰电流进一步降低图 。特别是当固定上抗原分子后, 氧化还原峰电流进一步明显降低,这是因为生成抗体.抗原复合物堵塞了修 饰电极 表面更多孔径通道,使电子在电极表面的迁移更加的困难。循环伏安对电极 修饰 过程表征的结果与交流阻抗表征一致。 图 免疫电极在不同扫速下的循环伏安图 .% 四 %?: ,.,,,, 。 ;: 唧】。西南大学硕士学位论文 第三章 图.是免疫电极在 .的缓冲溶液中于不同扫速下的循环伏安 图。从图中可以看出,随着扫描速度的增加,峰电流值也不断的增加,且峰电 流 与扫速平方根成线性关系,这表明免疫电极在缓冲溶液中的电化学过程 是受扩散控制的。 .实验条件优化 ..测试底液的优化 .~.的醋酸缓冲溶液中的响应情况。由图. 本文研究了免疫传感器在 可见,随着从.至.变化,循环伏安图谱中的峰电位发生负移,氧化还原峰电 流逐渐减小,这是由于硫堇的氧化还原反应过程中有参与,较高的酸度有利 于 硫堇发生氧化还原。综合考虑免疫传感器的使用寿命及响应性能等因素,在本实 验中,选择醋酸缓冲溶液的为.。 , 图.免疫传感器在不同值的缓冲溶液中的循环伏安图 .. :.,., ?~. .,.,..; , ..孵育温度和时间的选择 温度条件是影响免疫反应完成的一个重要因素。在?一?范围内对温度 与响应信号之间的关系进行了研究。如图。所示,随着温度的升高,响应电流值 减小,说明与.结合程度增加,在?时,响应电流值最低,表明 与.的反应达到最大值。当温度超过?后,响应电流值增加,这是由于 过高的温度导致免疫蛋白分子变性而失活。综合考虑免疫传感器的使用寿命与操西南大学硕士学位论文 第三章 量 .... ?? 皇曼曼曼舅 作方便等因素,在本研究工作中选择?为与?反应的孵育温度。 免疫电极与抗原孵育的时间也是影响抗原抗体结合的一个重要因素。当免疫 电极与抗原孵育时,形成抗原抗体免疫复合物的需要一定的时间。为了保证 免疫 反应的充分进行,我们采用循环伏安法对该免疫传感器与反应的孵育时间进 行了优化。如图.所示,在开始的 ,峰电流值逐渐降低,免疫反应的程度 随时间而增强,越后,电流值变化趋于平缓,说明与?的结合已 达到平衡。故本实验过程中选择免疫电极的孵育时间为 。 图.孵育温度和孵育时间对免疫传感器的影响 .. ? . . . ?.. .传感器的性能 ..线性范围和检测限 在最优的实验条件下,将免疫传感器置于一系列不同浓度的溶液中孵育 后,进行循环伏安检测。由于与.崦电极表面形成免疫复合物阻碍了电 子的传输,电极响应电流随浓度的增加而不断减小图.,图.插图为 该电极的响应曲线。实验结果表明,免疫电极的峰电流与浓度在.~. ?和.~. ?范围内保持良好的线性关系,回归方程分别为:. .,相关系数为..和..,相关系数为..。检测限为. 。第三章 西南大学硕士学位论文 图.免疫传感器对的响应 .. . ?. ,.,,,?,值 ?...:,妇。、 图.不同免疫传感器对测定的标准曲线 . .. 】 ://// : . ;//// ,. 为了比较多孔壳聚糖膜修饰的电极与平面结构壳聚糖膜修饰的电极响应性 能 的不同, 我们在相同条件下制备了平面结构壳聚糖膜修饰的电极作为对比 电极, 比较了两种电极对测定的响应曲线。与平面结构壳聚糖膜修饰的电极图. 相比,多孔壳聚糖膜修饰的电极图.灵敏度提高,线性范围增大。这是因为, 多孔壳聚糖膜比表面积大,可以有效地固定更多的和,最终提高. 