雄激素对骨骼肌萎缩大鼠泛素连接酶的调控作用研究

雄激素对骨骼肌萎缩大鼠泛素连接酶的调控作用研究 雄激素对骨骼肌萎缩大鼠泛素连接酶的调 控作用研究 解放军医学杂志2007年4月第32卷第4期MedJChinPIAVolrj! 雄激素对骨骼肌萎缩大鼠泛素连接酶的调控作用研究 尹会男柴家科张瑾韩翠华中传安吴焱秋陶白江刘东兴 ?337? 【摘要】目的研究睾酮对地塞米松所致大鼠骨骼肌萎缩的治疗作用以及对泛素连接酶表达的影响.方法4O只雌性SD大 鼠随机均分为对照组,地塞米松组,睾酮组,睾酮+地塞米松组,留取血浆和腓肠肌标本,采用图像采集和处理系统测量肌纤维横断面 面积(CSA),定量PCR检测基因表达,放射免疫法检测睾酮含量.结果地塞米松可使腓肠肌中两种泛素连接酶MAFbx和MuRF1 的基因表达均明显增高(P<O.01或0.05),睾酮对这两种基因的表达均无明显作用,但可明显减轻地塞米松引起的肌纤维CSA减小 (P<O.01).结论睾酮可减轻地塞米松引起的大鼠骨骼肌萎缩,其治疗作用可能并不是通过调控泛素连接酶MAFbx与MuRF1来 实现的. 【关键词】雄激素;糖皮质激素;肌肉;泛素;iS接酶 【中国图书资料分类号1R644 Modulatingeffectofandro~nonubiquitinligasesinaratmodelofskeletalmuscleatrophy YinHuinan,ChaiJiake,ZhangJin,eta1.BurnsInstitute,FirstAffiliatedHospital,GeneralHo spitalofPLA, Beijing100037,China [Abstract]ObjectiveTostudytheeffectoftestosteroneonskeletalmuscleatrophyofratsindu cedbydexamethasone,andtoex- ploretherelationshipbetweenandrogenandubiquitinligaseexpressioninskeletalmuscle.M ethodsFortyfemaleSDratswererandomly dividedintofourgroup:controlgroup(CON),dexamethasonegroup(DEX),testosteronegroup(TES)andtestosteroneplusdexametha— Sonegroup(TES+DEX).Bloodsampleswerecollectedfromtheabdominalaortaandthencentrifuged.Thesupernatantwascollectedand storedat20?.Gastrocnemluswasremovedandstoredat8O?.Thecross-sectionalarea(CS A)ofmusclefiberwasdeterminedby microscopicimagesofdigitizedmusclesections.usingacomputer.basedimagingprocessingsystem.TheexpressionofmuscleatrophyF- box(MAFbX)andmuscleRINGfinger-1(MttRF1)mRNAinskeletalmusclewasdeterminedbyreal-timePCR.Theexpressionoftestos— teroneproteininserulTlwasdeterminedbyimmunoradiometry.ResultsDexamethasoneincreasedtheexpressionofMAFbxandMuRF1 mRNAinskeletalmuscle(P<0.01orP<O.05).TestosteroneshowednoinfluencetotheexpressionofMAFbXandMuRF1mRNAin bothCONandDEXgroups,butmayobviouslyattenuatethedecreaseofmusclefiberCSAcausedbydexamethasone(P<O.01).Condu- sionTestosteronemayattenuatemuscleatrophyinducedbydexamethasoneinrats,butubiquitinligases,MAFbxandMuRF1inskeletal musclemaynotbeinvolvedinthisprocess. [Keywordslandrogen;glucocorticoid;muscle;ubiquitin;ligase 糖皮质激素是一种促分解代谢激素.多种病理状 态如严重烧创伤,脓毒症,尿毒症,酸中毒等均可引起 体内糖皮质激素大量释放并导致骨骼肌萎缩.