[doc格式] 组织蛋白酶K与高血压性心脏病心室肌重塑及纤维化关系的初步探讨

组织蛋白酶K与高血压性心脏病心室肌重 塑及纤维化关系的初步探讨 中国临床医学2008年8月第15卷第4期ClinicalMedicalJournalofChina,2008.Vo1.15,No.4449 ? 论着 组织蛋白酶K与高血压性心脏病心室肌重塑 及纤维化关系的初步探讨 成宪武宋辉 关立克金 杨光赵萧萧秦孝智 海葛谷雅文室原莹明 井上爱子南勇善 奥村键二 摘要目的:探讨组织蛋白酶K(cathepsinK,CatK)在高血压性心脏病心室重塑发生发展中的达及其活性与02肌纤维化 的关系.方法:7周龄雄性Dahl盐敏感(DS)大鼠分别给予高负荷食盐(8)或正常负荷食盐(0.3)19周,建立高血压性心 脏病心衰(H—HF)模型和对照组(19W-C).另设人心肌活检标本作研究对象(H—HF患者10例和对照组6例).用Rrr_PCR 和免疫组化分别检测CatKmRNA及蛋白表达,酶谱法测定大鼠心肌 组织中的组织蛋白酶活性,027.2脏石蜡切片Azan染色法 分析左心室肌间质和血管周围纤维化程度,细胞荧光染色法分析白 介素一81(IL-fl1)对培养02肌细胞的CatK的表达及其胶原 蛋白分解能的影响.结果:H—HF组大鼠和患者心肌中的CatKmRNA 的表达显着高于19W—C组和对照组人(P<0.01). 免疫组化法和insitu法分析显示增高的CatKmRNA和蛋白主要表达 于心肌细胞.H—HF组大鼠心肌组织蛋白酶依赖性胶 原蛋白分解能显着高于19W-C组.H—HF组大鼠心肌中IL一81表 达也在显着增高.IL-I;1刺激0272肌细胞的CatK蛋白及其胶 原蛋白分解活性.02肌中的CatKmRNA表达与左心室肌纤维化面积 呈显着正相关(r=0.68,P<0.01).结论:在心肌中 CatK表达及分泌受IL-fll的调控,并参与高血压性心脏病的发生,发 展过程,提示心肌CatK在H—HF的心肌重塑及纤维化 发展中起重要作用. 关键词组织蛋白酶K;高血压性心脏病;心室肌重塑;白介素81 中图分类号R541.3文献标识码A TheExpressionandSignificanceofC0llagen0lyitcCathepsinKintheLeftVe ntricleRemodelingduringtheHypertensiveHeartFail- ureCHENGXianwu.SONGHuiYANGGuang!ZHAOXiaoxiaoQINXiaoziINOUEAikoNANYong— shan’GUANLikeJINHaiKUZUYAMasafumiMUR0HARAToyoakiOKU MURAKenji1.Department ofCardiology,NagoyaUniversitySchoolofMedicine,Aichiken,Nagoya466—8550,Japan;2.DepartmentCardiology, DepartmentofOperation,theAffiliatedHospital,YanbianUniversityMedicalSchool,JilinYanji133000,China AbstractObjective:Cardiacfibrosisischaracterizedbytisssueremodlingresultingfrom3nimbalancebetweensynthesisand degradationofextracellularriganicmatrics.Cathepsin(Cat)Khasbeenimplicatedinextracellularmatrixproteinsdegradation duringvarioustissueremodelingprocesses.TheaimsofthisstudyweretoinvestigatetheexpressionofCatKinleftventricular (LV)tissues.thecorrelationbetweenCatKexpressionandLVfibrosis,andthecontributionofCatKtocardiacmyocyte- meditedcollagendegradation.Methods:TheexpressionofCatKwasexaminedintheLVtissuesofratswithhypertensiveheart failure(H—HF)andcontrolrats.Results:Reversetranscriptionandreal—ti mepolymerasechainreactionanalysisrevealedthat 基金项目:2005~2006年度日本文部科学省科研基金 (17590719,X.W.C),第31届日本心脏财团优秀青 年科研奖励基金(26-007508,X.W.C),第3届日本 心脏财团-Novartic循环器分子细胞研究优秀青年科 研奖励基金(26-007523,X.W.C),2007年度日本 武田财团优秀青年科研奖励基金(26-007527,XWC) 作者单位:1.日本名古屋大学医学部循环器内科, 日本名古屋65466—8550;2.延边大学医院心血管 内科,手术室,吉林延吉133000 (第一作者简介:成宪武(1966年生),医学博士,日本 名古屋大学医学部循环器内科讲师兼延边大学医学 院心血管内科副教授,主要从事各种心室肌重构的 基础及临床研究工作.) theabundanceofCatKmRNAintheLVtissueswasgreaterin ratswithH—HFthanincontro1rats.Immunohistochemistry revealedthatCatKwaslocalizedpredominantlytocardiacmyo— cytes(CMCs)inH—HFrats.TheCatK—dependentcollagenolyt— icactivityinextractsoftheLVtissueswasmarkedlyincreasedin H—HFrats.ExpressionlevelsofCatKintheLVtissuesshowed3 highlysignificantpositivecorrelationwithLVfibrosisinH—HFrats (r=0.68.P<0.01).Theexpressionsofinterleukin(IL)一18was increasedintheLVtissueofH—HFrats.andthisinflammatorycyto— kinewasfoundtoincreasetheCatKmRNAexpressionandcol— lagenolyticcativityinculturedneonatalCMCs.Conelusion:Thesedata suggestthatCatKmaycontributetocontrolhypertension-induced IVremodelingandfibrosis.IL-I~appearstoregulateitsoverexpres— sioninCMCs. 450中国临床医学2008年8月第15卷第4期 KeyWordsCathepsinK;Hypertensiveheartdisease;Ventricularremodeling ;Interleukin18 左心室肌重塑(ventricularremodeling)是高血 压发生发展过程中一个必然的病理生理过程’. 许多研究一一表明通过改善心肌重塑可延缓或逆转 心肌纤维化进程,进一步达到远期保护心功能.参 与心肌重塑的因子包括细胞外基质蛋白酶及炎症因 子等一:.].有报道白介素(interleukin一1,IL一1) 可调控蛋白酶的分泌,在多种组织损伤后修复过程 中起重要作用.但在心肌重塑进程中IL—J31的作用 及其机制还不十分清楚. 组织蛋白酶K(CathepsinK,CatK)是木瓜蛋 白酶家族的一员,主要由巨噬细胞和破骨细胞分泌, 除能降解胶原蛋白外,还能降解弹力蛋白及纤维蛋 白,并在骨质重塑及纤维化中起极其重要作用一. 但迄今尚无有关CatK在心肌细胞的分泌及其与心 肌重塑和纤维化关系的报道.