【doc】柑桔类水果及其果汁中D—异柠檬酸的酶法测定

【doc】柑桔类水果及其果汁中D—异柠檬酸的酶法测定 柑桔类水果及其果汁中D—异柠檬酸的酶 法测定 f1啡} 南18巷第l期营养\ l996年3月ACTANUTRIMENTASINICAMar..1996 柑桔类水果及其果汁中D,异柠 檬酸的酶法测定 三/ 袜黧轩学]00094)/'~//f;(北京农五=_i品年辛学i_币j; 提要本文报告7异柠檬酸脱氢酶测定柑桔类爿<罢及其黑汁申D一异柠檬酸 的方法.先用碱末解法或沉淀法处理样品,以D一异柠檬酸脱氢酶和NADP与之反 应,在340nm处测定反应系统中生成的NADPH的量,印相当于D一异柠檬酸的 量.在0.026~J..041mmol/L含量范围内,有良好的线性关系和相关系数;Y= 一 0.042+0.0508X,r=0.9910,变异系数(CV)为0.9%,2.6,回收率为94.6% , g7.3.本法准确,简单,快速,且专一性强,刁:受其他杂质干扰. 关?词,酶涪分折异拧檬鞋脱氲酶D一异拧檬随柑桔冀承果果汁 水果及其加工品含有丰富的有机酸,它 是影响其风味的重要成分.它能促进食欲, 帮助消化,益于健康….各种水果的有机酸 种类及含量是不同的,甚至有些差别很 大,其中具旋光活性的有机酸,只存在于天 然水果及食物中.有机酸的分析不但对水果 及其加工品的品评有一定意义,而且测定具 旋光活性的有机酸含量可以鉴别果汁饮料掺 假与否【. 测定有机酸的方法有化学滴定法,纸层 析法,气相色谱法,液相色谱法等j,近年 来不断有文献报道采用高效液相色谱(HP— LC)直接分析【".但这些方法一般是测定 消旋有机酸,不能用于具旋光活性有机酸的 分析.Doner['等曾用HPLC法对L一苹果 酸和D一苹果酸进行分离测定,但所用层析 柱以及流动相是自己制备的具旋光活性物 质.酶法分析具有专一,快速,灵敏的特 性,是分析具旋光活性物质的重要手段 He1111igerl等用酶法测定葡萄酒中的L一柠 檬酸,Bergner—Lang【等用酶法测定了橙汁 中D一异柠檬酸,以鉴定果汁掺伪,国内尚 未见有关报导.本文研究了异柠檬酸脱氢酶 (ICDH)测定水果中D一异柠檬酸的方法,并. 测定了我国柑桔类水果及其果汁中D一异柠 檬酸,为果汁掺伪鉴定提供有效的方法. 1材料和方法 1.1仪器紫外分光光度计(uV一120-02 型,岛津,日本),自动撒量进样器(Gil— son,法国),PH计(HM-20E型,TOA 日本),离心机(LxJ一64一O1型,北京医疗 盘,l931年生.教授.车课题经费由垒罾食品工 业标准化拉术委员舍贲肋 北京营养碌研究所 汀 强 柠 l期韩雅珊,崔雨林.柑桔娄水果及其果计中D一异柠檬酸的酶挂测定121 仪器修配厂),电热恒温水浴锅(H.H—S 2卜4型,北京长安科学仪器厂)等 1.2试剂 1.2.1异柠檬酸脱氢酶复台试剂盒(Boe- ringerM1t11.1"1heimCo.),置冰箱中保 存,临用前移至20,25?处.其中有: 瓶1.含p}37.1咪唑缓冲液及稳定剂共 30ml. 瓶2.含NADP45mg,硫酸镁10mg, 冻干粉60mg,临用前用瓶1全部溶液溶解, 即溶液A. 瓶3.含2mg异柠檬酸脱氢酶(ICDH EC.1.1.1.42)活性为5U的冻干粉,临用 前用1.8ral重蒸馏水溶解,即溶液B. 1.2.24mol/L盐酸,lmol/L盐酸,4moI/ L氢氧化钠,2mol/L氢氧化钠,25%氢氧 化铵,丙酮,30过氧化氢,25%氯化钡, 0.2mo1/LpH7.0Tris缓冲液,7.1%硫酸 钠,活性炭,D一异柠檬酸(Fluka). 1.5实验材料市售柑桔类水果,自制果 汁及几种国内外果汁饮料. 1.4标准溶液的制备精确称取20.0mg D一异柠檬酸置50ml容量瓶中,用重蒸馏水溶 解,并定容至刻度,配成1.041mmol/LD一 异柠檬酸标准液. 1.5样品溶液的制备测定样品中总D一异 柠檬酸含量时,应用碱水解法或沉淀法进行 处理,使酯化及内酯化的有机酸全部转化为 游离的有机酸. 1.5.1碱水解法:取25raI样品溶液 (约含D—异柠檬酸1.5~25mg)置三角瓶 中,以2mol/L氢氧化钠将样品溶液调节至 pH9.5,1O.5,加入0.01ml30H2O2,沸水 浴中加热20rain,随时检查并加入2tool/L氢 氧化钠使pH保持在9.5,1O.5.在上述条件 下,样品中结合态的D一异柠檬酸酯或内酯 全部水解成游离态.冷却后,以lmol/L盐酸 调节至pH7.0,将样液移入50ml容量瓶中, 定容,棍匀.