西南大学硕士学位论文 第三章 的固定量。 ..重现性、稳定性及选择性 取不同批次制备的癌胚抗原免疫传感器对同一浓度的抗原进行检测,其电流 响应的相对标准偏差:于.%,表明该癌胚抗原免疫传感器具有良好的重现 性,能初步运用于实际样品中肿瘤标志物的检测。 对该免疫传感器进行圈的连续循环伏安扫描,与初始电流相比,峰电流仅 .上方保存,每隔五天测试 下降.%;电极不使用时,于下悬于 一次,结果表明在 内,该免疫传感器电流值基本保持不变,说明其具有较好的 稳定性。 在 溶液中,加入人体环境可能存在的干扰物质,如:乙肝表面抗原、多巴胺、广半胱氨酸、工广赖氨酸、葡萄糖和牛血清白蛋白,进行对比实验。 结果表明,该免疫电极在加入干扰物和未加入干扰物的电流值相比仅有.%的差 异,表明该免疫传感器具有良好的选择性。 ..与其它免疫测定的对比 将本研究工作制备的癌胚抗原免疫传感器与文献报道的多种免疫测定方法进 行比较【‘,对测定的线性范围和检测限进行对比,如表.所示,该免疫传感器 线性范围宽,检测限低,这可能是由于多孔壳聚糖膜增大了电极表面的粗糙程度 和表面积,提高了抗体的固定量。 表.免疫传感器与其它免疫测定方法的比较 . ..免疫传感器的初步应用 为了研究本免疫传感器的实用性,对免疫传感器进行了回收率测定。如表. 西南大学硕士学位论文 第三章所示,回收率为.?.%,表明此免疫测定方法有望用于人体血清中含量 的临床检测。 表.回收率测定 . 功: .结论 本研究工作以电沉积方法制各的多孔壳聚糖膜为基质,共价结合硫堇,然后 静电吸附和共价键合修饰上纳米金用以固定抗体,制得了电流型癌胚抗原免疫传 感器。其特点是,多孔壳聚糖膜表面粗糙多孔,增大了电极的表面积,有利于在 壳聚糖膜表面共价固定更多的硫堇,从而结合更多的纳米金,最终提高了癌胚抗 体的固定量,提高了免疫传感器的灵敏度;纳米金固定抗体时, 能有效地保持抗 体的生物活性,并促进电子传递。实验结果表明,该免疫传感器灵敏度高,线性 范围宽,制各简单,抗干扰能力强,稳定性好。西南大学硕士学位论文 第四章 第四章基于玎冲.为标记的双抗体夹心免疫传感器 的研制 双抗体夹心免疫分析以生物酶为标记,将抗原抗体反应的特异性与酶的高效 催化作用相结合,其检测的灵敏度主要取决于酶标记的二抗中酶的催化效率【”。 在已报道的电化学双抗体夹心免疫分析方法中,通常是在抗体上直接标记酶,但 是此方法使得在基体表面结合的酶的量非常有限,不利于免疫传感器灵敏度的提 高。近年来,人们尝试引入携带有多个酶分子标记的抗体作为二抗,以使免疫传 感器的灵敏度得到的提高【。 等剐采用多壁碳纳米管标记技术,以同时 标记辣根过氧化物酶阳冲和抗体的多壁碳纳米管作为二抗制备了免疫传感 器,此方法可以在二抗上标记大量的,提高免疫传感器的灵敏度。 等【】采用磁珠标记技术构建了免疫传感器,以同时标记.和抗体的 磁珠作为二抗,提高了二抗上的固载量,使响应信号显著增强,检测的灵敏 度大大提高,可达到.衅??。 本研究工作首先在玻碳电极上修饰一层纳米金以固定甲胎蛋白抗体。采用双 抗体夹心免疫分析方法,对二抗的标记方法进行了探讨。为了使免疫传感器的电 化学信号增强,以同时标记和甲胎蛋白抗体的纳米球作为二抗,使 每个二抗上结合更多的,响应信号增强,免疫传感器的灵敏度提高,制得了 高灵敏的甲胎蛋白免疫传感器。 .实验部分 ..