马链球菌兽疫亚种10株国内猪源分离株对小鼠免疫效力的评价

马链球菌兽疫亚种10株国内猪源分离株对小鼠免疫效力的评价 马链球菌兽疫亚种10株国内猪源分离株对 小鼠免疫效力的评价 2007,23(2)中国人兽共患病 ChineseJournalofZoonoses2O1 文章编号:1002—2694(2007)02—0201—04 马链球菌兽疫亚种10株 国内猪源分离株对小鼠免疫效力的评价* 耿建新,陆承平,范红结 摘要:目的近年来马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病在我国造成重大损失.为评 价猪源兽疫亚种分离株的抗原 变异,取国内10省市分离的lO株猪源兽疫亚种分离株,分别制备灭活抗原,加入弗 ,4W后 氏完全佐剂免疫12W龄ICR小鼠 加入弗氏不完全佐剂进行再次免疫,再次免疫2W后分别用5LDso同源菌株和1.6×10CFUATCC35246株攻击.结果 明,同源菌株攻击,免疫保护率均在9O以上}而以ATCC35246攻击的异源菌免疫 小鼠.免疫保护率为8O,i00.可见 我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备 的疫苗具有应用前景. 关键词:马链球菌兽疫亚种}分离株}免疫 中圈分类号:R378.9文献标识码:A Evaluationontheimmunizationpotencyof10strainsofStrept0c0ccusequi subsp.zooepidemicusofpig-orginisolatedinChina GENJianxin,LUCheng-ping,FANHong-jie (KeyLaboratoryofAnimalDiseaseDiagnosisandImmunology,MinistryofAgriculture, ?CanjingAgriculturalUniversity,Naing210095) ABSTRACTIStreptococcusequisubsp.zooepidemicuscancauseswinediseases,thUSma kingsubstantialeconomiclossesin recentyears.Toevaluatetheantigenicvariabilityamong10strainsofStreptococcusequisubsp,zooepidemicusofpig-origini— solatedinChina,theformalin-inactivatedWholebacterialcellsofthese10localstrainwereimmunizedtOinbredICRmiceof12 weeksoldwithadditionofthecompleteFreund'sajuvant(CFA),andre-immunlzed4weekslaterwithasimilardoseofbacteria emulsifiedinimcompleteFreund'sadiuvant.Twoweeksafterimmunizations,thevaccinatedandthecontrolmicewereallcha1. 1engedintraperitoneallywith5LD5oofhomologeousstrainand1.6× 10.CFUofATCC35246strain.Theresultdemonstrated thattheimmunizationprotectionrateofmicechallengedwiththehomologeousstrainwasabove90,whilethoseofmicecha1. 1engedwithATCC35246wasaround80%-i00,withnosignificantdifference.Fromtheseobservations.itisevidentthatno gritantigenicvariabilitycanbedetectedamongthese10localstrainsofS.equisubsp.zooepidemicusisolatedinChina,and thisresdtWOuldfavortheuseofsinglestrainofbacteriaforthepreparationofvaccine. ]KEYW0RDs:Sreptococcusequisubsp.zooepidemicus;iIsolatestrain;immunization 马链球菌(Streptococcusequi)包括兽疫亚种 (S.equisubsp.zooepidemicus),马亚种(S.equi subsp.equi)和类马亚种(S.equisubsp.equisimil— s)三个不同的亚种,根据兰氏分群(Lancefield group)同属于C群链球菌.该菌可引起多种动物 的感染,临床症状表现为败血症,脑膜炎,关节炎等, 一 般呈地方流行性n.人类因摄取被该菌污染的 牛奶或其它食品,特别是与病猪,马等动物接触,可 引发该病".随着集约化养猪业的发展,我国猪链 球菌病时有发生,流行病学调查表明,除新出现的猪 链球菌2型外,马链球菌兽疫亚种仍是我国各地猪 链球菌病的主要病原臼.本试验分析我国不同地 区分离的马链球菌兽疫亚种的免疫原性,以小鼠为 动物模型,比较其免疫保护率的差异,为制备有效疫 苗提供依据. 1材料与方法 1.1菌种马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp zooepidemicus)10株,分别为ATCC35246,CG-74—63,CY, CC,CT,SH0016,ST171,CXY012,CP-O104,CW03,其中 ATCC35246购自美国典型培养物保藏中心,1976年从我国 *江苏省自然科学基盒项日(BK2004106) 通讯作者I范红结,EmailIn--68@sohu.corn 作者单位:南京农业大学动暂医学院,南京210095 202 中国人兽共患病ChineseJournalofZoonoses2007,23(2) 四川病猪分离.其余分别为中监所,江苏省农科院和本实验 室分离,鉴定.以上1O株菌中,除CP-0104株分离自患关节 炎的病猪外,其余8株均分离自患败血症的病猪.