壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影响

壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影响 壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影 响 第27卷第5期 2006年10月 海洋水产研究 MARINEFISHERIESRESEARCH Vo1.27.NO.5 Oct.,2006 壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影响 常青梁萌青王家林孙静 (中国水产科学研究院内陆渔业生态环境和资源重点开放实验室中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,无锡214081) (农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071) (中国海洋大学,青岛266003) 摘要在基础饲料中分别添加0.5,19/6和29/6的壳聚糖,连续投喂花鲈(Lateolabraxjaponicus) 60d,探讨壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影响.结果表明,添加0.5和1壳聚糖可以显 着促进花鲈的生长,但是不同添加浓度对成活率均无影响.在30d时添加0.5或19/6壳聚糖能有 效提高花鲈的补体活性,溶菌酶活性和吞噬活性;在60d时仅明显提高补体活性.添加壳聚糖对白 细胞的数量没有影响. 关键词壳聚糖花鲈 中图分类号Q53;$816.7 生长非特异性免疫力 文献识别码A文章编号1000—7075(2006)05—0017—06 Influenceofchitosanonthe 一一? or"Japaneseseabass growthandnon—specificimmunity (Lateolabraxjaponicus) CHANGQing,LIANGMeng—qingWANGJia—linSUNJing. (KeyLaboratoryofEcologicalEnvironmentandResourcesofInlandFisheries, ChineseAcademyofFisherySciences,Wuxi214081) (KeyLaboratoryforSustainableUtilizationofMarineFisheriesResources,MinistryofAgriculture, YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071) (OceanUniversityofChina,Qingdao266003) ABSTRACTJapaneseseabass(Lateolabraxjaponicus)wasfedwithbasaldietsrespectively supplementedwith0.5,19,6,29,6chitosanfor6Odays,inwhichthelysozymeactivity,corn— plement(CH50)activity,phagocyticactivityandleukocytenumberwereexaminedcontinuous— ly.TheresultsshowedthatthegrowthofJapaneseseabasswassignificantlyimprovedwhendi— etarychitosanlevelwas0.5or1,buttherewasnosigniticantimpactonsurvivalrate.The activityoftotalcomplement,lysozymeactivityandphagocyticofthefishfedbydietswith0.5 or1chitosanshowedsignificantenhancementthanthatofthefishfedbydietswithnOchi— tosanor2levelafter30daysoftreatment,butsigniticantincreaseoftotalcomplementactivi— tywasobservedonlyafter60days.Totalleucocytenumberwereunaffectedbydietarychi一 