过氧化氢酶对高糖诱导NIT-1胰岛β细胞Pax6基因表达下降的影响

过氧化氢酶对高糖诱导NIT-1胰岛β细胞Pax6基因表达下降的影响 过氧化氢酶对高糖诱导NIT-1胰岛β细胞 Pax6基因表达下降的影响 第27卷第3期 2006年5月 中山大学(医学科学版) IOURNALOFSUNYAT-SENUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES) VoL27No.3 May2006 过氧化氢酶对高糖诱导NIT一1胰岛13细胞Pax6 基因表达下降的影响 周嘉,李英,杨川i,严励,傅祖植 (中山大学附属第二医院内分泌科,广东广州510120) 摘要:【目的】探讨过氧化氢酶catalase)对高糖诱导的NIT—I胰岛13细胞成对同源异形盒转录因子6 (Pax6)基因表达下降的影响.【方法】体外培养NIT一1胰岛13细胞24h,分4个处理组:低糖组(NG),低糖+过 氧化氢酶组(NG+c),高糖组(HG),高糖+过氧化氢酶组(HG+C),用2,7二氯氢化荧光素二酯(H2DCF—DA)染色 检测活性氧簇(ROS)的水平,RT—PCR半定量检测Pax6mRNA表达.【结果】HG组ROS水平(1.10~0.24)明显 高于NG组(O.95-+0.26),P<0.05;HG+C组ROS水平(0.94-+0.26)低于HG组,P<0.05;HG组Pax6mRNA表达 (0.64-+0.O9)低于NG组(O.93-+0.12),P<o.05;HG+C组Pax6mRNA表达(O.74~0.11)高于HG组,但差异无统 计学意义,P>O.05.【结论】高糖可使NIT一1胰岛B细胞内ROS产生增加,胰岛B细胞特异性转录因子Pax6 基因表达下降,给予ROS的抗氧化剂过氧化氢酶后,Pax6基因表达有所恢复,但差 异无统计学意义. 关键词:NIT—l胰岛B细胞;Pax6;活性氧簇;过氧化氢酶 中图分类号:R581文献标识码:A文章编号:1672.3554(2006)03.0262.04 EffectsofCatalaseonDecreaseofPax6ExpressionInducedbyHyperglycemia ZHOUJia,LIYing,YANGChuan,YANLi,FUZu—zhi (DepartmentofEndocrinology,TheSecondAfFiliatedHospital,SUNYat-senUniversity,Guangzhou510120,China) Abstract:【Objective】 ToobservetheeffectofcatalaseonthedecreaseofPax6expressioninducedby hyperglycemiainNIT-1cells.【Methods】 NIT-1cellsweredividedintofourgroups:normalglucoseconcentration withoutorwithcatal~e(NG,NG+C);highgluco~concentrationwithoutorwithcatalase(HG,HG+C).Invitrothe cellswereculturedinthedifferentmediumasmentionedabovefor24hours.Thenthecellswereusedfor2',7'一 diacetate(H,_DCF—DA)stainingtodetectthelevelofreactiveoxygenspecies(ROS)and evaluatetheexpressionofPax6mRNAbyRT—PCR.[Results】 ThelevelsofROSinHGgroup(1-10i-0.24)were higherthanthoseofinNGgroup(0.95-+0.26,P<O.05),butthelevelsofROSinHG+Cgroup(0.94-+0.26,P<O.05) werelowerascomparedwithHGgroup.Onthecontrary,theexpressionofPax6inHGgroup(O.64?0.09)waslower thaninNGgroup(0.93-+0.12,P<O.05).ThemRNAlevelofPax6inHG+Cgroup(0.74~-0.11,P>O.05)washigher thaninHGgroupwithoutstatisticalsignificance.