西罗莫司产生菌Streptomyces

西罗莫司产生菌Streptomyces 中国抗生索杂志2001年2月第26卷第1期?35? 立章埔号:1o01—8989(2001)01—0035—04 西罗莫司产生菌StreptomyceshygroscopicusWY一93的 诱变育种与代谢研究 白兰芳徐小教 中国医学科学院中国协和医科大学 武临专王以竞 医药生特技术研究所.北京100050) 摘要:研究了不同诱变方法对西罗奠司产生菌正变率的影响.发现紫外线单一因子处理,光复活较为有 效;用这一条件处理得到一正变株uV一8—61,其效价比出发菌株Z27高2,3倍.产生抗生索水平经连续传代 证明非常稳定.本文还研究了菌落形态与发酵效价及诱变后正变率与死亡率的关系.明孢子丰富的梅花 型或面包型菌株发酵效价较高.以紫外线单一因子,光复活处理死亡率在99.9O,9995时正变率较高 另外.儿代谢角度对高产株与原株对碳,氮源的利用及葡萄糖.6.磷酸脱氢酶的活性进行了深人研究.发现两 者在生长速度,碳,氯豫的利用方面存在显着差别.尤其是高产株葡萄糖一6一磷酸脱氢酶的活性明显高于原株 由此推断,高产株uV一8—61西罗莫司产量的提高有可能是由于苗体生理代谢旺盛,参与戊糖一级代谢的G一6一 P脱氢酶活性提高.由此增加了作为西罗莫司生物合戚环己烷前体的莽草酸的供给. 关量词:西罗奠司生物合戚;诱变育种;葡萄糖一6一磷酸脱氢酶 中围分类号:Q933文献标识码:A 西罗莫司(sirolimus)是三烯大环内酯类抗生素, 其分子主要由一个3l员的大环组成;大环与一个七碳 环己烷与一个含氮杂环相连.Veziniall等于1975年发 现它具有抗真菌作用,以后Tanaka等又发现它是一 种极有前途的免疫抑制剂并具有抗肿瘤作用]. Tanaka等研究表明,西罗莫司具有很强的抗移植排斥 反应作用,并能与环孢素协同延长移植物存活时间,西 罗莫司还能逆转正在进行的移植排斥反应].另外,西 罗莫司还有预防和治疗实验性自身溶血性贫血的作 用.总之,作为一种高效新型的免疫抑制剂,它在临床 器官移植及治疗自身免疫疾病中具有重要意义. 本文研究了多种不同诱变条件处理对提高西罗莫 司菌种发酵水平的影响,认为在所实验条件中紫外线 单因子处理,光复活对产量的提高最有效.利用这一条 件处理得到的正变株uV一8—61产生西罗莫司的水平 是出发菌株的二倍以上,且连续传代四代非常稳定. uV一8—61第四代菌株在连续倒罐发酵中也相当稳定, 发酵效价一直维持在较高水平.从uv一8—61第五代分 离到9株菌株,其产西罗莫司的水平都是原出发菌的 三倍以上,且连续传代三代均非常稳定,并经TIc, HPIC等分析证明了该菌株发酵效价的提高确实为西 罗莫司.另外,从代谢水平对高产株与原株生长碳,氮 源的利用及葡萄糖一6一磷酸脱氢酶的活性进行了深人 比较研究,这为进一步阐明西罗莫司生物合成中的多 种调节机制,寻找控制其合成反应的不同的限速步骤, 定向提高其生物合成能力提供了很有意义的理论与实 验依据. l材料与方法 1.1菌株 西罗莫司产生菌吸水链霉菌(Streptomyceshygro scopicus)WY93一Z27,本实验室来源;白色念珠菌fCan— didaa~icans)1031,本实验室保存. 1.2培养基 分离培养基(Bennettsagar):Yeastextract,牛肉 膏,lactalbuminhydrolysate,葡萄糖,琼脂. 斜面培养基:天门冬素培养基. 种子培养基:黄豆饼粉,葡萄糖,淀粉培养基. 发酵培养基:葡萄糖,黄豆饼粉培养基. 生物检定培养基:葡萄糖,酵母膏,鱼胨,琼脂. 1.3缓冲液 pH6.0磷酸缓冲液;pH7.6柠檬酸一磷酸氢二钠缓 冲液. 1.4试剂 甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfide,EMS)Sigma 公司产品{NADPNa2,Boehringer公司产品;D—Glu— cose一6一PhosphateNa2,Sigma公司产品. 收稿日期;2000—02—16 作者筒介:白兰芳女.生于1972年.硬士.实习研究员.*通讯作者:王以光,女.生于1936年.研究 员 ? 36?