过氧化物酶活性的测定

过氧化物酶活性的测定 实验六:过氧化物酶活性的测定 左哥 一、实验目的: 过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酶类物质代谢，植物抗性密切相关。通过实验掌握提取POD和测定其活性方法和原理。 二、实验原理: 过氧化物酶催化H2O2氧化酶类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深产物。本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，次产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸收光度变化得知过氧化物酶的活性。 三、材料与试剂 材料:马铃薯 试剂:20m mol/L KH2PO4,反应混合液 四、方法步骤: 1、 酶液制备:称取材料1.079g，加入20m mol/L KH2PO4 5ml,于研钵中研磨成匀浆，在 3000r/min，下离心10min,上清液转入25ml,容量瓶，残渣再用5ml, KH2PO4,提取一次， 定容，混匀，贮于冷凉处备用。 2、 比色测定:光径1cm比色杯两只，1只先加1ml KH2PO4，再加3ml混合液作参比液; 另一只加1ml,酶液，3ml混合液，立即计时并置于分光光度计中，在470nm下测定光密 度，每隔1min读数一次，连续测8min，每次测定前重新对照校准。 五、实验结果 时间(min): 1 2 3 4 5 6 7 8 光密度: 0.232 0.385 0.534 0.670 0.798 0.923 1.038 1.154 酶活力(0.01 A470/L)=(A2-A1)/0.01(t2-t1)*(V2/V1) =328.2μ 酶的比活力(μ/g)=酶活力/样品重 =304.2μ/g 实验七:种子生活力快速测定 一、实验目的: 种子生活力即种子发芽潜力，是鉴定种子力量研究种子储藏生理的重要指标，本实验运用TTC，红墨水发快速测定种子生活力。 二、实验原理: 1、TTC法:有生活力的种子呼吸作用产生的NADH能还原TTC，生产的红色的TPE，将胚染成红色，无生活力的种子，无呼吸代谢活动，不能还原TTC，肧不着色。 2、红墨水法:植物活细胞的原生质膜有选择透性，某些染料分子不能透过。如红墨水，因而不能将种肧染色，而死的种肧，其细胞膜结果破坏，选择透性丧失，因而染料分子能透过膜进入细胞将种肧染色。 三、材料和试剂: 材料:玉米种子 试剂:0.4%TTC，5%红墨水 四、方法和步骤: 1、取吸胀玉米种子25粒，用刀片沿种子胚的中心线纵切为两半，各置一半与烧杯。 2、将其中一烧杯加入0.4%TTC(以淹没种子为度)，然后置于30度很温箱中30分钟，观察种肧着色情况。 3、将其中另一烧杯加入5%红墨水(以淹没种子为度)，5分钟，倒去红墨水，用自来水清洗多次，直至种子表面无燃料为止。观察记录种子染色情况。 五、实验结果: 染料 染色情况 结果分析 0.4%TTC 21粒肧染成红色 4粒肧未被染色 活:21，死:4 5%红墨水 4粒肧染成红色 21粒肧未被染色 活:21，死:4 种子生活力=活种子数/测定种子数 =21/25 =84%