雄激素 是一种促合成代谢激素,可部分拮抗糖皮质激素引起 的大鼠骨骼肌萎缩口J,但其尚不清楚.目前认为, 糖皮质激素引起的骨骼肌萎缩至少是部分通过活化蛋 白分解代谢途径一泛素一蛋白酶体途径实现的.新 近研究表明,地塞米松可使培养的肌管萎缩,同时伴有 泛素一蛋白酶体途径的组成成分一——两种泛素连接酶 MAFbx(muscleatrophyF-box)与MuRF1(muscle RINGfinger-1)基因表达的上调_2J,并且在骨骼肌萎 缩模型中这两种连接酶的表达也增高_4],提示这两种 酶在泛素一蛋白酶体途径活化引起的骨骼肌蛋白降解 过程中可能起重要作用.本研究以糖皮质激素所致骨 骼肌萎缩大鼠为模型,研究了睾酮对骨骼肌萎缩的治 疗作用及对MAFbx与MuRF1表达的影响. 1与方法 1.1动物模型的建立及分组雌性SD大鼠4O只,购 自中国医学科学院实验动物研究所,体重190~200g, 购进后单笼适应性饲养1周以上,室温维持在22?. 睾酮溶于芝麻油中(5mg/m1),地塞米松溶于0.9氯 化钠注射液中(1mg/m1).大鼠随机分为4组:对照组 (n一10)于前肢皮下注射香油lml/kg,每日1次,3天后 在继续注射香油的同时腹腔注射生理盐水lml/kg,每 日1次,注射1O天;地塞米松组(r/=10)于前肢皮下注 射香油每日1次,3天后在继续注射香油的同时腹腔注 射地塞米松lmg/kg,每日1次,注射1O天;睾酮组(n一 10)于前肢皮下注射睾酮5mg/kg,每日1次,3天后在 继续注射睾酮的同时腹腔注射生理盐水每日1次,注 【作者简介】尹会男,医学硕士,住院医师.主要从事烧伤代谢与营养 方面的研究.已发表1O余篇 【作者单位】100037北京解放军总医院第一附属医院烧伤研究所 (尹会男,柴家科,申传安,吴焱秋),核医学科(张瑾,韩翠华);第二炮兵 总医院烧伤科(陶白江,刘东兴) 【通讯作者】柴家科,E-mml:qk304@sohu.tom 【基金项目】国家自然科学基金资助项目(30571919);北京市自然科学 基金资助项目(7072077) ?338?解放军医学杂志2007年4月第32卷第4期MedJChinPIAVol32No4April2007 射10天;睾酮+地塞米松组(n一10)于前肢皮下注射睾 酮5mg/kg,每日1次,3天后在继续注射睾酮的同时腹 腔注射地塞米松ling/kg,每日1次,注射10天.动物 每日注射前称重.末次注射后24h麻醉处死动物,腹 主动脉取血,离心留取上层血浆,--20?保存.分离大 鼠左侧腓肠肌标本,称重,置于液氮中冷冻,再移至 一 80?保存,用于生化分析.分离大鼠右侧腓肠肌标 本,称重,于自然伸展位放入液氮冷冻的异戊烷中迅速 冷冻,然后移至一80?冰箱冻存,用于组织化学分析. 1.2主要试剂与器材试剂:睾酮,地塞米松(Sigma 公司),Trizol,反转录试剂盒(Promega公司),SYBR GreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems公司),睾 酮放射免疫试剂盒(北京赛驰公司),显微镜及其图像 采集系统(Olympus公司),7500FastReal—TimePCR System(AppliedBiosystems公司),高速低温台式离心 机(Beckman公司),高速匀浆机(Heidolph公司),DU- 800紫外可见分光光度计(Beckman公司).引物由北 京赛百盛基因技术公司合成. 1.3骨骼肌肌纤维横断面面积计算在恒温冷冻切 片机中取腓肠肌的中部进行切片,片厚10#m,HE染 色,采用显微镜及其图像采集系统进行图像收集,用图 像处理系统在每块肌肉中测量200~300个肌纤维的 横断面积,取平均值. 1.4定量PCRTrizol一步法提取总RNA,以与 ?的比值表示其纯度,控制比值在1.8,2.0.使用反 转录试剂盒在20#1的反应体系中进行反转录.每个反 应体系含RNAl#g.定量PCR引物序列如下:MAFbx: 正义5,C(?AGGAGAAGTC~ATCTATGTT一3,反 义5,_aCCCCCAAAr(AGTA一3;MuI1:正义 5'-TGACCAAGGAAAACA:ACCAG3,反艾5'-CT— CA[?rCT0CAGG一3;磷酸甘油醛脱 氢酶(GAPDH):正义5'-TGCACCACCAACTGCTTA一 3,反义5'-GGAGGGATGAFGTTC一3.PCR采 用20#1反应体系,包括10#12×SYBRGreenPCR MasterMix,上游及下游引物各500nmol/L(终浓度), 50ngcDNA.PCR条件:94.C变性2mira94.C变性30s, 6O?退火40s,4O个循环.PCR结束后进行解离曲线 分析以确定PCR的特异性.以GAPDH作为内参. 每份样品进行2次PCR实验. 1.5放射免疫学分析采用放射免疫试剂盒检测血 浆睾酮浓度.