口腔上皮细胞与白色念珠菌相互作用的体外实验研究

口腔上皮细胞与白色念珠菌相互作用的体外实验研究 中国医科大学 博士学位论文口腔上皮细胞与白色念珠菌相互作用的体外实验研究 姓名:张凌 申请学位级别:博士 专业:口腔临床医学 指导教师:王兆元 20050301 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的并表示谢意( 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任( 论文作者签名:,垄:墨: 日期:,翌,:～:,? 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学(学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅(学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文( 论文作者签名: 指导教癖签名: 、 中文论著摘要 ，; ,,腔上皮细胞与白色念珠菌相互作用的体外实验研究 目 的 白色念珠菌是正常口腔菌丛的一部分，为条件致病菌，在口腔中存在可以表现为无临床症状的健康带菌者或有临床体征的口腔念珠菌病。近年来随着大量免疫抑制剂、广谱抗生素、普遍开展导管、插管，广泛进行放疗、化疗、器官移植，免疫抑制患者尤其是艾滋病患者的不断增加导致念珠菌感染逐年上升，已成为影响人类生活质量、威胁生命健康的重要疾病之一。目前国际上对白色念珠菌感染发病机制的研究热点主要集中在两个方面，一是宿主本身的防御机制对病原菌的吞噬、杀伤作用;二是病原菌本身的毒力因素的探讨，特别是在其与宿主之间的相互作用中发生了那些变化尚不明确，需要大量的基础研究。白色念珠菌感染机体与菌体的形态改变、蛋白酶、毒力因素及对宿主细胞的粘附等因素有关，白色念珠菌与口腔上皮细胞的粘附是菌体从上皮侵入、进而导致白色念珠菌病的最初阶段。白色念珠菌侵入将激发宿主动员机体的防御机制引起炎症反应，有大量证据说明血管内皮细胞、肥大细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞参与宿主对抗白色念珠菌的免疫保护反应。但关于口腔白色念珠菌感染宿主，局部黏膜防御反应的研究并不多，尤其是在上皮细胞和白色念珠菌最初接触时上皮细胞免疫调节活动的研究领域尚存在大量未知空白，有关上皮细胞细胞因子表达分泌的最初方式和功能，仍未达成一致的意见，分歧颇多，正逐渐成为国外的研究热点。 本实验就白色念珠菌对,,,腔上皮细胞的粘附及上皮细胞对白色念珠菌最初侵入的防御反应利用相差显微镜、扫描电镜和透射电镜从细胞学及亚细胞学角度的观察和研究，探讨白色念珠菌侵袭宿主及宿主上皮细胞的防御机制。 白细胞介素一,、肿瘤坏死因子一,、细胞间粘附分子一,和单核细胞趋化蛋白一,分别是重要的炎性因子和化学趋化因子，本实验应用酶联免疫吸附实验(,,,,,,—,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,，,,，,,)、逆转录一聚合酶链式反应(,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,—,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,,，,,—,,,)从蛋白与基因水平上观察白色念珠菌对口腔上皮细胞表达、分泌，,一,、,,,一仪、，,,,—,和,,,一,的影响，探讨口腔黏膜上皮细胞防御白色念珠菌感染的免疫机制。 念珠菌性自斑是一种角化型病变，又称为慢性增生性念珠菌病，有关自色念珠菌感染与口腔白斑病的因果关系目前仍有争议，有学者指出念珠菌感染不仅是附加于白斑上的而且是自斑的致病原因。口腔自斑与局部臼色念珠菌感染的关系引起了国内外学者的重视，揭示二者的关系已成为研究的热点。本实验将采用流式细胞仪从细胞分裂增殖角度观察白色念珠菌对口腔上皮细胞周期的影响，从另,种角度探讨白色念珠菌感染与癌变的关系。 方 法 ,(白色念珠菌的培养及菌丝的诱导:白色念珠菌,,,, ,,,,,(中圈医科大学检验科惠赠)在沙堡氏培养基上转种,次后，根据,(,麦氏浊度,,,,,,,,,,白色念珠菌洗菌配成菌悬液，浓度为,,,,,,,,,。将菌株转种于含,,,小牛血清，,, ,(,的,,,， ,,,,培养液，,,?孵育,,后，,,,白色念珠菌转为菌丝相。将菌体稀释成系列浓度用于分组实验。 ,(口腔上皮细胞传代培养:冻存口腔上皮细胞,,复苏，细胞传代培养，待细胞长至对数生长期(约,,,个,,,)时，用于实验。 ,(白色念珠菌和上皮细胞相互作用:先将,,细胞培养于培养瓶中，,,小时，使细胞贴壁成单层。吸弃培养液，用,,,洗,次。