再例入盛有1.0g活性炭的三角 瓶中,搅拌lmin进行脱色,过滤,待测. 1.5.2沉淀法f,:吸取10ml果汁(约 含D一异柠檬酸0.05~25mg)置100ml离心 管中,]/~4mol/L氢氧化钠5.0mI,混匀,在 室温下放置10rain,依砍加入4moI/L盐酸 5.0m1,25%氢氧化铵2.0ml,30氯化钡 溶液3.0m1和丙酮20ml,混匀,放置10min 在4000r/mln下离t~,5min,弃去上请液,在 沉淀中加7.1硫酸钠溶液20ml,搅拌,同 时在沸水浴中加热10min,使其溶解,冷却 后,将溶液移至50ml容量瓶中,用0.1mol/L pH7.0Tris缓冲溶液定容.将溶液倒入盛有 1gN性发的三角瓶中,搅拌,静置5min进行 脱色,过滤,待测. 1.6测定为使酶反应充分进行,需在2O , 25?下测定:,. 取石英比色杯,依次加入1.00mI溶液 A,1.00ml重蒸馏水,1.00mI样品溶液, 用塑制搅拌棒混匀,3min后,测定340rim处 样品溶液的吸光窿(A),然后加0.05ml溶 液B(~IIICDH液),嗣塑制搅拌棒混匀,准确 时间,10min钟后,测定340nm处样品 溶液的吸光度(A2).对照试验中加1.0ml重 蒸馏水取代样品溶液.求出吸光度变化?A} ?A=(A—A1)样品一(A—A1)对腻 1.7计算按下列公式计算,以gllrno1/L 示样品中的D一异柠檬酸含量(c) V×F×1000 ..C而A 式中:V——比色杯中最终体积3.05ml, v——比色杯中样品体积mI,F——样品溶 液的稀释倍数,d——比色杯的光径lcm, ,——NADPH的消光系数340nm时为 9.3mnlo卜cm?L一I,1. 2结果与讨论 2.1祥品前处理方法的选择水幂及其加 营养18卷 工品中的D一异柠檬酸除游离态外,还以酯 或内酯的结合态形式存在,测总量时,应用 碱水解法或沉淀法处理样品. 2.1.1碱水解法中pH对水解的影响方法 见1.5.1.为了选择水解适宜的pH,实验用 2mol/L氢氧化钠分别将样品溶液的pH调节 到7.0,9?0,10.0,11.0,12.0,14.0,考 察碱水解最适pH范围,结果如图1.可见pH 对D一异柠檬酸酯或内酯的水解具有较大的 影响,当pH<9.5时'水解不彻底,测定结果 偏低.当pH>10.5时,样品溶液易发生颜 色变化而干扰测定,结果也偏低.而pH9.5 , 10.5时,水解较彻底,又无颜色变化,所 测结果比较一致.因此,用碱水解法时,应 将样品溶液的pH调至10.O左右.碱水解法 操作简便,节省时间,适合测定D一异柠檬 酸含量较高的样品 目0.521 0.416 .10312 —0.208 00.104 2.1.2沉淀法方法见1.5.2.先用碱处理 使结合态D-异柠檬酸变成游离态,加钡盐使 之沉淀,再加入硫酸钠溶液使之溶解Tris 缓冲液中的EDTA可与Cu",Fe,Fe 等形成络合物,既可排除干扰,又避免了 样品溶液的颜色变化.而且对D一异柠檬酸 具有间接的浓缩作用.因此,当样品中D一 异柠檬酸含量较低时,宜用沉淀法,它适合 于果汁中D一异柠檬酸的测定,其结果与最 近报道相似!. 2.2酶反应动力学研究 2.2.1酶反应时间进程的测定实验对酶 反应的时间进程进行了测定,结果可见图 2.加酶液后12rain内为一级反应.为准 确测定计算实验定10rain为测定酶反应的时 间. 2.2.2温度对测定酶反应的影响实验用 ]8,2O?.24,25?,28,30?温度对酶反应 的影响进行了对比.结果如表1所示,在不 同温度条件下,对照和样品的A和At值 虽有一定差异,但吸光度的变化(?A)则 非常接近,其测定结果也很相近.可见在一 定范围内温度影响不大,因此,在室温条件 下,可进行样品的测定.但为了得到准确的 结果,实验仍采用20,25?为宜【,. 2.2.3干扰因素的研究据Boehringer:,】 的报告,某些离子如Fe,Fe和SO32-等 即使在低浓度也能抑制ICDH的反应.实验 用浓度为o.Ol4mmol/L的铁离子溶液和浓 度为0.875mmol/L的SOs2-溶液,取代重蒸 Time(mi【1) Fig.2TimeCOurseofICDH fororangejulce llOOOO ^qvd.【j?日o?H4日U =! n a HhH.叫 pfO O.? nD ? O 1期韩雅瑷,崔雨林.柑桔娄水果及其果针中D一异柠檬致的酵法测定123 CKIb1ank-s1lta~geri;lejulce~s2Iorangejeice 0.521 O.?16 0.312 Io115 Fig.5Effectofs0Trioionson deterrninationofD—i,0citricacid 馏水加到反应液中按测定步骤进行测定.