试剂盒在95可信区间的最小检测浓度 为0.02ng/ml. 1.6统计学处理数据以_i?5表示,采用SPSS11.0 软件包进行方差分析. 2结果 腓肠肌肌纤维横断面面积睾酮组(1157.8? 91.2#mz)明显高于对照组(949.9?45.7#m2,P< 0.01),对照组高于睾酮+地塞米松组(882.8? 54.2m2,P<0.05)和地塞米松组(812.6?44.5, P<0.01),而睾酮+地塞米松组与地塞米松组相比高 8.6%(P<O.05). 肌肉中MAFbx,MuRF1基因的表达水平地塞米 松组分别比对照组高52.6(P<0.01),34.2(P< 0.05),而睾酮组与对照组比较及睾酮+地塞米松组与 地塞米松组比较均无显着性差异. 血浆中睾酮浓度地塞米松组(0.165?0.112ng/ m1)与对照组(0.248?0.136ng/m1)比较无显着性差异, 而睾酮组(0.509?0.256ng/m1)较对照组高1.4倍(P< 0.05),睾酮+地塞米松组(0.521?0.284ng/m1)较地塞 米松组高2.2倍(P<0.05). 3讨论 本研究结果表明,lmg/(kg?d)地塞米松腹腔注射 10天后大鼠骨骼肌明显萎缩,而应用5mg/(kg?d)睾 酮13天可部分拮抗地塞米松引起的大鼠骨骼肌萎缩, 说明在该模型中雄激素(睾酮)有部分拮抗糖皮质激素 (地塞米松)引起的骨骼肌萎缩的作用. 根据收缩功能的不同,骨骼肌纤维分为慢肌和快 肌两种类型.研究显示,糖皮质激素对于快肌纤维的 致萎缩作用更为明显r..不同肌肉中两种肌纤维所 占比例不同,本研究选择的腓肠肌中快肌纤维约占 94%[7j,由于快肌纤维占绝大多数,因此在计算肌纤维 横断面面积时未对肌纤维类型进行区分. 泛素一蛋白酶体途径是一种高效的蛋白分解代谢 途径l_8,主要由泛素,泛素活化酶(E1),泛素偶联酶 (E2s),泛素连接酶(E3s),26S蛋白酶体,泛素再循环酶 组成,可以选择性地降解细胞内的蛋白.目前认为,泛 素一蛋白酶体途径活化后可引起骨骼肌的萎缩.在肌 肉萎缩时编码泛素一蛋白酶体途径不同成分的基因 mRNA水平增加,差异表达筛选研究发现在多种骨骼 肌萎缩模型的骨骼肌中MuRF1E叫和MAFbxu.j表达均 明显增高,提示这两种泛素连接酶在泛素一蛋白酶体途 径活化引起的骨骼肌蛋白降解过程中可能起重要作 用.糖皮质激素是目前发现的致萎缩作用最强的一种 激素,其致萎缩作用至少部分是通过活化泛素,蛋白酶 体途径实现的.本研究结果显示,睾酮可拮抗地塞米 松所致的大鼠骨骼肌萎缩,而地塞米松可使骨骼肌中 MAFbx和MuRF1表达上调,但无论是对正常的骨骼 肌,还是对地塞米松作用的骨骼肌,应用睾酮后这两种 酶的表达都没有明显变化.这说明睾酮能减轻地塞米 松所致的骨骼肌萎缩,但可能并不是通过对这两种泛 素连接酶进行调控实现的,其具体机制仍需要进一步 研究. 解放军医学杂志2007年4月第32卷第4期MedJChinPLAVol32No4April2007 【参考文献】 [1]F~sonJM,DoddSI,PowersSK.Useofanaboliesteroidstoattenu— atetheeffectsofglucocorticoidsontheratdiaphragr~PhysTher, 2003,83(1):29 [2]SandriM,SandriC,GilbertA,eta1.Foxotranscriptionfactorsin— ducetheatrophy-relatedubiquitinligaseatrogin-1andcauseskeletal muscleatrophy.Cell,2004,117(3):399 [3]StittTN,D~ujanD,ClarkeBA,eta1.TheIGF1/PI3K/Aktpath— waypreventsexpressionofmuscleatrophy-inducedubiquitinhgases byinhibitingF(?()transcriptionfactors.MolCeU,2004,14(3):395 [4]I.atresE,AminiAR,AminiAA,eta1.Insulin-likegrowthfactor-1 (IGF-1)inverselyregulatesatrophy-inducedgenesv/athephosphati dylinositol3——kinase/Akt/mammaliantargetofrapamydn(PI3K/Akt/ mT()R)pathway.JBiolChem,2005,280(4):2737 [5]Dekhu~zenPN,Gayan-RamirezG,BisschopA,eta1.Corticosteroid treatmentandnutritionaldeprivationcauseadifferentpatternofatro一 ? 