一个人类睾丸特异表达新基因

一个人类睾丸特异表达新基因 中南大学 博士学位论文一个人类睾丸特异表达新基因-septin 12 transcript variant 2 的克隆与功能初步研究 姓名:汪金荣 申请学位级别:博士 专业:泌尿外科 指导教师:蒋先镇 20070501博士学位论文 中文摘要 摘要 不育影响着大约,,,,,,的夫妻，不育的原因夫妻双方约各占一半。遗传因素是男性不育的一个重要因素，男性不育患者染色体检查常常发现有基因缺失、突变或易位。因此生精相关基因的研究对男性不育的诊断和治疗有着重要的意义。精子的发生是一个非常复杂而又受到精确调控的过程，分为有丝分裂阶段、减数分裂阶段和减数分裂后阶段，其中涉及一系列基因的调控，人类的研究表明有,,,,个以上的基因参与了生精过程，而参与这一过程的蛋白质更多。 随着人类基因组(,,,,, ,,,,,, ,,,,,;,，,,,)的实施和生物技术的飞速发展，人类基因组测序数据呈指数增长，各种生物数据库及其软件相应建立，极大地促进了生物信息学的发展。利用生物信息学克隆新基因和分析基因功能已成为生物信息学研究的热点，大量的新基因被克隆，其中包括不少生精相关基因。本课题尝试利用生物信息学寻找新的生精基因，并对其功能进行预测和初步研究，分析该基因在精子生成过程中的作用，有助于进一步了解精子发生的分子机制。 第一章:睾丸特异表达新基因的克隆 精子的生成是一个受多基因调控的过程，目前已发现一系列与精子发生相关的基因，但仍有许多未知基因涉及精子的发生，精子发生与调控的机制仍未阐明。利用生物信息学方法发现新基因是寻找新基因的一条捷径，我们尝试通过数据库消减杂交(,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,)方法发现一新的睾丸特异表达基因，并以,,—,,,实验验证。 以因特网,,,,,,,数据库的人类各组织;,,,文库为实验材料，以,,,软件为工具，比较人类睾丸组织和其它组织的;,,,文库，筛选出在睾丸组织中显著高表达并可能代表新基因的的克隆重叠群，将获得的克隆重叠群内的,,,(,,,,,,,,, ,,？,,,;, ,,曲进行同源搜索、拼接和延伸，得到一较长的新基因序列。根据新蛐蛄猩杓埔锝校校茫曳从ρ橹ば蛄衅唇邮欠裾芳靶禄虻恼媸敌浴?通过数据库消减杂交(,叻)，找到一个在睾丸组织;,,,文库和博士学位论文 中文摘要非睾丸组织;,,,文库中显著差异表达的克隆重叠群,,(,,,,,,，生物信息学分析显示其在睾丸组织中高表达。,,(,,,,,,重叠群包括,,条,,,，将,,,进行拼接、延伸后获得一个新的基因序列，长为,,,,,,，其中包含一个完整的阅读框架，长,,,, ,,，编码一,,,氨基酸的蛋白质，新基因有,,个外显子和,个内含子。,,,反应并测序证实新基因序列拼接正确，且在人类睾丸组织中表达。利用生物信息学克隆睾丸特异表达新基因是一种切实可行、高效的新方法，我们运用该方法成功地克隆了一个人类睾丸特异表达新基因，将新基因序列向,,,,,,,数据库提交并被收录，经人类基因命名委员会(,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,,)命名为:,,,,,, ,, ,,,,,;,,,,,,,,,,, ,，基因登陆号为:,,,,,,,,。 第二章 :新基因及其编码蛋白质的生物信息学分析 在对新基因(,,,,,, ,, ,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,)的功能进行研究前我们先利用网络上各种生物学软件，对新基因及其编码的蛋白质进行分析和预测，初步了解新基因的一些特性，为后继的研究提供指导。 利用,,,，的,,,,,程序对新基因及编码蛋白质进行同源性分析; 以,,,,, ,,,,, ,,？,,,;,,程序进行电子染色体定位;以,,,,,,,,(,(,软件分析新基因的酶切位点;运用,,,,, ，，软件预测蛋白质细胞内定位;运用,,,,,,网站的多个软件对新基因编码蛋白质的理化性质、跨膜区和信号肽序列、疏水性，功能位点进行分析和预测。 生物信息学分析显示新基因与,,,,,,家族多个成员的基因和蛋 白质序列有同源性，属于,,,,,,家族基因，该基因无,;,, ，、,,,，和,,,，酶切位点，基因定位于人类染色体,,,,,(,，其编码蛋白质 的氨基酸序列为,,,个，分子量为,,,,,,，等电点为,(,,。蛋白质细胞内定位:线粒体(可能性为,,(,,);胞浆(可能性为,,(,,)。 无明显跨膜序列和信号肽，推测为非分泌蛋白，有多个磷酸化位点和 其它翻译后修饰位点。 第三章:新基因功能的初步研究 基因研究的最终目的是了解其功能，我们进行了多组织,,,,,, ?博士学位论文 中文摘要 (,,,,,—,,,,,, ,,—,,,)、,,,,,,,,印迹杂交(,,,,,,,, ,,,,,)和原位杂交(,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,)实验，对新基因的组织表达谱和功能进行了初步研究，并构建了新基因的真核表达载体。 多组织,,—,,,和,,,,,,,,印迹杂交结果显示新基因在成年男性睾丸组织中高表达，在其它组织中不表达;胎儿除睾丸组织外，在其它少数组织中有微弱表达。新基因在成年睾丸组织中表达最强，在老年睾丸组织中表达减弱，在胎儿睾丸组织中低表达或不表达，在隐睾组织中不表达。新基因在睾丸组织中只表达一个转录本。睾丸组织的原位杂交结果与多组织,,,,,,和,,,,,,,,印迹杂交结果一致，原位杂交显示新基因主要在精原细胞和精母细胞中表达。 初步研究表明新基因为一睾丸特异表达基因，主要表达于睾丸的精原细胞和精母细胞，其表达与发育阶段有关。新基因的功能可能与精子发生相关，可能参与生精细胞的生长、发育和调亡的调控。结论:本研究利用生物信息学这一新策略成功克隆了一个人类睾丸特异表达新基因:,,,,,, ,, ,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,，并采用,,,,,,、,,,,,,,,印迹杂交和原位杂交实验对新基因的表达特征和功能进行初步研究。