[word doc]植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体外抗氧化活性的对比研究

[word doc]植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体外抗氧化活性的对比研究 植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌 体外抗氧化活性的对比研究 V,ww.chinadairynet zgrpgy@163.corn 中国乳品工业 dq@yINDUSTRY 植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体外抗氧化活性的对比研究 黄珊珊,刘晶,赵征 (1.天津科技大学食品与生物技术学院,天津3004572.河北经贸大学生物科学与工程学院,石家庄050061) 摘要:探讨了植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种完整细胞,无细胞提取物及灭活菌体的抗氧化活性.测定了两种乳酸菌DPPH (i,1一二苯基一2一三硝基苯肼)清除能力,羟自由基清除能力,超氧阴离子清除能力,抗脂质过氧化能力,还原能力和对金属离子的螯合 能力,对比其抗氧化活性的差别.结果表明,植物乳杆菌的抗氧化活性优于保加利亚乳杆菌,这为综合利用植物乳杆菌提供了有利依据. 关键词:乳杆菌无细胞提取物;抗氧化活性;自由基清除能力;螯合金属离子能力 中图分类号:Q93—33文献标识码:A文章编 号:1001—223O(2010)10—0008-03 Studyonantioxidativeactivityoftwolacticacidbacteria shan,LIUjinga,2,ZHAOZheng HUANGShan— (1.CollegeofFoodEngineeringandBiotechnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China; 2.CollegeofBioscienceandbioengineering,HebeiUniversityofEconomicsandBusiness,Shijiazhuang050061,China) Abstract:Theintactcells,cell—freeextractandinactivecellsoftheLactobacillusplantarumandLactobadllusbulearicus’Santioxidativecapacity werestudied.ThescavengingcapacityofDPPH,hydroxylradical,andsuperoxideanion,inhibitionoflipidperoxidation,thereducingactivity andchelationcapacityofmetalionswereexamined,andthedifferencebetweenthetWOLactobacilluswascompared.Theresultsshowedthat Lactobadllusplantarum’SantioxidativecapacitywashigherthanLactobadllusbulgaricus’,whichprovidedthefoundationofcomprehensiveLltiliza- tionfortheLactobacillusplantamm. Keywords:Lactobacilluscell——freeextract;antioxidativeactivity;capacityonscavengingfreeradical;chelationcapacityofmetalions 0引言 正常情况下.生物机体拥有完整的氧化一抗氧化 平衡机制【1I.但是当机体出现病变或受外界环境毒害 的影响较大时.这种平衡可能被打破,机体产生的活 性氧(p.os)及其它自由基不能有效地被抗氧化机制 所清除.就会对机体产生毒害作用12].近年来.科研工 作者通过寻找外源性抗氧化物质来帮助人们寻找由 自由基和活性氧引发的多种疾病的治疗方法刚,如高 血压l5】,缺血性心脏病,关节炎闭,癌症等.合成抗氧 化剂由于低廉的价格被广泛使用,但安全性受到质 疑因此天然抗氧化剂在抑制脂类过氧化嘲.