农业结构调整重大技术研究专项项目(05—08—01A),中国水产科学研究院内陆 渔业生态环境和资源重点开放实验室课题和青岛市科技项目 (04—2一HH一59)共同资助 收稿日期:2005—08—18;接受日期:2006一O1—10 作者简介:常青(1971一),女,博士,副研究员,主要从事水产动物营养与饲料研究.E-mail:changqing@ysfri.ac.cn,Tel:(O532)85822914 海洋水产研究第27卷 tOsan. KEYWORDSChitosanJapaneseseabass(Lateolabraxjaponicus)Growth Non—specificimmunity 随着鱼类养殖规模的扩大,各种病害频繁发生,造成大量死亡,给养殖生产带来巨大损失.因此,病害的防 治越发受到重视.目前,有关鱼类病害的防治,多是使用抗生素.但是近年来抗生素用于抗菌治病带来的负面 影响越发突出,一些学者开始从营养免疫学的角度对水产动物病害防治进行研究.采用免疫增强剂可以增强 鱼体的免疫力与抗病力,减少鱼病的发生,正逐渐成为控制鱼病保证养殖效益的关键措施,因而通过在鱼类的 饵料中添加免疫增强剂成为国内外学者研究的热点.目前研究报道过的免疫增强剂主要有:左旋咪唑, FK一565,B一葡聚糖,肽聚糖,脂多糖,寡糖,维生素c以及维生素E等(Sakai1999),但对甲壳素和壳聚糖的研 究尚未有报道(Andersoneta1.1994;Kawakamieta1.1998;Estebaneta1.2000,2001). 花鲈(Lateolabraxjaponicus)由于生长快,对盐度和温度的适应范围较宽,肉质鲜美,具有较大发展前景. 本实验采用饲料中添加不同水平的壳聚糖投喂花鲈,测定花鲈血液中白细胞数量,吞噬功能的变化,血清中溶 菌酶活力和补体活性,同时结合花鲈生长情况的试验来观察口服壳聚糖对花鲈非特异性免疫功能的影响,为应 用壳聚糖增强鱼类免疫力以防治病害获得一定的科学数据,并为花鲈的疾病预防提供新的途径. 1材料与方法 1.1试验饲料的制备 采用单因子浓度梯度法设计,共设4个组,每组3个平行,以基础饲料作为对照组,其余3个组作为实验组 (见表1).饲料原料均粉碎到8O目以上,采用逐级扩大法,在基础饲料中分别添加不同含量的壳聚糖,对照组 未添加壳聚糖,混匀后添加5的鱼油,用2的褐藻酸钠做粘合剂,制成粒径为4mm的颗粒饲料,晾干,放入 冰柜中保存备用. 表1试验饲料组成 Table1Thecompositionoftestdiets 成分()Ingredient对照组Control 鱼粉Fishmeal 豆粕Soybeanmeal 花生粕Peanutmeal 酵母Yeast 次粉Wheatmeal 鳗鱼油Anchovyoil 胆碱Cholinechloride 磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2 磷脂Phospholipids 混合维生素.Vitaminmix 混合无机盐Mineralmix 壳聚糖Chitosan 化学成分Biochemicalcompositions 蛋白质Crudeprotein 脂肪Crudelipid 灰分Ash 注:混合维生素每kg饲料中含有:维生素B111omg;维生素Bz360mg;维生素 B686mg;生物素10mg;泛酸钙507mg;叶酸54mg;维生素B12 0?3mg;烟酸1450mg;维生素KIOmg;维生素C500mg;维生素A醋酸酯6000IU,维生素E30mg;维生素D31800IU 混合无机盐每kg饲料中含有:MgSO42.23g;KCI3.02g;KAI(SO4)212.7mg;CoCI240mg;ZnSO4?7H2O253mg;Cu SO4.5H2O7mg; KI8mg~MnS04'4HzO5.4mg;NazSeO32.5mg;FeC6H5O7?5H2O1. 632mg , 354 ?加552. 第5期常青等:壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影响 1.2试验鱼及饲养管理 选择当年,健康的花鲈鱼种,平均体重为57.35?1.8g.用基础饲料饲喂10d,待花鲈适应环境后再开始 分组试验,每组20尾,设3个平行,试验在黄海水产研究所小麦岛试验基地室内200L的玻璃钢水桶中进行. 水源为经过双重过滤的海水,流水饲养,流量0.4,0.6L/min,溶氧维持在6.0mg/L以上,pH6.8,7.2,水 温20?1?,盐度为32. 试验期间日投饵量为2,4,每天上午8:00,中午13:00和晚上19:00各投1次,连续投喂60d,每 隔14d调整其投饲率.