本研究探讨CatK与 Dahl盐敏感(DS)大鼠和人的高血压性心脏病心肌 重塑及纤维化的关系和其在心肌中的表达.同时也 探讨培养心肌细胞(CMCs)CatK表达的调节机制. 1资料与方法 1.1心衰(H—HF)模型建立7周雄性Dahl盐敏 感(DS)大鼠(Eisai,Tokyo,Japan)40只,体重 200~240g,随机分为H—HF组和对应同龄对照组 (每组2()只).按Saka等的方法,对7周龄DS 大鼠分别给予高负荷食盐(8)饲料和正常负荷食 盐(0.3)饲料19周,建立H—HF模型和同龄对照 组(19W—C).腹腔注射戊巴比妥钠(50mg?kg 体重),处死各观测终点的大鼠,并迅速从心房和右 室分离提取左室心肌.心肌组织用液氮速冻后放 人一70C冰箱(为作生化学分析)或用8甲醛固定 (为作组织学分析),其保存如文献j所述. 1.2人心肌组织活检标本2005年1月一2OO6年 12月住延边大学医院接受心肌活检检查的H—HF 患者.按常规法用6F心肌活检钳提取左心室组 织.所有患者均按临床表现及血液动力学和超声 心动图诊断来确诊.除外缺血性,瓣膜性,炎症 性,扩张性和酒精性心脏病.心肌组织保存法同上. H—HF组10例(年龄65.5?10.4岁),射血分数 (EF,39.9?7.1);对照组6例(年龄37.1?13.7 岁),EF(69.3?4.2),既往无心脏病史,来自心脏 移植手术供者心脏(与受者不配型). 1.3定量逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)采用 RNeasyProtectMini试剂盒(QIAGEN,美国),根 据说明书提取心肌组织总RNA.20ng总RNA进 行逆转录后,利用Prism7700(美国ABI公司)如文 献一所述完成定量PCR.PCR引物和探针[大鼠 CatsK,cystatinC(CystC),II一l31,I和III型胶 原和纤维蛋白]参考文献”.人CatK在Gen— Bank中的序列号分别为MN一000396;CatsKPCR 引物分别为:上游,5r_ATATGTGGGACAG— GAAGAGAGTTGT一3下游,5GGATCTCTCTG— TACCCTCTGCATTTA一3.用磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)做内参照. 1.4组织学检查Azan—Mallory染色法分析左心 室肌间质和血管周围纤维化程度.免疫组化法检测 心肌CatK蛋白表达Is2.阴性对照是正常兔免疫球 蛋白替代一次抗体. 1.5组织蛋白酶活性测定提取心肌组织蛋白并 测定蛋白浓度.用FITC荧光标记的I型胶原蛋白 检测心肌组织及培养心肌细胞的组织蛋白酶依赖性 胶原蛋白活性”. 1.6超声心动图检查戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 H—HF组和对照组(19周龄)大鼠,应用s(I)NOS 5500多谱勒超声诊断仪(美国菲立谱公司产)行心 脏超声心动图检查一,探头频率5,12MHz.测量 参数包括:室间隔厚度(IVST),左室后壁厚度 (LVPwT),舒张末期左室内径(LVEDd),左室缩 短率(LVFS),检测值取5个心动周期的平均值. 用带高性能压力感应器2F导管(SPR一407,美国咪 勒公司)测左室舒张末期压力(LVEDP). 1.7心肌细胞培养及培养细胞免疫荧光染色按 Spinale等的方法单离大鼠胎儿心肌细胞 (CMcs),培养在含有10牛血清的DMEM/F一12 中.在无牛血清DMEM/F一12培养液中培养12h 后,用IL—J31刺激24h,并行培养细胞免疫荧光染色 和培养心肌细胞的胶原蛋白活性测定[1”. 1.8统计学分析所有计量资料数据以均值?标 准误表示,组间比较行方差分析(AN()VA).相关分 析采用直线回归方法,所有分析过程均在StatView 统计软件上完成.P<().05表示有统计学意义. 2结果 2.1DS大鼠H—HF模型8NaCI负荷后第19 周,大鼠心脏及LVEDd和LVEDP增大,同时肺重 量也增加,并出现明显心衰表现(表1). 