仪器与试剂 电化学工作站上海公司,甲胎蛋白抗体及抗原,?卿、 辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白抗体一、乙肝表面抗原郑州博赛 生物技术研究所,辣根过氧化物酶,正硅酸乙酯,呦,牛血清白 和 蛋白、氯金酸、柠檬酸钠、磷酸缓冲溶液 溶液配制。其它试剂均为分析纯试剂。实验用水为二次蒸馏水。 .. ?的制备 首先制备氨基功能化的纳米颗划】:将. %的氨水加入 无 水乙醇混合后,搅拌下逐滴加入 ,搅拌过夜。所得纳米粒子直径 约 。离心收集用无水乙醇洗涤,再分散至 无水乙醇中,加入 . 氨水,剧烈搅拌下逐滴加入. ,搅拌 ,离心洗涤,分散到 蒸馏水中待用。 纳米金采用柠檬酸三钠还原法按文献【】制得,所得金溶胶呈亮红色,粒径约 第四章 西南大学硕士学位论文 为。取出 纳米金混台入制备好的氨基功能化的,搅拌混合 过夜,制得纳米材料。 ?心一的制备图:于溶液中加入 的 , 和 ‘的啦,搅拌过夜,离心,加入溶液搅拌 .的 以封闭纳米金上可能存在的非特异性活性位点,离心,重新分散于 中,制得了珏啦一,保存于?待用。 ? ?? 羔 ?????? 、 氪基聃能化 够 拳 图.碰的制备过程 ?她舶 ..的制备 于纳米金中加入. 的.和 的,搅拌 过夜,离心,加入溶液搅拌 .以封闭纳米金上可能存在的非特异性活性 .的中,制得了??,保存于?待 位点,离心.重新分散于 用图 。 ? 里唑 ??妯, 图.?的制备过程 印?. ..免疫传感器的制备 将咖蚴的玻碳电极抛光成镜面,依次用、无水乙醇和蒸馏水超声 清洗。将电极置于溶液中,于 下沉积 ,得至纳米金修饰的电报, 取出清洗,然后置于溶液于?浸泡过夜,最后于 %的溶液中 于?下浸泡 以封闭电极表面可能存在的非特异性活性位点,即得免疫传感 器.//。置于?冰箱中保存待用。免疫传感器的制各过程见图.。西南大学硕 士学位论文 第四章 旱必越尘坐越直避 ~ ?.. ?髓 舳 ?? 量怂 够嘲 邋鹫螫 ............................一 图.免痖传鲢器的制备过程 . 血??。哪盯 ..免疫传盛器双抗体夹心法的测定过程 将制备的/修饰电极置于溶液中孵育 ,用 .的 清洗后置于甲胎蛋白二抗.?中继续孵育.清洗图 后进行循环伏安测定。测定的电位范围为? .,扫描速度?一。测 试底液为含有对苯二酚?为电子媒介体的 ,测定完后,往 测试底液中继续加入 的,再测定.被分折物抗原的定量分析是 通过两次测定的还原峰的来确定的。 同时我们采用不同的二抗进行对比实验,即以圈 曲和?啦. 作为二抗,其它实验步骤同上。 .实验部分 ..电极在自组装过程中的循环伏安表征 本研究工作对电极在修饰过程中不同阶段的电化学特性进行了循环伏安表 征。如图所示,在裸玻碳电极上出现一对廿的氧化还原峰图,当 在电极上沉积修饰上纳米金后,峰电流增加圈 ,这是由于纳米金有助 于电子传输。当固定上?后,峰电流明显减小图,说明抗体成功固定 到电极表面。当用封闭电极表面可自存在的非特异性活性位点后.峰电流进 一步减小圈 。特别是结合上抗原后,生成的抗原抗体复合物堵塞了电极表面 西南大学硕士学位论文 第四章 昌昌曼曼鲁鼍皇蔓蔓皇曼喜曼皇曼曼量量曼曼量曼曼曼量皇量曼曼曼曼皇 曼皇曼曼曼量量舅量量皇量皇曼曼曼曼曼鼍皇鼍曼量皇詈皇皇皇曼舅舅量寡皇 曼皇曼曼 的孔径通道,峰电流进一步减小图.。 