【doc】大鼠卵巢,睾丸人绒毛膜促性腺激素受体的比较研究
大鼠卵巢,睾丸人绒毛膜促性腺激素受体的
比较研究
5|26(3),
/
257~260
大鼠卵巢,睾丸人绒毛膜促性腺激素
7
受体的比较研究
?.
堡鲞塞堂塞:陈曼玲
1.激素受体研究皇,生锄化学教研室F2.药学院86级学生 内窖摘要以分离的细胞膜为受体制荆,对大鼠卵巢及睾丸^绒毛膜促性腺激紊
(HcG)受体进行
比较研究,发现二者的受体结合特性有一定差异同时将大鼠睾丸膜及睾丸匀浆作
对比.芨现睾丸膜棚
荆较睾丸匀浆更能确地体现睾丸HCG受体的真正特性. 关键词^绒毛膜促性腺激紊受体细胞膜匀浆卵巢睾丸 E一——一一——
已有研究证明,大鼠的卵巢及睾丸细胞膜
上均有人绒毛膜促性腺激素(HCG)的特异受
体".HCG受体研究国外多采用组织匀浆,
而使用膜制剂者国内外尚步报道我们已有的
研究表明,卵巢膜制剂较其匀浆的灵敏度大大 提高",本研究用大鼠卵巢及睾丸的细胞膜作
受体制剂,比较研究其受体特性,并对太鼠睾丸 膜及匀浆作对比.现将结果报道如下.
1
与
1.1材料
雌雄大鼠体重150g左右,由本校实验动物中心供 给.HCG35721U/rag(Sigroa).005mo]/LTris-HC1缓 冲蔽,pH7.5,舍0.1牛血清白蛋白7聚乙二醇,分 子量6o00,日本进口分装.o.42T-球蛋白
(Sigma)"I-HCG由基础医学院同位紊室提供.匀浆 缓冲藏,pH7.5.0.525mmol/LCac1i?2H2O,5mmol/
LNaHCO,.lmmol/LNaHCO,溶蔽,pH7.5.梯度蔗 糖藏(W/W)为37,41,45聒,70
1.2细胞膜受体制荆的制备
按文献4方法,将大鼠断头致死后.分别取睾丸和 卵巢,击除结缔组织.剪碎按100mg/ml加入Tris— HC{缓冲蔽.匀浆后用四层纱布过滤.撼蔽经超声振荡 3分钟,离心(121000xg)20分钟,取沉淀作蔗糖梯度 离心(78000Xg)2.5小时,收集3,,41蔗糖界面 四JI.省卫生厅科学基金资助
层,加入预拎的lmmo]/L的NaHCO稀释,再冷冻离 心(27000×g)25分钟.将沉淀溶于少量lmmol/L的 NaHCO,溶藏中,用Fo]in酚试剂法测蛋白质的含量. 1.3大鼠睾丸匀浆的制备
投上法.于超声撮蔼后.置低温保存备用
1.4受体绪台反应
按修改的Ryon法L进行在康氏试首中分别加入 受体制荆100~g.HCG51001U,"I-HCGlong,Tris— HC1缓冲藏朴足体积至5ml,置恒温(30"C)振荡(每分 钟6O次)水浴中,保温2小时,反应结束后,加入 0.42%T-球蛋白0.2m],7聚乙二醇1.2m],混匀后置 球水裕中20分钟,离心(1529xg)15分钟,测定各管总
放射性(T),弃上清液,再测沉淀物的放射性(B) 1.5计算
结合率()=(B/T)×100
B为I-HCG与受体的结合量(cpm)|T为加入 的"I-HCG量(cpm).
作Scatchard图分析.以B/F对应的结合HCG浓 度作图-横崖标截距计算得每璇克受体制剂结合的 HCG量,即受体的含量.F为加入的I-HCG减击B (cpm).
亲和力表示,是斜率的负倒数,即斜率1/ Kd,=一1/斜率.
2结果
2I大鼠9口巢与睾丸细胞膜HCG受体结合 抑制曲线的比较
华西医科大学26卷
见图l.从图t可见,卵巢及睾丸细胞膜均 能与HCG发生特异性结合,HCG对1一HCG 之结合有竞争性抑制作用,说明二者均有HCG 受体,但HCG受体结合抑制曲线可显示,睾丸 细胞膜较卵巢细胞膜下跌迅速,即少量HCG 能使睾丸膜的HCG结合达到最大抑制,说明 睾丸细胞膜HCG受体对ttCG更为敏感. 1o11oI
HcG【IU/m】)
图l卵巢细胞膜(…】和睾丸细胞膜'——.) 的HCG蹙体结台抑制曲线
Fig1Inhibitloa…veofHCGr~eptorofovarycell
m~brane(?——-)with~esviscellm~mbrane
f…1
1
2
×
?0
L51.0
B×10(tool/L)
图2卵巢细胞膜(…)扣睾丸细胞膜< 的HCG结合之Scatchard怍图
Fig2.S~atchard口}?,.,ovaryfeI】membranec-
withtisct】I~embrane(.——.)
2.2大鼠卵巢爰睾丸细胞膜的HCG受体数 量及Kd值的比较
卵巢及睾丸膜结合结果经Scatchard作图 可测得二者之受体数量及Kd,如表1.从表I 可见,二者在受体数量及Kd方面均有一定差 异,卵巢的Kd较睾丸大.Scatchard作图,如图 2所示,睾丸为一直线而卵巢呈一曲线. 2.3大鼠睾丸细胞膜与匀浆HCG受体结合 特性的比较
睾丸膜及匀浆制剂与HCG的结合抑制曲 线见图3.由图3可见,睾丸匀浆之抑制曲线下 跌较膜制荆缓慢.Scatchard作图分析二者均呈 直线(图4).受体数量及Kd从表2可见,其睾 丸细胞膜受体数量明显大于睾丸匀浆 表1卵重量睾丸细胞睦HCG受体敷量及Kd值的比较
TablelComparison口fbindingsitesefHCG愀p【0raad
affinity(Kd)ofovarycellmembranewitht鹧t ce!lmembrane
HCG<1U/m1)
图3睾丸细胞膜(…)及匀浆(…)的HCG 受锥抑制曲线
ng3lnblbition…HCGrep,or,t…l】-
brahe(…)with~estishomogen~te<?——?)