保护人体 免受自由基引发的氧化损害方面的优势引起科研工 作者的兴趣乳酸菌的抗氧化t】作用日益成为研究 的热点酸菜是一种独特而具有悠久历史的乳酸发酵 蔬菜制品其汁液中富含乳酸菌活菌.赋予酸菜多种 营养保健功效.对其深入研究且开发利用,对提高人 民健康水平,开发蔬菜加工品种,蔬菜原料的综合利 收稿日期:2010—07—02 作者简介:黄珊珊(1985一),女,硕士研究生.研究方向为乳与乳制品加 工. 通讯作者:赵征 用有着积极意义.试验对自然发酵的酸菜进行乳酸茵 的分离鉴定.并与具有较高抗氧化活性的保加利亚乳 杆菌进行比较.确定了一株新的具有抗氧化性的菌株. 1实验 1.1 德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.B);植物乳杆菌(L_ P):从酸菜中分离提取;MRS培养基. 1.2方法 1.2.1菌体的制备 (1)乳酸菌的培养及无细胞提取物的制备. 将乳酸菌活化培养后接种于MRS液体培养基中. 37?d:~24h.培养液经4000r/min,4?离心10min, 收集的菌体经去离子水两次洗涤后.再将菌体细胞重 悬,调整细胞浓度为1.Ox109mL,,所得菌悬液分为两组, 一 组作为活细胞组.另一组用于细胞破碎物的制备. 将菌体用蒸馏水,制成菌体悬液.用超声波粉碎 仪,300W条件下,每处理5S,间隔5S,超声粉碎30min, 显微镜下检查没有完整菌体,然后以4?,6000r/rain 离心10min,收集上清液,即为无细胞提取物,备用. (2)乳酸菌灭活菌体的制备. 82010~;8番第{9期(总第2;9期) ResearchPapers研究报告 菌体制剂在100oC热处理30min即为菌体灭活组. 1.2.2羟自由基清除能力的检测: 在10mL的具塞试管中依次加入浓度为5mmol/L 硫酸亚铁溶液1mL.5n3]rlo1/L水杨酸一乙醇溶液 1mL.3mmol/L双氧水溶液1mL,混合均匀后加入不 同体积(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mL)的待测液,与待测液 相同体积浓度为1mmol/L的抗坏血酸做阳性对照,用 双蒸水补齐至刻度.在37??0.1?的恒温水中反应 15min后.6000r/min离心10rain.然后以双蒸水作参 比.在510nIn下测定吸光度清除率计算为 清除率=Q;×100%. 以n 式中:.为空白组的吸光度;为加入待测溶液 后的吸光度. 1.2.3清除超氧阴离子的测定 清除超氧阴离子的测定采用邻苯酚自氧化法.其 清除率为 清除率=(1一样)% 式中:空为空白组的吸光度,样为加入待测溶液 后的吸光度,下同. 1.2.4抗脂质过氧化能力的测定 0.5mL的PBS溶液(浓度为0.02mo1/L,pH:7.4)中 加入1mL亚油酸的乳化液,加.,K~FeSO(质量分数o. 叭%)和Ho催化氧化,再加入0.5mL-~k酸菌菌体或乳 酸菌无细胞提取物.37?水浴反应12h混合液加入 0.2mL的ATC(4%),2InL的TBA(质量分数0.8%),0.2mL ~JBHT(质量分数0.4%),反应液100?反应30min,冷却 后加入2.5?L三氯甲烷抽提.离心收集上清液在532nm 下测吸光值.实验中以PBSf~为空白对照. 抗脂质过氧化率=(1一样自)×100%. 1.2.5DPPH清除能力的检测 取样品2mL.加入0.2mmol/LDPPH.无水乙醇 1mL.混匀后在室温下避光反应3Omin,并在6000r/min 下离心10min.取上清液测定吸光度,.空白组以等体 积无水乙醇代替DPPH溶液.对照组以等体积蒸馏水 代替样品溶液.并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液 空白调零.在517nm下测定吸光度.清除率为 清除率=【1一(一)/Ao]×100%, 式中:.为对照组吸光度;为样品组吸光度; 为空白组吸光度 1.2.6样品还原能力的检测 0.5H儿样品溶液,O.SInL铁氰化钾(质量分数1%) 和0.5mL的PBS混合物在5O?水浴20min.冷却后加 入TCA沉淀蛋白,4?,4500g离心10min,取1mL上 清液与1H正三氯化铁(质量分数0.1%)反应后,于700nm 测吸光度.其中L一半胱氨酸作为标品. 1.2_7对金属离子的螯合能力 X~JCuz的螯合:用邻苯二酚紫作为金属螯合指示 剂.向1n1L浓度为2rnmo]/L的硫酸铜溶液,1mL质量 分数为10%的吡啶与2OL质量分数为0.1%的邻苯二 酚紫混合物中添加1mL的样品溶液.