中国临床医学2008年8月第15卷第4期ClinicalMedicalJournalofChina,2008.Vo1.15,No.4451 表1两组血液动力学参数及其它超声心动检查结果比较 注:SBP收缩压;IVW左心室重量;LW肺重量;IVST 室间隔厚度;LVFS=左室短轴缩短率;LVEDd=左室舒张末期内 径;I,VPwT=左室后壁厚度;LVEDP=左室舒张末期压;与19W— C组比较,P<(】.05 2.2心肌中的CatK表达定量RT—PCR结果显 示H—HF大鼠心肌CatKmRNA表达显着高于 19W—C组大鼠和对照组(人)(P<0.05)(表2).H— HF组大鼠心肌CystCITIRNA表达低于19W—C 组,但差异无统计学意义(P>0.05).Insitu和免 疫组化分析显示对照组大鼠和人心肌CatK表达仅 有低水平(图A一1,A一3,B一1).以此相对,H—HF大 鼠和人心肌CatK的mRNA和蛋白质表达明显增 加并遍及心肌细胞(图A一2,A一4,B一2).H—HF组 大鼠心肌组织蛋白酶依赖性胶原蛋白分解能显着高 于19W—C组(3.5倍,P<0.01)(表2),其活性被选 择性组织蛋白酶抑制剂(E64d,20肚mol?L,51) 抑制. 2.3左心室间质蛋白合成及其纤维化RT—PCR 结果发现,H—HF大鼠心肌组织I型胶原,III型胶 原和纤维蛋白mRNAs表达均显着高于对照组 (203,99,289,P<0.01)(表2).Azan—Mal— lory染色分析结果显示H—HF大鼠心肌问质和血 管周围纤维化面积显着高于对照组(P<0.01)(图 2A,C,D).H—HF患者心肌间质纤维化率也显着 增高(图2B,E). 表2CatK和间质蛋白mRNAs表达及心肌胶原蛋白降解活性和纤维化率变化 注:与19W—C组比较,P<().05;与对照组比较,P<().05 A鼠B人 图1拈KmRNA和蛋白表达.免疫组化染色(A_1,A一2,I}1,13-2)和Insitu(A3,A一4)显示CatsSmRNA和蛋白表达主要在H—HF大 鼠(A)和患者(B)心肌细胞.阴性对照是正常兔免疫球蛋白替代一次抗体(A-5,B-3)或CatsKsenses替代antisenses(A_6),(刻度棒长度:25m). 452中国临床医学2008年8月第15卷第4期 A C 鼠 32 2.4 l6 O.8 O D r工] 19WC组HHF组 至 跚l2 驾 姐 墅6 薹s 耍0 B人 E 三 10 兰7.5 s 2.5 量. 19Wc组H.HF组坚对照组HHF组 图2心肌间质纤维化.Azan染色分析结果(A.B)显示H—HF组大鼠 (A.C,D)和患者(B.E)左心室肌问质纤维化率或(和)血管周围 纤维化面积均显着高于对应对照组.(刻度棒长度:25Fm).(“:15).与19W—C组或对照组比较.P<0.01 A IL.13l +E64d 图3培养心肌细胞的CatKmRNA表达及其胶原蛋白分解活 性的调节.心肌细胞免疫荧光染色(A)显示II一1B促进培养心肌细 胞的CatKmRNA表达.胶原蛋白分解能分析结果(B)表明培养心 肌细胞胶原蛋白酶依赖性胶原分解活性显着高于未刺激心肌细胞. (刻度棒长度:25Fm),(“=8).(与对照组比较,P<()()1;与IL一1S 刺激组比较,P<()01 2.4CatK的表达与心肌纤维化相关性心室肌 CatK表达与心肌间质纤维化的相关性分析显示, CatKmRNA表达量与左心室肌间质纤维化率呈 正相关(,.=0.68,P<0.01).提示心室肌的CatK mRNA表达可以反映心肌间质纤维化程度. 2.5左心室肌中的IB1表达和调节培养CMCs的 CatK表达及胶原蛋白分解活性的分析IL-~ImR— NA也在H—HF大鼠心肌中显着增高(表2).大鼠 心肌细胞免疫荧光染色和胶原蛋白分解活性分析显 示.在无刺激状态下CMCs的CatK表达和胶原蛋白 分解活性呈现低水平,而II『(20ng?mL)明显上 调其表达及胶原蛋白分解活性(图3A,B,P<0.01). 3讨论 本研究结果概括如下:(1)CatK的mRNA和 蛋白的表达在对照组大鼠或人左室心肌仅为低水 平,但其在H—HF大鼠或患者心肌中明显增加,并 集中在心肌细胞.