结 果如图3所示,加铁盐时,吸光度(A) 明显增大,严重影响测定,测定结果比对照 下降31,35.铁离子在较高浓度时,引起 混浊而影响透光度加亚硫酸盐时,测定结 果降低32,是因为亚硫酸盐较高浓度时, 会使NADPH分解.故酶反应尽量避免接触 Fee,Fe2和SOs2一等离子. 2.5标准曲线和线性范围经回归分析得 标准曲线方程为lY一0?042+0?0508X, 相关系数r=0.9910.可见,D一异柠檬酸 在0.026,1.041mmol/L浓度范围内与相应 的?A有良好的线性关系. 2.4精密度,重复性和回收率试验 取同一样品的两份不同量(即0.5mI和 1.ora1)进行测定,吸光度变化(AA)同 取样量成正比,计算所得结果也非常相近. 用纯桔子汁作五次重复实验,经统计分析, 自制蜜柑汁(NJII)中的D一异柠檬酸平均 含量为0.377mmo]/L,标准差=0.69,变 异系数CV=0.90,精密度和重复性均符 台实验要求.回收率在94.6,97.3之间. Table2ContentofD—isocitricacidofcitrusanditsjuiees(retool/L) Note:一Notdetectable ^-1\一0鲁目vP1uqJ】一,^一_}0Pq0u l24营葬学摄 2.S柑桔娄样品及市售果汁中D一异柠檬酸 含量的测定结果 实验对若干柑桔类水果及其果汁进行测 定,结果(表2)可见,柑桔类水果及果汁 (样品2,9)的D一异柠檬酸含量有较大的差 异,其范围为0.354,O.725mmol/L,而有 些市售柑桔汁(样品10)的D一异柠檬酸含 量较低,说明已被大量稀释,此外,有些果汁 (样品11,14)中完全不存在D一异柠檬酸, 说明它们完全是人工配制的.有关用ICDH 法作为鉴定果汁品质及掺伪的研究工作正在 进行之中. (北葺(农韭大学食品科学累钟幕志蠹排了部舟实驰) 参考文献 1李金旭.高效液相色谱法测定果酸.分析化 学1993.21(8):878 2杜朋编译.果蔬汁饮料工艺学笫2章.果 蔬职料基础.北京:农业出版,1992.10 8小原哲三郎等.食品分析,,',,夕: 有机酸0分离定量.乐京:建席社,1982. 867 4Do?erLW.CavenderPJ.Ch:rE.1 L[quidChromatographyforResol— vlngMalicAcidEnastomersin Adu1teratedAPPle],:ice.,』,ovd 18卷 ri1988,55(6):1898 5Hen13igerG.M~scaroL.Enzyma— tic—u1travloletDeterminatlonofL- citricAc|dinWine:Co1labora- t;veStudy.,dssocoffAnalChem 1985-e8(5)一l02d 8Bergner—LangB.NeueErgehnisse zuIBestimmungderlsoclttonen!a— LL7einZtrusfrucheen.DJL1977, 75(7)t81l 7BoehringerMannheimGmbH.Me— thodsofBiochemicalAnalysisand FoodAnaIyslsD—isoeitricacid.Bo— ehringerMannheimGmbHBioche— micaGermany.1989.74 8FssgHngD.Frucht—tindGe11111sfis8 teEnzymatischeBestlmmungdes Geha1tesanD—i2ocitronensaure0p— ektra1photometrlscheBestimmung YonNADPH.EuropalscheN0rm{ l993.1189 9张利奋箱译国际饮料分析方沾,二十i? D一异柠橡酸的测定.北京,巾日轻工业出 版社.1992.124 1OG.G.吉船鲍特(美).酶法分析手册?