【Conclusion】 Thehyperglycemiacouldinducetheincreaseof ROSanddecreaseofPax6mRNAlevelsinNIT一 1cells.TheantioxidantcouldpartiallyrestorethedeclineofPax6 causedbyhyperglycemia,butnotsignificant. Keywords:NIT一1cellline;Pax6;reactiveoxygenspecies;catalase 【JSUNYat—SellUniv(MedSci),2006,27(3):262—265】 胰岛素抵抗和p细胞分泌功能障碍是2型糖 尿病发病机制中的两个重要环节【1].研究表明,长 期的高血糖可以导致p细胞特异性转录因子如胰 和十二指肠同源盒基因一1(pancreaticduodenal homeobox一1,PDX一1),成对同源异形盒转录因子6 (pairedhomeoboxtranscriptionfactor6,Pax6)等基 因表达下降,从而影响胰岛素的合成和p细胞的 分化【2],但机制未明.对酒精引起胎儿眼,脑畸形的 收稿日期:2005.11-04 基金项目:教育部博士点科研基金资助项(D002000001);卫生部科学研究基金资助项目(D000099009) 作者简介:周J(1975-).女,广西南宁人,博士生.E-mail~Kellyzhoujia@hotmail.tom 第3期周嘉,等.过氧化氢酶对高糖诱导NIT-1胰岛B细胞Pax6基因表达下降的影响263 研究p.4】发现,活性氧簇(reactiveoxygenspecies, ROS)导致Pax6基因表达的下降可以被抗氧化剂 过氧化氢酶纠正,结合目前许多研究表明氧化应 激参与B细胞的"葡萄糖毒性"嘲,我们以前的研究 也提示体外长期高糖培养B细胞株NIT一1,Pax6 基因表达下降.本研究讨论该现象是否是由于高 糖导致ROS升高所致,ROS的抗氧化剂过氧化氢 酶是否能改善此现象. 1材料与方法 1.1材料 NIT一1胰岛B细胞由北京301医院母义明教 授惠赠,DMEM低糖,高糖培养基(分别含1.0g/L, 4.5s/L葡萄糖)购自Gibco公司,过氧化氢酶,2,7 二氯氢化荧光素二酯(H2DCF—DA),葡萄糖购自 Sigma公司,Trizol购自Invitrogen公司.RT试剂盒 购自Fermentas公司,PCR试剂盒购自宝生物 有限公司. 1.2方法 1.2.1细胞培养NIT一1胰岛p细胞予含150 m饥胎牛血清的DMEM低糖培养基(1:0g/L葡 ,10mmo1]LHEPES,1 萄糖,4mmolIL谷氨酰胺 mmol/L丙酮酸钠,2.0g/L碳酸氢钠)培养于37 含体积分数5%CO:细胞培养箱.取对数生长期的 细胞,按lxl05个/::fL接种于6孔板,细胞生长至 60%,80%融合时,予含5g,L牛血清白蛋白(BSA) 的DMEM低糖无血清培养基饥饿细胞2h,弃除培 养基,分为4组处理组:低糖组normalslucose, NG,DMEM中葡萄糖5.6mmol/L),低糖+过氧化氢 酶组(NG+C,过氧化氢酶200U/mL),高糖组(high glucose,HG,DMEM中葡萄糖30mmol/L),高糖+ 过氧化氢酶组(HG+C,过氧化氢酶200U/mL),培养 24h. 1.2.2RNA提取NIT一1胰岛B细胞按上述分组 培养24h后,采用Trizol法制备总RNA.制备的 RNA样品用紫外分光光度计检测A拗,A珈,并计 算A珈值以判断RNA浓度. 1.2.3RT—PCReDNA第一链的合成按产品说 明书进行.PCR扩增的引物序列:Pax6上游5,一 GTCAGACCTCCTCATACrI?GTG一3下游5一TGC TCTCTCCTrCTCTCTTTAC一3,242bp;B—aetin上 游5一TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC一3下游5 一 TGAGGGACTrccTGTAACCACT一3,880bp).反 应条件:95?预变性3min,94?变性30S,62? 退火3Os,72?延伸50S,末次循环后72?延伸 5min,共进行30个循环.重复实验次数为3次. 1.2.4琼脂糖凝胶电泳20g,L琼脂糖凝胶电 泳,用凝胶成像系统存图,Alphalmager2200软件分 析. 1.2.5荧光显微镜检测细胞内H2o2的量NIT一1 胰岛B细胞按上述分组培养24h后,吸弃培养 液,用PBS洗3次,加人含H2DCF—DA的培养基 1mL(终浓度为10I~mol/L),室温下避光孵育 60min.