实验分成,组进行，分别于培养的,,细胞中加入:,(加入白色念珠菌培养上清(将浓度为,,,,,,,,,的白色念珠菌悬液，采用无菌过滤法滤出上清);,(加入,,,?,,,,,煮沸灭活的菌丝相白色念珠茵;,(加入菌丝相的白念珠菌;,(加入孢子相的白念珠菌(为防止白色念珠菌孢子相向菌丝相转变，将含,,,血清的培养液换成无血清培养液);另设阴性对照:为单独培养的上皮细胞。继续培养,,、,,、,,、,,小时。 ,(电镜观察及分析:洗去游离的白色念珠菌后制成扫描和透射电镜观 ?,?察标本，观察分析白念菌对,,细胞的粘附、侵袭及,,细胞对白念菌的吞入和防御。 ,(酶联免疫吸附实验检测:分别将共同培养,,、,,、,,、,,,时收集。一,,?冻存的上清样本溶至室温，按照，,一,、,,,一,【、，,,,—,、,,,,,的,,，,,试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)说明书操作，在,,,,,波长下测定样本,,值，根据标准曲线得到各样本的浓度，最后计算培养上清中的实际浓度。 ,(逆转录一聚合酶链式反应观察白色念珠菌对,,表达，,一,、,,,—,、，,,,一,、,,,—, ,,,,的影响:采用异硫氰酸胍一酸一酚一步法抽提总,,,，采用合成试剂盒(宝生物有限公司)逆转录合成,,,,，根据北京奥科生物技术有限公司设计的引物序列进行,,,扩增。,—,;,,,用作内定参比标准。,,,条件是:,,?变性,分钟，,,?,,秒，,,?,,秒，,,?,分钟，,,个循环后,,?延伸,分钟。，,一,:上游引物为:,、一,,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,,一,、，下游引物为:,、一,,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,一,”;,,,—,:上游引物为:,、一,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,一,、，下游引物为:,、一,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,一,、;，,,,一,:上游引物为:,、一,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,、，下游引物为:,、一,,, ,,, ,,,,,, ,，,, ,,, ,,一,、;,,,一,:上游引物为:,、,,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,,一,、，下游弓,物为:,、一,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,一,、;取,,,产物,,,上,，,,琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察拍照。 ,(白色念珠菌对,,细胞细胞周期的影响:先单独培养,, 细胞,,小时，使其贴壁成单层。吸弃培养液，用,,,洗,次。,)加入菌丝相的自念珠菌;,)加入孢子相的白念珠菌;,)对照:单独培养的上皮细胞。继续培养,,小时，,(,,,胰酶消化各组细胞，收集于离心管中，,,,洗,次，加入碘化丙啶(,，)染液，避光,;;作用,,分钟，流式细胞仪收集检测细胞,,,周期，软件分析,,,,。期、,期、,:,,期细胞百分数。 结 果 ,(相差显微镜下观察 正常培养的,,细胞成多边形，成“铺路石”样排列，细胞大小均一，细胞间连接紧密。核大，圆形，位于细胞中央，其间可见核分裂相;加入自色念 ?,?珠菌悬液,,小时后，白色念珠菌大量繁殖，并有大量菌丝生成，粘附于,,细胞上，细胞变圆，核形变浅甚至消失，细胞连接消失，游离存在;加入灭活白色念珠菌培养,,小时后，,,细胞形态来见改变。 ,(电镜观察 在与,,细胞共同培养,,,、,,,、,,,的培养皿中均可观察到孢子相白色念珠菌向菌丝相的转变，且随着时间经过菌丝相白色念珠菌显著增多。洗去游离的白色念珠菌后，扫描电镜观察发现，白色念珠菌随时间推移与,,细胞表面粘附的菌量增加，,,,为每视野平均,个白色念珠菌，,,,为每视野平均,,个，,,,为每视野平均,,个;而灭活的白色念珠菌无生长繁殖能力，几乎不与,,细胞发生粘附，即使粘附也被,,细胞吞噬，,,,为每视野平均,个，,,,为每视野平均,个，到,,,几乎没有。共同培养数小时后，白色念珠菌孢子开始芽生出菌丝，并且有的菌丝穿透,,细胞膜，伸入到细胞内部。 ,(白色念珠菌对,,细胞表达及分泌细胞因子的影响 ,)，,一,:,,,,水平:对照组和上清组基础表达，,一, ,,,,，孢子组、灭活菌组及菌丝组刺激,,细胞表达，,一,增强。