西罗莫司产生菌Streptomyces衄groscopicuswY一93的诱变育种与代谢研究白兰芳等 1.5买验方法 1.5.1诱变处理将s.groscopicuswY一93一Z27新 鲜斜面用2O甘油(O.1吐温8O)洗下,过滤,制成单 孢子悬浮液,经水稀释后取lOml倒入无菌平皿,置于 波长253.7nm,功率30W紫外(UV)灯下30cm处开 盖振摇照射.于不同照射时间分别取样,涂布分离培养 基平皿,于25C培养15d左右. (1)UV照射,光复活:即紫外线照射后的操作过 程均在可见光照射下进行. (2)UV照射,暗修复:即uV处理后的孢子液连 同对照一起放入.黑匣子”,置4C冰箱过夜(24h),然 后取出稀释涂布. (3)UV和0.85IiCl前处理:将过滤后的单孢 子原液加水至lOml,按0.85终浓度加入灭菌的IiC1 溶液,在28C摇床作用6h立即取出进行uV照射,然 后稀释涂布. (4)0.5LiCI后处理:单孢子悬液经UV处理 后,稀释涂布于0.5IiC1分离培养基平皿上,25C 培养2od. (5)甲基磺酸乙酯(EMs)处理:在涂有一定稀释 度的西罗莫司产生菌平皿中放一牛津杯,将不同浓度 (0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5和imol/I)的EMS溶 液分别加满牛津杯,以相同稀释度的西罗奠司产生菌 平皿为对照,25?培养l4,18d. 1.5.2斜面培养将在Benett琼脂平皿上长好的单 菌落接种在葡萄糖天门冬素培养基斜面上,于25?培 养15d后进行液体发酵. 1.5.3摇瓶发酵 种子培养于250m1三角瓶内装50m]培养基, 由斜面接种后于28?振荡培养48h. 发酵培养于500m]三角瓶内装50,lOOml培 养基,由种子以5接种量转种后于25C振摇培养 96h. I_5.4效价测定以白色念珠菌作为检定菌,用西罗 莫司纯品制作标准曲线,以杯碟法进行生物检定. 1.5.5TIC,HPIC的分析发酵液离心后菌丝用3 倍体积的乙醇浸泡2,3h,在硅胶板上点样,用丙酮: 正己烷(2:3)展开,溶媒挥发后在含白色念珠菌捡定 平板上铺板显迹.用西罗莫司标准品作为对照.HPIC 用岛津IC一6A,Shimadzushim—packODS柱,检测波 长为277nm,流动相80甲醇,流速lml/min. 1.5.6还原精的测定葸酮比色定糖法口]. 1.5.7氨基氪的测定甲醛法J. 1.5.8发酵液总蛋白含量的测定Folin一酚法【5. 1.5.9葡萄精一6一磷酸脱氢酶的活性检测于不同时 间分别取发酵液10ml,离心,弃上清,将菌体用0.9 NaC1溶液洗两次后,加入柠檬酸一NaHPO缓冲液 5ml,混匀,冰浴中超声波破碎8min(1OHz,lOOW),提 出,4?,12000r/min,上清即为粗酶液(稀释后即可由 Folin一酚法测定其总蛋白浓度).葡萄糖一6一磷酸脱氢酶 的活性按文献【6进行,并计算其比活性. 1.5.10苗丝干重的测定于不同时间取定量发酵 液,离心,弃上清,用无菌水洗两次,置8o,l00C烤干 至恒重. 2结果与讨论 2.1刁:同诱变条件的诱变结果 研究了紫外线单因子,紫外线和氯化锂复台因素 及用甲基磺酸乙酯化学诱变剂处理菌种对提高西罗莫 司发酵效价的作用,考虑到菌株具有光激活酶的可能 性,在使用紫外线诱变菌种时结台光复活和暗修复两 种方法,以提高其诱变率.在紫外线和氯化锂复舍因素 进行诱变时均用光复活.诱变菌株进行发酵时,分批以 出发菌株的自然分离株作为对照,取自然分离株发酵 效价的平均值,将各诱变株及各对照株的效价与这一 平均值进行比较,算出大于,等于及小于对照的菌株百 分数,以大于同批对照的菌株百分数作为该诱变条件 的正变率(表1). 从表1可以看出紫外线单因子处理光复活的正变 表1不同诱变方法对提高西罗莫司发酵效价的作用 中国抗生索杂志2001年2月第26卷第1期?37? 率为8.9,24.1,明显高于同批对照株自然分离 的正变率2.6;紫外线单因子处理暗修复的正变率 仅为3.6,6.9;紫外线结合LiC1前处理的正变率 为0,14.8,LiCI后处理的正变率为12.j, 14.3,两者都低于对照株自然分离的正变率;此外, 甲基磺酸乙酯处理的效果最差,正变率为零.因此在所 实验的条件下紫外线单因子处理,光复活是比较理想 的诱变条件,有明显的正变效应,负变效应较小. 2.2诱变效果与死亡率的关系 研究了紫外线诱变西罗莫司产生菌过程中,紫外 线处理不同时间菌株孢子存活情况及菌株死亡率与正 变率的关系,发现本菌株孢子对紫外线较为敏感,紫外 线处理30存活率为38.9,处理60为6.9,90为 1.3,处理12O后存活率只有0.05.