3期张蓉等.大鼠卵巢,睾丸人绒毛膜促性腺激素受体的比较研究
雹4睾丸细胞髌(——千?睾丸匀浆t)的H0锗合 之Scatchard作幽
Fig4Scotchardp]otoflestiscellmembrane(——) w1thTestish?nate(…一)
衰2搴丸细胞睦与宰丸匀浆的HCG受体数量噩Kd值 的比较
Table2CompansombindingsitesofHCG~%-eptor
andIffinlty(Kd)0ftestiseelln~mbrane'n曲 lestisbomogenate
3讨论
近年来HCG受体结构研究取得了很大的 进展.研究证明,HCG受体在同一种属或不同 神倩的动物性腺具有相似性J,如大鼠,小鼠 及拘的性腺HCG受体结构具有共同点.同时 该受体在同一种属的不同组织中与HCG均能 发生结合,但亦有关于大鼠睾丸和卵巢之HCG 受体具有不同结构的报道.本研究以分离 的细胞膜为材料,对大鼠睾丸及卵巢HCG受 体的结合特性进行了比较.所得结果表明.尽管 二者均有HCG结合位点.但从其结合特性(抑 制曲线.受体数量及亲和力)部有差异.随着受 体研究的进展,越来越多的事实说明.受体存在 亚型.如根据受体亲和力的大小不同可分为
两种亚型受体.一种为高亲和力构型受体,该受 体与激素形成的激素受体复合物的解离速度 慢,占据位少;另一种为低亲和力构型受体,其 解离速度快,但受体占据位多.本研究中(图3) 睾丸细胞膜HCG受体抑制衄线下跌迅速, HCG受体对未标记HCG很敏感,极少量的 HCG即可明显看出抑制,可能说明大鼠睾丸 HCG受体主要为低亲和力构型受体,当然,要 确定其亚型需进一步研究证实.
我们早期的研究已发现,大鼠卵巢膜制剂 与HCG的结合率为匀浆的1750倍J,匀浆制 剂对受体只能进行粗略,宏观的观察,膜制荆大 大提高了方法的灵敏度,易于观察膜上的徽细 变化.因此,在对HCG受体特性的研究上.用 睾丸细胞膜作受体制剂较匀浆更具优点. 由表2可知,睾丸膜制剂及匀浆与HCG 在结合特性上具有一定差异,膜制剂与HCG 之亲和力较匀浆制剂低,但受体容量却远远大 于匀浆制;}Il,其原固可能为睾丸匀浆中杂蛋白 很多.受体蛋白的纯化度较细胞膜差,因而每毫 克蛋白所含受体数量明显较低.同时,睾丸匀浆 由于受杂蛋白的影响.可能使亲和力较细胞膜 高,而细胞膜上的HCG受体则影响因素明显 减少.因此,膜制剂更能准确反映HCG受体的 真正特性,分离的细胞膜是观察受体特性的良 好受体制剂.
受体材料的来源是受体研究的关键问题, 国外多年来均采用大鼠卵巢作为HCG受{车的 研究材料,但每只大鼠卵巢量少.而睾丸重量为
卵巢的2O,4O倍,我们较全面地观察了睾丸
HCG受体特性,认为用睾丸作为HCG受体研
究的材料.与卵巢相比,具有来源丰富,价格低
廉等优点同时,在
生育等的应用科研中,
既往以女性避孕药物研究为主,随着人们对睾
丸HCG受体的结构及特性的深入研究,将可
能在男性避孕药物的研究方面有所突破.
26ll华西医科大学26卷
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编辑苏长椎
ComparativeStudyofHCGReceptorsinRatOvaryandTestis ZhangRongAnChonghuiCher~Manling
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torsincellmembraneofratovaryandtesticle.Inor—
dertomakeafurtherstudyonthecharacteristicsof theHCGreceptorsonratovaryandtesticle,wefo—
cusedoncomparingthosetwokindsofreceptors.Fur- thermore,wecontrastedthetestlcularcelImelnbrane withitshomogenates.Ratovarianandtesticleswere homogenizedandsonicedundericecoldconditions.
Thehomogenateswerecentrifugedat12100×gfor20
rainfollowingfiltration.After~sucrosedensitygradi—
entultracentrlfugation(78000×g.2.5h){orthepel—
Iets,theinterfacelayersbetween37%and41were collected.Thepelletsweresubsequentlysusper~dedin coldlmmol/LNaHCOIsolutionandrecentrlfugedat 27000Xgfor25min.
TheresuItsshowthattheeelImembraneofboth theratovaryandtesticlec目nbindtoHCGspecifically.
AsmallamountofHCGhasmoreevidentinhibitory effectorlthebindingintestisthanovary. Scatchardplotanalysisforthebindingassay yieldedaboundcapacityoftesticlecellmembraneof 4.5×10'mol/Fgprotein,Kdof1.6×10mol/L,
whereasitwas0.51×10一mol/vgprotein,aKd0f
1.69×10'mol/Linovariancel1membrane.
IncomparisonwithhomogenatesandcelImem—
brane,theHCGbindingactjtyoflaterismoresensl—
rive.
KeywordsHumanchorioniegonadotropinreceptorCellmembraneHomogenates