短篇报道? phyinratdiaphragm.JApplPhysiol,1995,78(2):629 r6]LewisMI,MonnSA,SieckGCEffectofcorticosteroidsondia— phragmfatigue,SDHacti~ty,andmusclefibersize.JApplPhysiol, 1992,72(1):293 [7]DumasJF,SimardG,RousselD,eta1.MitochondriMenergyme— tabolisminamode1oftmdemutritionindueedbydexamethaSone.BrJ Nutr,2003,90(5):969 [8]HershkoA,CiechanoverA.Theubiquitinsystem.allnuRevBio— chem,1998,67:425 [9]BodineSC,I.atresE,BaumhueterS,eta1.Identificationofubiquitin ligasesrequiredforskeletdmuscleatrophy.Science,2001,294 (5547):1704 [1o]ComesMD,LeckerSH,JagoeRT,eta1.Atrogiwl,amuscle-spe- dficF-boxproteinhighlyexpressedduringmuscleatrophy.ProcNatl AcadSciUSA,2001,98(25):14440 (2006—12—08收稿2007—03-05修回) (责任编辑胡全兵) 过敏性肺曲霉菌病1例 【关键词】曲霉菌病,变应性支气管肺;老年人 【中国图书资料分类号】R563.9 1病例资料 张麒刘长庭 月后咯血症状消失,肺部阴影完全吸收. 患者男性,83岁,主因反复咳嗽,咯血15年,加重2月余于 2006年3月7日入院.1991年7月患者无诱因出现血丝痰,暗 红色,最多时每天7--8口,无胸痛,发热,盗汗,体重减轻等,行 多项检查未见明显异常,考虑慢性支气管炎所致,给予对症止血 治疗后血痰消失,此后先后6次现痰中带血,辅助检查均未见 异常,给予对症处理后症状缓解.2002年9月行胸部CT检查, 诊断为左下肺支气管扩张.2006年1月无明显诱因再次出现咯 血,为暗红色血痰,有时带小血凝块,每天3,4口,自服中药及 抗感染,止血药物后症状无好转,2月17日于我院就诊,给予利 复星治疗9天,咯血次数较前减少,但一直未能消除,每日均有 2,3口血痰,为进一步诊治收住院.既往有肺结核病史,已治 愈.入院后查外周血白细胞总数正常,嗜酸粒细胞水平正常;过 敏原检测示总IgE升高,对螨虫过敏I级;补体C363ling/L(正 常值850--1930mg/L),IgM179mg/L(正常值400--2300mg/ L),IgG6.44g/I(正常值7.O--16.Og/L),血中E水平正常. 胸片及胸部CT示双肺片状影,呈游走性,并可见支气管扩张. 双肺阴影变化大,入院时以左侧为主,后以右侧为主.入院后先 后给予多种抗生素,止血药等对症治疗,仍间断出现咯血症状, 肺部阴影一直存在,而后多次行痰涂片,痰培养等检查,因连续 两次痰培养可见曲霉菌,确诊为"过敏性肺曲霉菌性肺病".确 诊后,给予甲泼尼龙40mg/d,1周后改为泼尼松30mg/d口服,之 后每周减量5rng/d,直至停用,总疗程为49天;伊曲康唑0.25/d 静滴,1个月后改为0.1/d口服,直至停用,总疗程4个月.4个 2讨论 过敏性肺曲霉菌性肺病(ABPA)是一种因机体对烟曲菌 (Asp)产生免疫反应所致的支气管肺疾病.近来国外对其提出 了新的诊断,分为基本部分和次要(辅助)部分.基本部分 包括哮喘,针对Asp皮肤点刺试验(SPT),血清总IgE抗体水平 增高,血清Asp特异性E抗体水平>1000gg/L,胸部X线示肺 斑片浸润和中心性支气管扩张,次要(辅助)部分包括沉淀抗体 阳性和血清嗜酸细胞增多.ABPA的人群发病率目前国内尚无 报道.糖皮质激素仍是当前公认的治疗本病最有效的药物之 一 .免疫治疗无效,反可能使疾病恶化. 本例为老年男性,临床症状不典型,以痰中带血为主要症 状,存在肺斑片浸润影,为游走性,胸部CT证实支气管扩张,两 次痰真菌培养为曲霉菌,尽管无嗜酸细胞增多及血中IgE水平 增高,也可明确诊断为ABPA.由此可以看出,老年人由于全身 免疫力低下,易感染曲霉菌病,当肺部存在斑片状浸润影,应用 抗生素治疗无效,排除结核,军团菌,支原体等特殊感染的可能 性时,应考虑本病,并积极应用糖皮质激素治疗.本例患者应用 糖皮质激素的同时,加用伊曲康唑抗真菌治疗,效果较理想,应 用糖皮质激素49天,伊曲康唑4个月后咯血症状完全消失,复 查胸部CT肺浸润影完全吸收.但治疗同时,应注意糖皮质激 素及抗真菌药物副反应的发生. (2007-01—10收稿2007—03-09修回) (责任编辑胡全兵) 【作者单位】100853北京解放军总医院南楼呼吸科(张麒,刘长庭)