海: 科学技术出版社,1983.405 DETERIv{lNATlONOFD—ISOClTRATElORANGEAND lTSJUICEBYENZYMATICMETHOD HanYashaa (Depatmento/FoodScience,BeijinoAgricufr8IUm'versify,Beg1000941 Thedetermina"0n0fchira1[j—iSOCitrateCallbeusedtoeYa1uatethe qualityoforangesjuicesanditsadulteration.Aenzymaticmethodhas beendeve1opedforthedeterminatioi1ofchira1D-iSOCitricasidinoraages anditsjuices.Sampleswerehydrolyzedby2toolNaOHbymaintainingthe solutioaatpI-[9.5"10.5inaboilingwaterbathfor20rain.D-isocitricacid wasoxidativelydecarboxylatedbyNADPtoNADPHinthepresenceof isoeitratedehydrogenase.TheaIItOUatofNADPHwasstoichiometricwith 1勰韩雅珊,丰末.'话娄东果爰其果汁中D一昴柠檬酸的酶法耐定125 thcafllOu,t(JfI)一is(),:1aI.e.t】leabsvrb0】cofADP!wasdeteFITIinedat 34011m.ThecurYe\,Hs1iI1(&iItherangeof0.026—1.041mmolL,Y,0042 4-0.0508X.Corre1,tioLcoefficie"tii,11(icoefficient.fv8riation(CF)werer= 0.9910and0.9%一2.6respectively.TherecovcryratewaS94-6一97?3?It WSSaspec~fic.SmpleandFaPidirlethodfortheanalysisofD—isocitratein fr'ait.!hec0ntentsOfD—sOcitricacidlnSeveralvarieticsoforangejLtice weredeter~l!ined. KeyWords:enzymaticanalysismetkedisocitratedehydrogenase(ICDH) D—isocitrieacIdcitrusfruits0rangeJuiees 收稿日期:1995—0卜05 全国第八期营养知识更新班圆满结业 受中国营养学会委托.由江苏省营养学会承办的第八期营养知识更新班~1995年 lO月27日-.~11月5日 在南京压科大学举行.更新班营养生钉化学为主题,并结台当前营养与食品工怍实 际,适当增加了 一 些有关保健食品的内容.特邀了我国老一辈生物化学,营养学界的先驱者,96岁高龄的郑集教授亲自莅 班传道授业.中国营养学会两位刮理事长顾=孽}范,赵法扳教授也专程来宁讲课-率次更新班还彳!}到丁江苏 省生化学会的大力支持,推选了中国药科大学着名专家吴梧桐等教授进行教学其他备超名学者也分别讲 授了各自特长的专题,保证了教学的商质量.14次专题讲座是: 1.南京大学教授郑集营养生物化学概论2.第二军医大学教授赵法|旺分子生物学与营养医 究3.中国药科大学教授吴梧桐蛋白质的生理功骺与营养价值研究进展4.南京医科大学第一附属研 院副主任医师刘尧芬雅代谢紊乱,糖尿病发病机理与骑治5.南京铁道医学院教授魏涌脂质代谢有 关疫病6.南京铁道医学院教授魏涌维生素的生化与营养及有关新知识7.苏州消化疾病与营养研究 中心主任郑家驹钙,磷代谢及生物利用率;8.南京医科大学教授范振青硒代谢与人体健康I9.南 京医科大学教授马凤楼国内外保健食昆概况;11.军事医学科学院教授顾景范降脂食品的研究I12. 南京农业大学教授江议湖腰歧杆菌与微生态;13.南京师范大学教授唐梓进活性初乳素的营养与生 物化学,14.江苏省卫生防疫站主任医师周树南国内保健食品发展撬况与功能性指标评价 邦老为首的各位授课老师都作了充分准备,牧集最新资料编写教材,认真讲课,收到了非常好的教 学效果.到班学员d6人,其中医院3O人,学校8人,防疫站6人,研究所2人,他们上课均能专心听讲, 作好笔记,课后提问,索印有关文献,表现了很高的学习热情与主动性.休息日还联 系医院参观观摩交 流,有的同志还利用空隙时阃瞻仰雨花台烈士陵园和南京大屠茉纪念馆,自觉接受传统教育和爱国主义教 育.这种可贵的精神面貌的唤发,与却浆教授教书育人,言传身教的崇高思想及安贫乐道,献身敬业精神 的感召是士}不开的.学员在小结时均表示在郑老光辉形象对照下,要重新考虑自己人生观,衡量人生的价 值,明确自己今后的努力方向与奋斗目标.情绪之高昂,相互感染之激烈,远远超过了这次更新斑的培养 目标与预期效果.真是实现了思想业务腰丰收,最后认真进行了个人和更新班的小结,在全面系统复习的 基础上,进行考试,颁发了中国科梆继续教育的结业证书. (江苏省营养学会)