以蒸馏水代替样品 作空白组邻苯二酚紫溶液颜色的变化可以于632nm波 长处测得 螯合台邑力=(1—样/.4)×100%. 对Fe的鳌合:1InL浓度为2Otxmol/L的FeC1,与 1rnL浓度为0.5I11I11o1/L的Ferrozine混合后会产生一种 物质,在562nm处有强吸收.向其中添加0.5mL的乳 清蛋白水解物.于562nm波长处测定吸光度. 螯合能力计算方法同上.每一吸光值平行测3次. 取其平均值 2结果与讨论 2.1植物乳杆菌清除羟自由基的能力 图1为不同菌体清除羟自由基能力比较由图1可 以看出,L.P表现出显着的清除羟自由基的能力.其中 不同浓度的L.P灭活菌体抗氧化活性都强于1Inmo1/L 的抗坏血酸随着浓度的增加.清除羟自由基的能力 也增强.初步说明此株植物乳杆菌具有较高的抗氧化 性能,为了进一步证明,将其与实验室已有的具有较 高抗氧化性的德氏乳杆菌保加利亚亚种进行比较.研 究其抗氧化性能 O.7 0.6 O.5 0.4 篮O.3 蛭0.2 O.1 O 0.51.O1.52.O2.5 体积/mE ~lmmol/LVC;IL.P完整细胞; ?L.P无细胞jDL.p灭活菌体 图1清除羟自由基能力比较 2.2两株乳酸菌清除超氧阴离子能力的比较 图2为不同乳酸菌对超氧阴离子自由基的清除能 力由图2可以看出.Lp和L.B两株菌对超氧阴离子有 不同清除作用.其中.两株菌体的无细胞提取物都表 现出很强的清除自由基能力.其次为完整细胞.灭活 菌体的清除能力最弱其中.L.p无细胞提取物清除率 达到了48.7%.这与先前的报道[41相符.说明乳酸菌胞 内物质是引起清除超氧阴离子能力的主要因素 0.6 0.5 \0.4 雏, 0.1 0 L.p完整L.B完整Lp无纽胞u习翔胞L.P灭活LB灭活 图2对超氧阴离子自由基的清除能力 2.3两株乳酸菌抗脂质过氧化能力比较 图3为不同乳酸菌对亚油酸抑制能力的比较.由 图3可以看出,加入L_P和LB两株菌后,样品体系中亚 油酸氧化受到了一定的抑制.表明乳酸菌能有效的抑 Vo1.38.No102010(totd129 圈 L?? 研究报告ResearchPapers 制亚油酸的氧化.其中添加无细胞提取物样品组的抑 制力最强.表明胞内物质是乳酸菌产生抗亚油酸氧化 活性的主要因素.这一发现与先前的关于乳酸菌抗氧 化报道吻合,其次.L.p和LB灭活菌体抑制亚油酸能 力也较好. \ 静 一 最 Lp无蛐胞u3无细胞Lp完整LB完整L?p’Xg,LB灭活 图3对亚油酸抑制能力比较 2.4两株乳酸菌清It~.DPPH能力比较 图4为乳酸菌清除DPPH自由基能力比较结果由 图4可以看出.L.p和L.B两株菌对DPPH都有不同清 除作用.其中.两株菌的灭活菌体都表现出很强的清 除DPPH的能力.其次为无细胞提取物.完整细胞组的 清除能力最弱 Lp无细胞LB无细胞L.p完整L.B完整Lp灭活LB灭活 图4乳酸菌清除DPPH自由基能力 2.5两株乳酸菌还原能力的比较 表1为两株乳酸菌还原能力比较结果.由表1可以 看出,L.P无细胞提取物还原活性最强,达到了(307+ 5.4)/.Lmol/L.株乳酸菌的灭活菌体也都表现出较好的 还原活性. 表1两株乳酸菌还原能力比较btmol/L 2.6两株乳酸茵螯合金属离子能力的比较 图5和图6为不同乳酸菌螯合铜离子及亚铁离子 能力由图5和图6可以看出.L.P和LlB两株菌对金属 有较强的螯合能力.其中L.P的螯合能力都强于L.B. 乳酸菌完整细胞表现出最高的螯合能力.其次为灭活 菌体.无细胞提取物能力最弱.这一发现说明乳酸菌 胞内物质不是螯合金属离子的主要因素其中.L.p完 整细胞螯合亚铁离子能力很强.达到83.1%.乳酸菌螯 合亚铁离子的能力强于螯合铜离子的能力 \ 佟 《? 潮 LP完整LB完整Lp无细胞LB无细胞LP灭活LB灭活 图5不同乳酸菌螯合铜离子能力 LP完整LB完整Lp无细胞LB无细胞Lp灭活LB灭活 图6不同乳酸菌螯合亚铁离子能力 3结论 (1)两种乳酸菌完整细胞,无细胞提取物和灭活 菌体都具有抗氧化活性.但水平相差较大.植物乳杆 菌的抗氧化活性优于保加利亚乳杆菌 (2)在大多指标中.无细胞提取物都表现出较强 的抗氧化活性.这说明乳酸菌胞内物质是菌产生抗氧 化活性的主要因素.这就为研究乳酸菌无细胞提取物 抗氧化活性机理时丁下了良好的基础 (3)乳酸菌灭活菌体也有一定的抗氧化活性.这 就为综合利用乳酸菌提供了有利依据.