我们认为新基因在人类精子发生的过程中可能发挥着重要的作用，是一个生精相关基因，具有重要的生理功能。关键词: 生物信息学，电子克隆，数据库消减杂交，精子发生， 睾丸特异性表达基因 ，,， ,,,,,,;, ,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ,, ,,,,, , ,(, ,,,, ;,,,,,, ,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,埘,,, ,,,, ,, ,,,,(，,,, ,,,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,，,,,, ,,,,,,,,，,,,,,,,, ,, ,,,,,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,(硼,, ,,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,;,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,,, „ „ 。 一 ? 一 一一 一 ,,,, ;,,,,,;,,,, ,,,;,,, ,,,;, ,, ,,,,,,,,,,, ,, , ,,,;,,,,, ;,,,,,,,,,， ,,, ,,,,,,,,,,; 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,,,,,, ,)、,,,(,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,)和,,,,基因也与生精有关，其中,,,基因决定着男性的性征。在,染色体上的雄激素受体,,也与生精功能缺陷有关。 除性染色体外，在常染色体上也存在不少与精子发生和成熟调控相关的基因。崔英霞嘲等研究了一组少精子症患者，发现在,号、,号、,号、,号、,,号和,,号染色体上存在畸变。,号染色体上的,,,,,(,,, ,,,, ,,,,,,,,,)基因，,,号染色体上的,,,,,(,,,,,,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,, ,)基因和,,,(,,,,;,,, ,,;,,,)基因都与精子发生相关。一些罕见疾病也常伴有男性不育，如强直性营养不良(,,？)、范氏综合征(,,、,？、,,？)、努南氏综合征(,,？)等，可能这些位置有涉及精子发生的基因。 本课题尝试利用生物信息学方法寻找新的生精相关基因，并对其功能进行预测和初步研究，了解该基因在精子生成过程中的作用。博士学位论文 „实验 技术路线图 实验技术路线图 睾丸组织;,,,文库 其它组织;,,,文库 ,,,, , ,,,, , ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, 以,,,, ,:,,,, ,?,,作为筛选 数据分析，获得可能存在表达差异的基因片段 筛选出差异表达、代表新基因的克隆重叠群(,,(,,,,,,) 上 同源搜索，序列匹配，,,,拼接延伸，获得全长;,,, 上 厂—〕?——,———丁——〕 新基，天，;,,, ,;,验证新基 ,,,,,,,, ,,,,, 原位杂交研究 新基因真核表 序列与编码 因阅读框，多 确定组织表达 新基因在不同 达载体及绿色 蛋白的生物 组织,,,,,,分 及转录本大小 睾丸组织中表 荧光表达载体 信息学分析 析新基因组织 达及定位 的构建 表达谱 ?,?博士学位论文 第一章睾丸特异表达新基因的克隆 第一章睾丸特异表达新基因的克隆 人类基因组计划(,,,,, ,,,,,, ,,,,,;,，,,,)完成后，人类对基因的研 究进入了后基因组时代。后基因组时代的一个重要任务就是新基因的发现与鉴 定、基因功能注释。生物信息学的发展使得电子克隆(,, ,,,,;, ;,,,,,,)溉明 新基因成为可能，电子克隆是基于,,,分析克隆基因的新方法。 表达序列标签(,,,,,,,,, ,,？,,,;, ,,,，,,,)是随机选取的表达基因的 一段序列，一段,,,序列对应于某一基因;,,,序列的一部分。数据库中的,,, 序列覆盖了人类基因的,,,以上，其中包括大量未被发现的新基因信息，如何利 用这些信息发现新基因成为近年来的研究课题。本研究通过“数据库消减杂交一 (,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,)的方法，将人类睾丸组织;,,,数据库 与其它组织;,,,数据库进行比较，找出在两者显著差异表达的,,,序列，将得 到的,,,序列进行同源搜索、拼接、延伸，获得一新的人类睾丸特异表达基因， 并以实验验证其正确性。,材料和方法,(,材料与试剂 ,,蛆、,,,“，、,,,,斗,移液吸头(,,,头) ,(,,, ,,,,,,,,,管(,,管) 匀浆器、碾钵 分析纯无水乙醇,异丙醇,氯仿 焦碳酸二乙酯(,,,,) ,(,,,,,,乙二胺四乙酸(,,,,)，,,,(, ,(,,,,,, ,,,,(,,缓冲液，,,,(, ,,,,,电泳缓冲液 溴化乙啶(,,) 琼脂糖 ,, ,,,,,, ,,;,, ,, ,,,,,, ,,,,,混合液 ,,？ ,,,多聚酶 】,×,,, ,,,,,,博士学位论文 第一章睾丸特异表达新基因的克隆 ,, ,,,连接酶 ,,,抽提试剂,,，,,, ,,, ,,, , ,,, ,,,,,,(,,,,,,,,,):, , ,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,， ,,,，,,, ,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,(,,,,,,):,,,,，,,,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,， ,,,，,,,，,,, ,, ,,,连接酶为,,,,,,公司产品，,,,抽提试剂,,，,,,为瑞兴公司分装产.