同样,H—HF组大鼠心肌中的胶 原蛋白分解活性明显增加.(2)H—HF大鼠心室肌 CatK的mRNA表达和心室肌纤维化程度呈正相 关.(3)大鼠心肌IL—j31蛋白表达明显增加,并其 刺激培养心肌细胞的CatK蛋白表达及其胶原蛋 白分解活性. 高血压性心脏病的发生发展的基本病理机制是 心肌重塑,包括心肌细胞重塑及细胞外基质重 塑’一’.心肌纤维化是在心肌重塑发生发展过程中 最严重的病理改变.心肌受各种病理生理因素的刺 激后发生重塑是代偿性心肌改变和抗损伤修复的过 程.主要表现为细胞肥大,增殖.分泌细胞外基质 及细胞凋亡,导致心肌肥厚或变薄和心肌纤维 化一.细胞外基质是由胶原,蛋白聚糖,糖蛋白,糖 一一啦皿圃罨扭目 OOOO 5O5 752 一霉皿跚一曲i.H)凛嚣丑强蛩 B 中国临床医学2008年8月第15卷第4期ClinicalMedicalJournalofChina,2008.Vo1.15,No.4453 胺多糖和弹力纤维等大分子物质组成的动态网状结 构.细胞外基质通过与细胞表面受体相互作用以及 滞留多种生物活性分子等方式参与了细胞行为的调 节(包括基因的表达,细胞增殖,迁移,分化和凋亡等 过程)_1.生理状态下机体的细胞外基质的代谢 十分缓慢,病理条件下细胞外基质合成增加或降解 增强,从而引起组织形态,结构和功能发生相应改 变l1.已有研究表明,在半胱氨酸酶(cysteine protease)中,CatK可分泌到细胞外展示强有力的 胶原分解活性和弹力纤维分解活性[6”.,在细胞 外基质重塑的部位易于诱导表达,正常生理条件下 也发挥作用,半胱氨酸酶抑制剂C(胱抑素C,Cyst C)是Cats的内源性特异性抑制因子,故两者被认 为是调节细胞外基质动态平衡的重要酶系之一.敲 除CatK基因抑制血管壁ECM重塑,敲除Cysta— tinC基因反而促进血管壁ECM重塑?1”一.本研 究观察了在H-HF组大鼠心肌中CatK依赖性胶 原分解活性明显增高,CystCmRNA表达反而下 降并低于正常水平.近年来大量的研究表明在各种 原因引起的心室重塑发展过程中心肌中的ECM降 解蛋白酶与其内源性蛋白酶抑制剂水平的分离导致 两者之间动态平衡严重受损,可作为心室重塑发生 发展的一个重要机制.综上所述,Cats与Cyst C系统之间失衡是可促进ECM成分和结构改变, 有利心室重塑及纤维化并影响心功能. 有研究表明,IL—G1调节培养血管平滑肌细胞 纤维母细胞和巨噬细胞的CatK表达l_1.本研究 结果显示无刺激条件下在CMCs中CatK表达处 于低水平,而IL一18促进CMCs的CatKmRNA表 达和胶原分解活性.与对照组相比,H—HF大鼠心 肌IL一1t?mRNA表达显着增高.这些研究结果提 示心衰心肌中的CatK表达及其活性的增高与心肌 炎性介质系统的活化有相关,IL一1口可通过调节心 肌细胞的CatK表达来参与心脏重塑过程. 总之,CatK在正常人及大鼠心肌处于低水平, 而在高血压性心脏病心衰大鼠和患者心肌中CatK 过度表达并伴有CatK与CystC之间动态平衡的失 衡,CatK依赖性胶原蛋白降解活性增高与心肌纤维 化及心功能下降密切相关.CatK的升高既是心肌 炎性介质系统活化(如IL-I~)增多的结果,又可能诱 发心肌间质结构和成分的改变,造成心肌细胞支撑单 位的损伤,进一步加重心功能异常.因此,CatK是高 血压性心脏病心室重塑中间质纤维性病变的关键因 素,可作为判断心肌纤维化程度的辅助指标,并可成 为预防或逆转心肌重构的分子生物学靶标. 参考文献 1SpinaleFG.Bioactivepeptidesignalingwithinthemyocardial 2 3 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 interstitiumandthematrixmetalloproteinases[J].CircRes, 2002,91:1082—1084. 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