图.电极制作过程的循环伏安表征 ,/,//, .. //////,. ?.?. ?妇一十. ..比较不同标记的二抗的电流响应 为了研究免疫传感器的电流响应,我们进行了对比实验:将制备的免疫传感 器与相同浓度的孵育后,再与不同标记的二抗孵育:卿标记的二抗,测定 结果为图.;.?标记的二抗,测定结果为图.;.标记 的二抗即本研究工作采用的方法,测定结果为图.。比较不同的电流变化 值,发现本研究工作采用的方法所得的电流变化值最大,响应信号最强。这是 由 于在相同的?帅浓度条件下,与.和.标记的二抗相比,.标 记的二抗上结合的的量最大,提高了免疫传感器的灵敏度。 .实验条件的优化 ..测试底液的选择 研究了缓冲溶液的在.~.范围内对免疫传感器响应的影响。结果如图 .所示,当的值为.时,免疫传感器的响应信号最强,因此在本研究工作 中选择磷酸缓冲溶液的值为.。 垂塑三 雪童尘茎:圭茎堡耋耋 国.不同方法标记二抗对测定的电流响应比较 ’. :?,彻’. ? .测试底涟值的选择 ?自曲 ..孵育时间的优化 所示,响应信号随孵育时 研究了孵育时间对免疫传感器响应的影响。如图 西南大学硕士学位论文 第四章 间的延长而增大,到越后,响应信号的变化趋于平缓,故本研究工作中选择 。 孵育时间为 图.孵育时间的优化 蟾.。 卸甲钉? ? .免疫传感器的性能 ..兔疫传感器对的响应性能 在上述选定实验条件下,将免疫传感器在一系列不同浓度的溶液中孵育, 再与二抗孵育,然后进行循环伏安测定。以?取寸浓度作图图.,在浓 度为.? ?范围内,免疫传感器的线性方程为:?卸..,相关系 数为.。检测限为. 。 为了研究不同标记的二抗对免疫传感器性能的影响,我们用不同标记的二抗 对进行测定作为对比。图.卿.分别为采用圈心和如.标记的二抗的线 性响应。比较发现,本研究工作采用蜘强一标记的二抗对进行测定时, 线性范围宽,灵敏度高,这由于在相同条件下,.标记的二抗上结合 的印婢的量最多。西南大学硕士学位论文 第四章 图.不同标记二抗对.测定的标准曲线 .. 辩 :,?. ..免疫传感器的再生 本研究工作中,我们采用 ?以的尿素和. ,的混合溶液作为该 免疫传感器的再生试剂,将抗原和抗体间的键合作用解离。实验结果表明, 此方 法可使免疫传感器重复使用约次,相对标准偏差为.%。说明该免疫传感器的 再 生是可以实现的。 ..免疫传感器的选择性和稳定性 实验中考察了一些人体中可能存在的干扰物质的影响,如:乙肝核心抗原、 .、乙肝表面抗原、半胱氨酸等,产生的最大误差在.%以内,说明该方法 选择性好。将免疫传感器于?下悬置于缓冲溶液上方,每隔~天测试~次, 结果表明此免疫传感器在天后能保持.%的电流响应,说明该免疫传感器具有 良好的稳定性。 .结论 本研究工作采用?标记二抗构建了信号放大的甲胎蛋白免疫传 感器。首先在电极上沉积修饰上一层纳米金以固定甲胎蛋白抗体。采用双 抗体夹心免疫分析模式,将.标记的二抗结合到电极上,对甲胎蛋白 进行测定。由于?标记的二抗可使电极上结合的量大大增加, 响应信号显著增强,该免疫传感器灵敏度大大提高。西南大学硕士学位论文 参考文献 参考文献 】汪尔康.世纪的分析化学.北京:科学出版社,. 【】朱将伟,刘国艳,史贤明.生物传感器在食品安全检测中的应用.中国公共卫生,,, .. 【】吴礼光,刘茉娥,朱长乐.生物传感嚣研究进展.化学进展,,