试验期间每天吸污并换水1/3左右.分别在30d和60d时,每桶取3尾鱼,自尾动脉 取血,分别测定花鲈血清溶菌酶活性,血清中总补体活性,中性粒细胞吞噬率及白细胞总数.实验结束时测定 各组鱼的体重,计算特定生长率和存活率.特定生长率(SGR)的计算公式为:SGR=100×(LnWf—LnWo)/t, w为试验结束时鱼的干重,w.为实验开始时鱼的干重,t为实验进行的时间. 1.3血液白细胞计数 1.3.1白细胞稀释液配制 98ml蒸馏水加入1亚甲蓝3滴,冰醋酸2ml,配制成100ml白细胞稀释液. 1.3.2血液采集及白细胞总数计数 试验结束后,尾静脉取血,加肝素钠抗凝.取20l抗凝血加入盛有380l白细胞稀释液的试管中,待红 细胞全部溶解后,吸取白细胞悬液,在低倍镜下用血球计数器计算白细胞总数. 1.4血液白细胞吞噬试验 用无菌结核菌素注射器取抗凝血1ml,换接弯曲针头,立于45.角架上,于37?孵化箱中静置40,60min 后,使红细胞自然下沉.针头朝上的状态下,将0.5ml血浆部分注入凹形有机板中,分两孔,各加0.25ml,其 中一孔加3×1o白色葡萄球菌液50l,另--~L?JU3×io白色葡萄球菌液125l,在28?下振荡温育20rain, 取出混匀后取20l进行细胞涂片,瑞氏染色液染色,油镜下检查100个嗜中性粒细胞,计算吞噬有细菌的 细胞数. 1.5血清总补体活性的测定 参照巴德年(1998)方法,稍加改进.待测的血清取自尾静脉,反应温度为25?,反应时间为60min,吸收 波长为542nm. 1.6血清溶菌酶活性的测定 参照刘岩等(2000)方法进行.以溶菌酶(Amresco产品)为品,溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikti— CTAS,冻干粉,Sigma产品)为敏感菌株,测定波长为570nm,溶菌酶活性(g/m1)一(A.--A)/A,其中,A.为保温 前的光吸收值,A为保温后的光吸收值. 1.7数据处理 所得数据以平均数?标准差表示,并以SPSS分析软件进行方差分析和多重比较, 显着性水平为P<0.05. 2结果 2.1壳聚糖对花鲈生长的影响 饲料中添加0.5和1的壳聚糖可以明显提高花鲈的生长(P<0.05,见表2),其中0.5 的添加水平效 果最好,2的添加量对花鲈的生长则没有促进作用.壳聚糖的添加对于花鲈成活率 的提高没有显着影响. 2O海洋水产研究第27卷 注:表中数据为平均值?标准差.表中不同的上标字母表示差异显着(P<O.05) 2.2花鲈血清补体活性的变化 在30d时,饲料中添加壳聚糖的各组实验鱼的血清补 体活性均高于对照组,并且较高剂量的两组(1和2)补 体活性明显高于对照组(P<0.05).但是到60d试验结束 时,0.5组的补体活性显着提高,是各组中最高的,为20 U/ml.此时,2添加组的活性下降,与对照组相近,而 0.5和1两组的活性明显高于其他两组(P<0.05)(图1). 2.3花鲈溶菌酶活性变化 在饲料中添加壳聚糖,短期(30d)可以显着提高花鲈血 清溶菌酶的活性(P<0.05)(见图2),长期则对溶菌酶活性 没有影响,29/6组的溶菌酶活性还略低于对照组. 2.4花鲈白细胞数量的变化 在饲料中添加壳聚糖,在30d和60d对花鲈白细胞的 数量都没有影响(P>0.05)(表3). 2.5花鲈白细胞吞噬率的变化 30d时饲料中添加0.5和19/6的壳聚糖可以显着地 口 莒 霾' 4 ;-. 龚 三 5 O30 时间(d)6O 图1血清补体活性的变化 Fig.1Changesofcomplementactivity 3O6O 时间(d) 图2溶菌酶活性变化 Fig.2Changesoflysozymeactivity 提高白细胞的吞噬率(P<0.05)(表3),更高的添加水平反而使吞噬率有所下降.然而,60d时各组的吞噬率 均无显着性差异. 表3不同水平壳聚糖对花鲈白细胞数量和吞噬率的影响 Table3TheeffectofchitosanonnumberofwhitecellsandphagocyticactivityofJaponesesea bass 注:表中数据为平均值士标准差.表中不同的上标字母表示差异显着(P<O.05) 26284O llOO I^?0日N0? 一_l?/n)掣蜒避粗辫 第5期常青等:壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影响21 3讨论 甲壳素又称甲壳质,几丁质,壳蛋白等,大量存在于低等动物尤其是节肢动物(如虾, 蟹和昆虫)外壳中,也 存在于菌类,藻类和高等植物的细胞壁中,分布及其广泛.