对照菌株 马链球菌马亚种Y01株由扬州大学董国雄教授惠赠;D群 链球菌SH005及A群链球菌SH006747由上海市兽医站惠 赠,见表4. 1.2ATCC35246株LD5.将清洁级ICR品系小鼠(购自 南京军区总医院实验动物中心,约8w龄)分成6组,每组4 只.试验用马链球菌兽疫亚种ATCC35246经小鼠复壮后, 接种THB培养基,37?静置培养至对数生长期.离心去上 清,沉淀以灭菌pH7.2,10mmol的PBS稀释至1×1O" CFU/rrd,在此基础上进行1O倍比稀释至1×1OCFU/rrd, 小鼠腹腔注射0.tmi/只,记录各组小鼠死亡情况,按Kar- ber法计算半数致死量. 1.3ATCC35246最小免疫量测定将37?培养的 ATCC35246菌液以终浓度为0.8%的甲醛溶液37?灭活24 h,离心,去上清.沉淀以灭菌pH7.2,10mmol的PBS稀释 至1×10.CFE『/rrd,再进行2倍比稀释至10CFU/ml.与 等量弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)乳化后免疫小鼠,0.2 ml/只,共8组,每组1O只.4W后以同样浓度的弗氏不完 全佐剂乳化的疫苗加强免疫,2周后,以5LD5.的 ATCC352456攻击,记录每组小鼠死亡情况. 1.4灭活抗原的制备将1O株马链球菌兽疫亚种分别接 种含5%犊牛血清THB培养基,37?静置培养16h.加入 终体积为0.8%的甲醛溶液37?灭活24h.经过无菌检验 和安全检验后,将灭活的各组菌液离心,去上清,沉淀以灭菌 pH7.2,10mmol的PBS稀释,浓度为5×10.CFU/~,与等 量弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化,制备免疫原. 1.5小鼠免疫 1.5.1同源菌株攻击实验组将ICR小鼠分成1O组,每组 1O只,分别以上述制备的免疫原免疫,0.2ml/只.第一次免 疫加弗氏完全佐剂,4w后加弗氏不完全佐剂加强免疫.同 时每组设立攻击对照组,小鼠数量为2只/组. 1.5.2异源菌株攻击实验组将ICR小鼠分成14组,每组 1O只,1,1O组分别按同源菌株攻击实验组同样方式免疫. ll,13组为D群链球菌,A群链球菌和马链球菌马亚种对 照组,14组为未免疫对照组. 1.6攻击同源菌株攻击组分别以各自的免疫菌株攻击, ST171株攻击剂量为1×10CFU,其余攻击剂量均为1.6× 10.CFU,异源菌株攻击组均以ATCC35246攻击,攻击量为 5LD5o.饲养1w,记录各组死亡情况. 2结果 2.1LD5o6组ICR小鼠分别接种不同剂量的 ATCC35246,10CFU组有3只死亡,而10'CFU组 有1只死亡,见表1.根据Karber法计算,对小鼠 的半数致死量为3.2×10'CFU. 2.2ATCC35246最小免疫量以不同剂量 ATCC35246的灭活抗原免疫ICR小鼠,再以5LD5. 的ATCC35246活菌攻击,结果显示,1×1OCFU免 袭1ATC'~$246对小鼠的LD5o Table.1TheLDsoofATCC35246toICRmouse 疫剂量组小鼠有3/lo只死亡,5×10.CFU免疫剂 量组有6/10只死亡,见表2.可见,当免疫剂量为1 ×10'CFU时,免疫保护率可达70,ATCC35246 株对小鼠的最小免疫量为1×10'CFU. 2.4同源菌株攻击用马链球菌兽疫亚种不同分 离株免疫小鼠后,以同源菌株进行攻击,除CG一74— 63的免疫保护率在8O外,其余菌株的保护率均在 9O以上(表3). 2.5ATCC35246攻击用马链球菌兽疫亚种国 内不同分离株免疫小鼠后,以5LDs.的ATCC35246 进行攻击,除CT,CG-74—63,CP0104株的免疫保护 率在80外,其余菌株的保护率均在90以上,见 表4.表明国内不同地区分离的马链球菌兽疫亚种 分离株抗原性差异不大. 3讨论 国外学者认为,在马链球菌3个亚种中,马亚种 和类马亚种在进化上十分保守,其中马亚种是从马 链球菌兽疫亚种进化而来的,对宿主具有高度的特 异性;而马链球菌兽疫亚种则具有宿主多样性,易于 变异,不同菌株对宿主的嗜好性,抗原性等有可能不 同n??.但上述推论缺乏足够的实验证据,尤其缺 乏我国菌株的分析.作者对兽疫亚种国内不同地区 分离的类M基因进行了分子生物学研究,发现猪源 马链球菌兽疫亚种菌株之间则变异很小,类M基因 同源性高达98以上,但猪源株与马源株的类M 基因差异较大,同源性只有83.3.如果除该基因 保守的信号肽序列和C端保守细胞膜锚定区序列, 同源则更低,只有70左右n.本试验显示,同源 菌株攻击后,免疫保护率均在9O%以上,用 ATCC35246株攻击异源菌株免疫的小鼠,免疫保 护率最小亦达8O,这些菌株来自我国流行猪链球 菌病的1O个省市,分离菌株的时间前后近2O年,区 域和时间均有相当大的跨度,可充分说明我国分离 的猪源马链球菌兽疫亚种在抗原性方面没有大的差 2oo7,23c2盅i曼人J喜.203 表3同源马链球菌兽疫亚种攻击小鼠的结果 Table.3ThechallengeresultsofhomogenusstrainsofStreptococcusequisubspzooepidemic us 表4ATCC35246攻击小鼠的结果 Table.4ThechallengeresultofATCC35246tomice 204中国人兽共患病ChineseJournalofZoonoses2007,23(2) 异.值得一提的是用ST..株免疫后,以 ATCC35246攻击,免疫保护率达9O,ST11是一株 已获批准的疫苗生产株,ATCC35246株与之保护 率相当,但后者为灭活疫苗,安全性好,不会引致免 疫失败. 本试验中,以马链球菌马亚种免疫小鼠,用马链 球菌兽疫亚种ATCC35246株进行攻击,免疫保护 率只有2O,说明马链球菌马亚种和兽疫亚种在免 疫原性方面差异很大,两者相互之间不能提供有效 的交叉保护.对于A,D群链球菌,ATCC35246则 基本上没有交叉保护. 参考文献: C13LatorreM,AlvalezM,FernandezJM,eta1.Acaseofmeningi- tisduetoStreptococcuszooepidemicusCJ).CIinInfectDis, 1993,17I932-933. 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