上清液中蛋白水平:对照组、上清组分泌少量的，,一,蛋白，孢子组、灭活菌组及 孔槎枷灾 赜盏迹耍孪赴 置冢桑桃唬福 攵哉兆橛邢灾 圆钜臁,野咨 钪榫 碳ぃ桑桃唬阜置谒媸奔涞菰觯 罚残?贝锏礁叻澹 婧蠼档停唬耍孪赴 置冢桑桃唬杆孀啪 吭龆喽 跎伲 氏指合喙匦浴?,),,,一,,,(:,,,,水平:对照组、上清组、灭活菌组均不表达，孢子缀微量表达，菌丝组强阳性表达。上清液中蛋白水平:对照组、上清组、灭活菌组均不表达，孢子组微量表达，菌丝组少量表达。 ,)，,,,一,:,,,,水平:对照组、上清组、灭活菌组均不表达，孢二,组、菌丝组强阳性表达。上清液中蛋白水平:对照组、上清组、灭活菌组、孢子组、菌丝组均未见表达。 ,),,,一,:,,,,水平:对照组不表达，上清组、灭活菌组、孢子组、菌丝组强阳性表达。上清液中蛋白水平:对照组、上清组、灭活菌组、孢子组、菌丝组均未见表达。 ,(白色念珠菌对,,细胞细胞周期的影响 与对照组相比，菌丝组,。,,。期细胞所占比例较对照组降低，,期、,:,,期所在百分比显著高于对照组，反映细胞增殖活力的增殖指数(,，,:, ?,?,)增高，经统计学检测与对照组问有显著性差异，,,,(,,。而孢子组的,,细胞其,期、,:,,期细胞百分比与对照组相比元明显变化。 结 论 ,(当少量白色念珠菌侵入口腔早期，口腔上皮细胞可对白色念珠菌发生吞入作用; ,(白色念珠菌菌丝可穿透上皮细胞表面侵入到细胞内，入侵的白色念珠菌胞壁可发生溶解破碎; ,(上皮细胞分泌不同细胞因子的机制不同，通过不同绞奖泶铮?,(，,一,、,,,一吐与局部白色念珠菌感染、防御密切相关，起着十分重要的作用; ,(口腔上皮细胞是黏膜白色念珠菌感染时黏膜局部细胞因子的来源之 ,(白色念珠菌可引起细胞周期改变，且有赖于其毒性及对细胞的感染。 关键词 白色念珠菌;口腔上 皮细胞;自细胞介素一,;肿瘤坏死因子一,【;细胞周期 ?,?,:—苎塞笙董垫要(一二, ，,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,, ,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ;,,, ,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,, ;,,,,,,, ,,,,, ,, ,,;,,,〕,,,,,,,,,,;,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ;,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,,，, ,,,,,,,,; ,,,,,,(,,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,;,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,,,,,(,;;,,,,,,,,，;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,;,,, ,,,,,, ,(,,,,,,,, ,,,,;,,,,,(,,,;, ,,;,,, ,,,,,;, , ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,(,, ;,,,, , ,,,,,,,,, ,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,;,,,—,,,,,,, ,,, ,,,;, ,(,,,,;,,, ,, ;,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,;,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,,, , ;,,,,,,,,，,, ,,,,,, , ,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,。,,,,,,,,( ,,,, ,,,,,,, ,,;,,,,,,, ,,,,,,, ,,;,,,, ;,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,,—,,,,,(,,,,,,,, ;,,,—,,,,,,,, ,,,,,,,,(,,，),, ;,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,,;,,,, ,,,,,, ,,,,,,,; 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