壳聚糖为甲壳素脱乙酰基的产物,又称甲壳胺,具有 多方面的生理功能,在医药,环保,食品,饲料等领域有着广阔的应用前景. 3.1生长 本实验所用的壳聚糖是利用虾,蟹壳生产,当该物质适量添加到饲料中饲喂花鲈60d,其促生长作用主要 通过增加体重来体现.壳聚糖在饲料中的最适添加量为0.5%,添加量增加不利于花鲈的生长.于东祥 (2000)对真鲷幼鱼,Shiau等(1999)对罗非鱼,Kono等(1987)对黄尾笛鲷和日本鳗,华雪铭等(2005)对暗纹东 方纯以及陈云波等(2005)对异育银鲫的研究都得出类似结论.究其原因可能是因为壳聚糖具有很强的吸附离 子和蛋白质的能力,过量添加时吸附了鱼类生长所必需的营养物质,而导致鱼消化吸收能力的下降. 对于不同的鱼类,壳聚糖有着不同的最佳适加量.过高的添加量不仅不会促进鱼类的生长反而会起到相 反的效果.Kono(1987)的研究表明,添加10%的壳聚糖对日本鳗鲡,黄尾笛鲷的生长有着抑制作用.Shiau (1999)对质量分数(2,5,10)壳聚糖对罗非鱼的研究发现,随着质量分数的增加,鱼的增重降低. 3.2非特异性免疫力 免疫增强剂的使用对于鱼类补体活性的变化影响广泛.一般而言,通过口服一些免疫增强剂可以提高补 体的活性(Ortufioeta1.1999,2000;常青等2005).这与本试验中在饲料中添加壳聚糖提高补体活性的 结果相似.尤其是0.5的添加水平在60d时能够显着提高补体活性,是对照组活性的两倍.补体是存在于 鱼体血清和组织液中的一组可溶性蛋白,真骨鱼类的补体系统与高等脊椎动物的 相似,可以通过经典途径和旁 路途径激活.在鱼类早期抗感染过程中发挥着重要作用.补体的生物学功能包括:(1)具有溶菌和细胞溶解作 用.(2)补体激活后产生的各种中间产物能够增强吞噬功能,中和及溶解病毒,清除免疫复合物(Lygren等 2002).目前未见有关壳聚糖对鱼类补体活性影响的报道.Esteban等(2001)在金头鲷饲料中添加25或 50g/kg的甲壳素,可以明显提高补体活性.本实验中添加壳聚糖可以明显提高花鲈的补体活性,其中的机理 有待进一步研究. 壳聚糖可以活化巨噬细胞,提高巨噬细胞溶菌酶的活性,使其吞噬能力增强,并能活化T淋巴细胞,促使 其释放各种淋巴因子(帅柯等2005).溶菌酶是由淋巴细胞分泌的碱性溶解酶,主要作用于革兰氏阳性菌 及某些特定的细菌,溶解细菌胞壁上的粘多糖.当机体受到病源攻击时,白细胞聚集在感染区,包围异物进行 吞噬,此时吞噬细胞的活性增强,吞噬细胞中含有溶菌酶,因此随着吞噬活性的增强也导致了溶菌酶活性的变 化.本实验添加适量的壳聚糖使白细胞吞噬和血清溶菌酶活性的变化趋势基本一致,说明壳聚糖能够激活吞 噬细胞的吞噬功能和水解酶的活性,刺激吞噬细胞产生淋巴因子,启动免疫系统,增强机体的抗感染能力.在 30d时,添加壳聚糖的各组溶菌酶活性都显着高于对照组,但是60d时则没有差异,似乎出现免疫"疲劳"现 象.王树芹等(2004)发现添加0.59/6或19/6壳聚糖能有效地提高异育银鲫的溶菌酶活性和白细胞的吞噬作用, 这与本实验结果相似.至于壳聚糖被花鲈摄入后能否被消化吸收,它以何种形式激活细胞吞噬及增加溶菌酶 活性还有待进一步研究. 本实验在不同时间都未发现添加壳聚糖可以提高花鲈白细胞的数量,这与刘云等(2004)发现在饵料 中添加甲壳胺(即壳聚糖)可以提高鲫鱼白细胞数量的结果不同.二者的差异有可能是所使用的试验鱼不 同所致. 4结论 本实验将壳聚糖作为饲料添加剂饲喂花鲈能够提高机体的补体活性,增强溶菌酶活性和吞噬活性,从而提 高鱼类的非特异性免疫力,并且还有一定的促生长作用,同时使用简单易行,对鱼体的应激作用小.因此将壳 22海洋水产研究第27卷 聚糖作为花鲈的免疫增强剂具有较好的应用前景. 参考文献 于东祥,柳学周,雷霁霖.2000.甲壳胺制剂对真鲷幼鱼的促生长作用研究.海洋水产研究,21(3):62~66 王树芹,周洪琪.2004.壳聚糖对异育银鲫溶菌酶和白细胞吞噬活性的影响.上海水产大学,13(2):121,125 巴德年.1998.当代免疫学技术与应用.北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社?300~301 帅柯,周小秋.2005.甲壳素在水产动物饲养上的应用.水产科技情报.32(5):217,220 刘岩,江晓路,吕青.管华诗.2000.聚甘露糖酸对中国对虾免疫相关酶活性和溶菌溶血活性的影响.水产,24(6):549~553 刘云,孙峰,王丹.2004.免疫增强剂对鲫鱼非特异性免疫功能的影响.