吸弃含荧光探针的培养基,用PBS洗3 次,加入1mLPBS待测.细胞内1-120:的测定选 用激发波长为488nm,吸收波长为525am.20x 物镜下观察摄片,曝光时间为1s,亮度,对比度 固定,每样品取5个视野,绿色荧光强度平均光 密度使用Image—proplus软件定量,实验数 据以NG组为1进行标化分析,重复实验次数为 3次. 1.3统计学处理 资料进行正态分布检验以均数?标准差表示. 统计方法采用析因分析,检验水准cx=0.05. 2结果 2.1过氧化氢酶对高糖培养的NIT一1胰岛B细 胞的影响 2,7一二氯氢化荧光素二酯(H2DCF—DA)为不 发光的荧光染料,进人细胞后可被细胞内产生的 H20:氧化为发光的染料2,7一二氯荧光黄(DCF), DCF的生成量与细胞内H2o:的产量成正比.因 此,细胞内荧光强度可表示细胞内产生的H20:的 量.结果显示,NIT—I胰岛B细胞在不同处理组培 养24h后,经过H2DCF—DA染色,在荧光显微镜 下可见胞浆呈绿色荧光(图1).高糖诱导NIT—I 胰岛B细胞产生H2O:明显增加,HG组细胞平均 积分光密度(1.10+0.24)与NG组的(0.95~0.26)相 比,差异有统计学意义(F=8.252,P=0.005);给予 过氧化氢酶能明显抑制高糖诱导的H202增加. HG+C组平均积分光密度(0.94~0.26)与HG组平 均积分光密度相比,差异有统计学意义(F=8.351, P=O.005).而葡萄糖浓度与过氧化氢酶的交互效 应无统计学意义(0.029,P=-0.864). 囤INIT—l胰岛B细胞DCF荧光显撇成像 FI岱IMicru~raphafDCFinNIr—lcells[Kl ,:litJl~illI【J【?l】nl-13:Ji#lllI?rI…【,tt_?irlt一" I1+IalaJa~-,l':hLh十一IT^lJc" 圈2Pax6mRNART-PCR电泳图 Fig2Eltr0phen'grllIoJPa~6mRNART—PCR I:…rLr!:millIg'l-…???I【t?I ?T1…I;nl~4:FLaill?rIJ'El5:m'}t?I|lInJa~l "I 眺岛素抵抗和B细胞分泌功能障碍址2黼 尿病发病机制中个重《环骨III常的B细胞 可【Ij由过增加脯岛翥分泌或B细胞数日代偿脯岛 溪攀舞鋈一 魄三?一 镰 一 , M的岛捉崽氧 ? 第3期周嘉,等.过氧化氢酶对高糖诱导NIT-1胰岛B细胞Pax6基因表达下降的影响265 Pax6是编码转录因子发育控制基因的超家族Diabetes,2003,52(3):581—587? 的成员之一,在眼和中枢神经系统发育以及成体 [61KJORHOLTC,AKERFELDTMC,BIDENTJ,eta1. 胰腺的所有内分泌细胞中均有表达,是胰腺细胞chmmhyperglyc.mi,md.pendenofplasmahP坩 分化和发育的关键调节因子.Yasuda等研究发evel.'issu伍mf0.kof3-ell衄瑚.n 现Pax6基因突变可引起眼的发育异常和糖耐量i三,t5h4e(9)db./2d7b55m— ou 2 se 763 m . oddof 异常;Ashery—Padan等研究也提示Pax6基因失[71sILVG,RoBERT0L' r L0 -- REuM,eta1. 活可引起早发糖尿病,因此,Pax6基因的功能对FuncfionalandmoleculardefectsofpaIlcreaticisletsin 维持胰岛p细胞正常功能具有一定的作 用.PenghumaIltype2diabetes[J].Diabetes,2005,54(3):727一 等【3,4】在研究酒精对胚胎期眼和脑发育中发现,抗735. 氧化剂过氧化氢酶可以逆转酒精诱导的ROS对[8】wuL,NICHOLSONW,K_NOBELSM,eta1. Pax6基因表达的抑制,从而改善眼和脑的发育的 Oxidativestressisamediatorofglucosetoxicityin 一 些异常,提出ROS介导的Pax6基因表达下降在insulin—secretingpancreaticisletcelllines[J】.JBiol 酒精导致的眼,脑发育异常中有重要的作用.我们Chem,2004,27903):226一234? 研究也显种?璺境培养24h, Pax6mRNA表达下降,明显低于NG组;zI-ati.二''ts'. 高糖培养同时给予抗氧化剂过氧化氢酶,Pa)【6AcadSciusA,199;,96(1):10857—108占: mRNA表达水平高于HG组,但差异无统计学意[10】SAKURABAH,MIZUKAMIH,YAGIHASHIN,eta1. 