开辟了乳酸菌 应用的新途径 参考文献 【i]TALWALKARA,KAILASAPATHYK.MembohcandBiochemicd ResponsesofProbioticBacteriatoOxygen[J].J.DairySci.,2003,86: 25372546 [2】LINMY.ReactiveOxygenSpeciesandLipidPeroxidationProduct— ScavengingAbilityofYogurtOrganismsUJ1J.DairySci.,1999(82): 1629-1634 }3]KULLISAART,SONGISEPPE,MIKELSAARM,eta1.Anfioxida— tiveProbioticFermentedGoats’MilkDecreasesOxi&fiveStress-Me — diatedAtherogenicityinHuman[J].Br.J.Nutr,2003,90:449456. 【4]KULLISAART,ZILMERM,MIKELSAARM,eta1.TwoAnfox— idafiveLactobacilliStrainsasPromisingProbioticsInt.J.FoodMi— crobio1,2002,72:215—224 【5】BOON—HUATBAY.LipidPeroxidativeStressandAntioxidativeEn— zymesinBrainsofMilk—SupplementedRatsDI.NeuroscienceLe~em, 1999(277):127—130. 【6]VEKENAJK.ImpactofLacticAcidBacteriaonOxidativeDNA DamageinHumanDerivedColonCells卟FoodandChemicalToxi- cology,2008(46):1221一i229.(下转第27页) I10I 阻圈圈圈 印??加如 00OO0000000 水\瓣 ResearchPapers研究报告 层明显的水合的副K一酪蛋白.颗粒之间的空隙相对变 大了.从而增加了体系的流动性:当水分添加量过高 时.再制干酪产品中的酪蛋白体系变得更加光滑,而 此时脂肪球并没有显着变小.可能的原因是水分质量 分数过高导致乳化盐和酪蛋白浓度变小.从而影响了 乳化效果可见.在一定范围内.随着水分质量分数的 增加.乳化盐的乳化效果更强了.酪蛋白体系变得光 滑均匀.再制干酪中的脂肪球也逐渐变得更小而且变 得更光滑了[8lO] marchesseau等人认为.水分的增加伴随着整个体 系f~JpH值(高于酪蛋白的等电点)的升高,从而提高了 蛋白质的净负电荷.这削弱了蛋白质之间的相互作用 力.从而提高了酪蛋白的水合作用.这个较高的静电 斥力同样也可以稳定原来彼此远离的不带电荷的蛋 白质链而这个损失的静电作用力可能会通过形成新 的作用力.例如氢键结合和疏水作用而得到补偿这 些作用力是低能量的.而且是伴随着蛋白质对水分的 吸附而形成的从而得到更柔软的再制干酪产品 Pau11.Hennelly等人针对模拟干酪中的水分含量的影 响得到了类似的结论,121 3结论 本研究表明.水分对再制干酪各方面的功能性质 影响很大.随着水分添加量的增加.再制干酪产品的融 化性增强.表观黏度降低水分对再制干酪产品的物 性的影响也很明显,硬度,黏着性,咀嚼性均随着水分 的添加有明显的下降.而对弹性的影响呈现出一种先 减小后增加的趋势.从微观结构中可以看出.水分影 响酪蛋白的乳化作用.随着水分添加量的增加.脂肪 球的数目开始增加.个体开始变小.但是这种趋势也 有一定的限度.当水分含量过高时.会出现相反的趋 势.可能是由于过多的水分使得乳化盐的浓度变低 参考文献: [I】范丽芳.再制干酪的技术难点卟中国乳品工业,2004,32(2):48—50. 『21武晗,李晓东,刘怀伟,等加工条件对涂抹型再制干酪品质的影响 ll1.食品科学,2008,29(03):200—203. f31PAULIH.IncreasingtheMoistureContentofImitationCheeseEg fectsonTexture,RheologyandMicrostructureU].EurFoodRes Technol,2005,220:415-420. f41张国农,顾敏峰,李彦荣,等.工艺参数对再制干酪的质构和流变性 质的影响U].中国乳品工业,2006,191(10):9-13. 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