海洋科学,28(9):42,45 华雪铭.周洪琪.张宇峰,周辉.2005.饲料中添加壳聚糖和益生菌对暗纹东方纯幼鱼生长及部分消化酶活性的影响.水生生物?29(3): 299,305 陈云波.周洪琪.华雪铭.王树芹.2005.饲料中添加壳聚糖对异育银鲫的生长及抗病 力的影响.皖西学院.21(5):31,34 常青.梁萌青.王印庚,高淳仁.王家林.2005.饲料中Vc对大菱鲆非特异性免疫力的 影响.海洋水产研究,26(5):22,26 Anderson.D.P.,andSiwicki,A.K.1994.DurationofprotectionagainstAercmonassalmonicidainbrooktroutimmunostlmulatewithglucanor chitosanbyinjectionorimmersion.TheProgressiveFishCulturist.56:258,261 Esteban,M.A..Mulero,V.,andCuesta.A.2000.Effectsofinjectingchitinparticlesontheinnateimmuneresponseofgiltheadseabream(Spa— ru$auretaL.).Fish&ShellfishImmunology,10:543,554 Esteban,M.A..Cuesta,A.,andOrtuno,J.2001.Immunomodulatoryeffectsofdietaryintakeofchitinongiltheadseabream(SparusaurataL.) innateimmunesystem.Fish&ShellfishImmunology,11:3O3,315 Lygren.B.,Hjeltnes.B..andWaagbo,R.2002.ImmuneresponseanddiseaseresistanceinAtlanticsalmon(SalmosalarL.)fedthreelevelsof dietaryvitaminEandtheeffectofvaccinationontheliverstatusofantioxidantvitamins.AquacultureInternational,9:401,411 Kawakami?H.,Shinohara,N.,andSakai.M.1998.Thenon— specificimmunontimulationandadjuvanteffectsofVibrioanguillarumbacterin,B— glucan?chitinandFreund'scompleteadjuvantagainstpasteurellapiscicidainfectioninyellowtail.FishPathology.33:287~292 Kono,M.,Matsui,T..andShimizu,C.1987.Effectofchitin.chitosanandcelluloseasdietsupplementsonthegrowthofculturedfish.Bul1.Ja— pan.Soc.Scient.Fish,53(1):125,129 Ortufio?J.?Esteban,M.A.,andMeseguer?J.1999.EffectofhighdietaryintakeofvitaminConnonspecificimmuneresponseofgiltheadsea— bream(SparusaurataL.).Fish&ShellfishImmunology,9:429,443 Ortuho?J.?Esteban,M.A.,andMeseguer,J.2000.Highdietaryintakeofalphat0c0pher0lacetateenhancethenon-specificimmuneresponseof giltheadseabream(SparusaurataL.).Fish&ShellfishImmunology,10:293,3O7 Sakai.M.1999.Currentresearchstatusoffishimmunostimulants.Aquaculture,172:63,92 Shiau,S.,andYu,Y.1999.Dietarysupplementationofchitinandchitosandepressesgrowthin tilapia,Oreochr0minil0ff"×C口"," . A0ua— culture,179:439,446