义,需要进一步的研究.Reducedbeta—ceIImassandexpre8sionofoxidative 总之,本研究的结果表明高糖可使NIT一1胰stress—relatedDNAdamageintheisletofJap蚰ese 岛p细胞内ROS产生增加,胰岛B细胞特异性转 TypeIIdiabeticpatients[J】.Diabetologia,2002,45(1): 录因子Pax6基因表达下降,给予ROS的抗氧化剂85—96? 过氧化氢酶,Pax6基因表达有所恢复,但差异无[11】HAMAGUCHIK,REXGASKINSH,EDWARDH,et 统计学意义,ROS在高糖导致Pax6基因表达下降?NIT-l,pane瑚beta-celllin.establishedfrom 中的作用仍需进一步探讨.::nicNoDmm.use[J]?Diabes,99,40(7): 参考文献:[12]TSUBOUCHIH,INOGUCHIT,INUOM,eta1. Sulfonylureaaswellaselevatedglucoselevelsstimulate [1】SALTIELAR,KAHNCR?Insulinsignalingandthereactiveoxygenspeeiesproductioninth epancI?aticB一 gultio"ofglueo.eandlipidmetabolism[J]?Nature,ceIIline. MIN6一aroleofNAD(P)Hoxidasein13-cells 2001,414(6865):799—8o6?[J]. BiochemBiophysResCommun,2005,326(1):60一 [2]JONASJC,SHARMAA,HASENKAMPW,eta1.65. ChronichyperglycemiatriggerslossofpancreaticB一[13】GREENK , BRANDMD,MURPHYMP.Preventi.n ceudi艉础 ltiati0ninananimalmodelofdiabetes[J].Jofmitochondfialoxidativedamagea8atherapeuti c BiolChem,1999,274(20):14112—14121?strategyindiabetes[J]. Diabetes,2004,53(sii):s110一 [3】PENGY,YANGPH,GUOY,eta1.Catalaseand118. peroxiredoxin5protectXenopusembryosagainst[141OLIVEIRAHR , VERLENGIAR,CARVALHOCR.et altohol—inducedocularanomalies[J]?InvestOphthalmola1.Pancreaticbeta—cellsexpI?ssphagocyte—likeNAD VisSci,2004,45(1):23—29?(P)Hoxidase[J]. Diabetes,2003,52(6):1457—1463. [4]PENGY,YANGPH,NGSS,etal?Protectionof[15】YASUDAT ,KAJIMOTOY,FUJITANIY,eta1.Pax6 Xenopuslaevisembryosagainstalc.h.l—inducedmurati onasageneticfact0rc.衄0ntoaniridiaand delayedgutmaturationandgrowthretardati.nbygluc.seintolerance【『】. Diabetes,2002,5i(i):224—230. peroxi陀dn5andcatalase[j]?JMolBiol,2004,40[16】ASHERY—PADANR,ZHOUX,MARQUARATT.et (4):819—827.a1.Conditi0nalinactivationofpax6inthep叽creas [5]ROBERTSONRP,HARMONJ,TRANPO,eta1.causeearlyon8etofdiabetes 【『】.DevBiol,2004,269 G1cosetoxicityin13--cells:type2diabetes,good(2):479—488. radicalsgonebad,andtheglutathioneconnection[J]?(编辑张恩健)