正变效果出现 在剂量较高的范围,死亡率在6O以下正变率极低, 将经uV不同时间处理(光复活)的菌株其正变率对 其相应死亡率作图(图1).由图可见,死亡率在80以 上正变率逐渐增加,当死亡率达到99.9时,正变率 最高为24.1. 2.3发酵效价与菌落形态的关系 为了解西罗莫司菌种诱变后菌落形态的变化与产 生抗生素之间的关系,将孢子诱变后在Bennetts琼脂 分离培养基平皿中培养15d左右,观察产生菌的菌落 形态,大致有以下几种:(1)梅花型;(2)面包型(两者均 生有白色孢子,较丰富);(3)扁平型:(4)光秃型和(j) 小型菌落.将各种形态的菌落按其发酵平均效价由高 到低进行排列,可得到下列顺序: 梅花型,面包型>扁平型>光秃型与小型菌落 其中梅花型与面包型菌落的平均效价相差不大.而前 三种形态菌落的平均效价却明显高于后两种.因而菌 落形态可以作为诱变育种工作的初筛指标. 2.4UV一861菌种效价的提高及传代的稳定性 将出发菌株S.hygroscopicuswY93Z一27菌种经 紫外线处理9O并经光复活,分离获得uv一8—61菌株, 多次复试其摇瓶效价比出发菌提高2,3倍以上,连续 丰(一 围1正变率与死亡率的关系 传代至四代,uV861产生抗生素的水平很稳定,结 果见表2.在发酵罐中连续3批产生抗生素的水平也 很稳定,产物经TIC,HPIC分析证明uV861菌株 发酵效价的提高确实是西罗莫司(图略). 2.5高产菌株生理代谢的研究 为探讨西罗莫司高产菌生物合成能力提高的机 理,我们对高产株uV一86—1及对照株在发酵过程中的 生理代谢情况进行了研究,其结果见图2,4. 图2与图3表明,高产株UV8—61生长情况与原 株相似,菌丝浓度稍高,但高产株对碳,氨源的利用明 显较原株快,发酵过程的pH变化也较明显.由表3可 见,高产株uV861的西罗莫司发酵产率明显高于原 株,说明高产株菌体的产生抗生素能力高于原株. 由图4看出,高产株与原株发酵价与G一6-P脱氢 酶活性的比较,前者中G一6一P脱氢酶的活性高于后 者,且合成速度明显比后者快,48h已达到高峰,此时 正是西罗莫司开始合成期.已有报道西罗莫司分子中 的环己烷结构和莽草酸的生物台成紧密关联0一,而莽 表2uV一8—61及其自然分离菌株的发酵效价及 传代稳定性 *uV一861及其自然分离菌株与出发菌株比较的相对效竹 出发菌株的散竹作为i00 表3S.hygroscopicua西罗奠司产率的比较 lMLh) 35 _ 25 , 一 l, l c5 围2S.groscopicus的糖,氨基氮利用曲线 1;UV861葡萄糖;2;原株葡萄糖 3:UV861氨基氟;4;原株氪基氟 nI ?38?西罗莫司产生苗StreptomyceshygroscopicusWY一93的诱变育种与代谢研究白兰芳等 围3S.hygroscopicus发酵过程中菌丝生长及pH变化 1:uv-8-51生长}2;原株生长3:uV一8-61pH 4:原株pH 草酸的生物合成与磷酸戊糖途径生成的四碳糖有关, G一6一P脱氢酶是磷酸戊糖途径的第一个限速酶,由此 推断,高产株uV一8—61产量的提高有可能是由于菌株 生理代谢旺盛,参与戊糖一级代谢的G一6一P脱氢酶活 性高,由此增加了作为西罗莫司生物合成环己烷前体 的莽草酸的供给. 致谢感谢金文藻教授指导井进行HPLC分析. 参考文献 [1]VezinaC,KudelskiA,SehgalSN.Rapamycin(AY一22, 989)tanewantifungalantibioticI.Taxonomyofthepro- ducingstreptomyceteandisolationoftheactiveprinciple 口]JAntibiot,1975;28(10):721 r2一TanakaH.KurodaA.MarLlsawaH,eta1.Structureof 兽 雹 口 17lt.J? 250 200; 一 j50? jGO三 车 50 0 围4S.hygroscopicus的G-6一P脱氢酶活性及发酵效价 l:uv-8—61G5PDHi2:原株GBP-DH{ 3:uv一8—61相对效竹i4:原株相对教价 K506:anovelimmunosuppressantisolatedfromStepto— myces[J].JAmChemSoc1987{109{5031 [33CalenRY.CollireDStJ.LimS.etalRapamycinfor immunosappressioninorganallografting[J].Lancet. 1989;2{827 [43DourosJ.SuffnessMNewantirumorsubstancesofnatu— ralorigin口].CancerTreatRev.1981;8:63 [53北京大学生物系.生物化学实验指导.第一版[M].北京: 高等教育出版社1983:3073,93 [63JdgenBregmeyer,MarianneGraBlMethodsofenzymatic analysisThirdEdition,Vo1.I[M].Weinheim.Get- rrmnysVeflagChemie1983:190 [7]ReynoldsKA,DemainAL.Biotechno[ogyofantibiotics. SecondEdition,revisedandexpanded[M:.NewYork. HongKong:StrohlWilliamR.MarcelDekker,Inc:497 Studyofinducedmutagenesisandmetabolismofsirolimus producingstrainStreptomyceshygroscopicusWY一93 BaiLan—fang,XuXiao—min,WuLin—zhuanandWangYi—guang (InstituteofMedicinalBiotechnology.ChineseAcademyofMedicalSciences& PekingUnionMedicalCollegetBeijing100050) ABSTRACTVar[ouswaysofinductiontreatmentwerecarriedouttOStudytheeffectivenessofincreasing theproductivityofsirolimusproducingstrainStreptomyceshygroscopicusWY-93.Resultsshowedthattheul travioletraytreatmentwithphotoactivationwasthemosteffectiveone.Bythismean,aninducedmutantstrain UV一 8—61wasacquired.ThesirolimuspotencyofUV861wasatleasttwoorthreetimesmorethanthatofthe parentstrain,andtheproductivitywasverystableduringsubcultures.TICandHPICanalysesconfirmedthat theincreasedproductivityofUV一 8—61strainwasduetosirolimus.Therelationshipbetweenthechangesof colonymorphologyandmortalitywithpositiveeffectofmutagenesiswasalsoinvestigated.Furthermore,the studiesonmetaboliccharacteristicsindicatedthatmorerapidmetabolicrateandhigherproductivitywithhigher specificactivityofglucose-6一 phosphatedehydrogenase(G6P—DH1wereobservedforUV861thanparent strain.ThissuggestedthattheincreaseofsirolimusbiosynthesismayberelatedtoG6P’DHactivityinthepen— rosepathwaysupplyingmoreprecursorofcyclohexanemoietyofsirolimus. KEYWORDSSirolimusbiosynthsistInducedmutagenes[s;Glucose6phosphatedehydrogenase