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高血流肺血管重建中内皮细胞NFκB活性研究

2017-11-02 37页 doc 68KB 14阅读

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高血流肺血管重建中内皮细胞NFκB活性研究高血流肺血管重建中内皮细胞NFκB活性研究 高血流肺血管重建中内皮细胞NFκB活性研究 单位代码: 分类号:. 学 号: 密 级: ◎ 茹办署 硕士学位论文论文题目:高血流肺血管重建中内皮细胞? 的活性研究 ? 、厂 。 。 作 者 业 专 导 师 合作导师 年月日原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体,均已在文...
高血流肺血管重建中内皮细胞NFκB活性研究
高血流肺血管重建中内皮细胞NFκB活性研究 高血流肺血管重建中内皮细胞NFκB活性研究 单位代码: 分类号:. 学 号: 密 级: ◎ 茹办署 硕士学位论文论文题目:高血流肺血管重建中内皮细胞? 的活性研究 ? 、厂 。 。 作 者 业 专 导 师 合作导师 年月日原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名: 丑堕型 期:丝旦:羔:望 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 期: 论文作者签名:要堕堕导师签名:速孟垒日 丝塑:三:塑山东大学硕士学位论 文 目 录 高血流肺血管重建中内皮细胞? 的活性研究 中文摘要? 英文摘要? 符号说明? 论文正文.. ? .? 日?舌对象与结果? 讨论? 结论? 参考文献. 综述:高血流介导的肺动脉高压与? 的相关性研究进展 综述正文一 参考文献. 致 谢??一 发表论文情况 学位论文评阅及答辩情况表。山东大学硕士学位论文 . :: .............................................................................. .............................................................................. ................................................................................. .................................................................................................................................................................. .................................................,........................................ ....................................................................................: ....................................................................................::; ....................................................................................:』.? ....................................................................................:; ...................................................................................:; .................................................................. ..............................................................................:; 山东大学硕士学位论文 高血流肺血管重建中内皮细胞? 的活性研究 专 业儿科学 硕士研究生于晓晓 导 师孙若鹏教授 中文摘要 研究背景 ,是儿童常见的先天畸形之 先天性心脏病 一,发病率为%~%,而肺动脉高压 ,可发生于 先天性心脏病演变过程的各个阶段,左向右分流型先天性心脏病导致肺动脉高压 的治疗成为目前国内外备受关注的临床问题。左向右分流型先天性心脏病时,由 于肺血流量增加,导致肺动脉切应力 ,增加,肺动脉内皮结 构和功能发生改变,可引起明显的血管内皮受损。内皮细胞受损后,破坏了内皮 的屏障作用以及内皮细胞和平滑肌细胞之间的肌一内皮连接,也损伤了内皮细胞对平滑肌细胞的调控作用,从而使血管平滑肌细胞 ,?失去控制而增殖,引起肺血管重建。肺血管重建是血管对外界环境变 化的一种适应性改变,同时又是肺动脉高压发生的病理生理基础。血管内皮细胞 ,处于直接与血流接触的界面,对血管壁正常 生理功能起屏障作用,又具有感受器功能,还是合成传导介质的中枢,将切应力 刺激转化为细胞的生物效应,因此,血管内皮对调控血管张力和肺动脉压力起重 要作用。如果增加的肺血流量 ,超过一定限度,使血管的反 应性增强损伤了内皮细胞对血管张力的调控机制,就可能导致肺动脉高压。 年,和首先从淋巴细胞核抽提物中检测到一种能与免 疫球蛋白轻链基因增强子 序列 特异结合的核蛋白因子, 称之为? 。此后人们发现它存在于许多类型的细胞中,包括血管内皮细胞、山东大学硕士学位论文 平滑肌细胞和心肌细胞。该因子能够和许多基因上启动子区域的固定核苷酸序列 结合而启动基因转录的功能,在机体的免疫应答、炎症 反应及细胞的生长调控等方面发挥重要作用,与多种心血管疾病的发生和发展有 关。? 是细胞内最重要的核转录因子,在许多细胞刺激介导的细胞信息的 转录调控中起核心作用,参与多种基因的表达和调控,是细胞激活的标志。能激 活 的因素很多,包括各种应激性刺激、多种炎性细胞因子如?、 、有丝分裂原、氧自由基、蛋白激酶等。当细胞受到上述刺激时,蛋 白激酶被激活,使 蛋白调节区的/磷酸化,进而端的个赖氨酸残基与遍在蛋白结合而发生遍在蛋白化。最后在蛋白酶小体的作用下 发生裂解,暴露出蛋白上的核定位信号,导致 复合体解 体,活化后的? 即迅速从细胞质移位于细胞核,入核的 二聚体与靶 基因上的 位点发生特异性结合,从而启动和调控相关靶基因的转录。 研究证实,血管内皮细胞受到外界因子刺激后,首先会激活? ,后者 与细胞粘附分子基因结合,使其表达上调,这些粘附分子的基因都含有? 的结合位点,在白细胞附着、侵入和迁移于血管中具有重要作用,? 的激 活被视为血管内皮细胞受损的始动机制之一。血管平滑肌细胞的增殖和游走 受许 多基因调控,? 的激活同样是血管平滑肌的必经始动环节。我们研究高血 流肺血管重建中内皮细胞? 激活状态以及介导的细胞生物学作用对肺动 脉高压形成的影响及其调控作用,将对了解肺动脉高压的成因和靶向性的干 预治 疗起重要作用。 研究目的 本研究通过检测高血流肺血管重建中肺动脉内皮细胞中? 的活性及 使用 阻断剂吡咯烷二硫基甲酸盐进行干预后的变化,有助于寻 找高肺血流引起的肺动脉高压的病理生理成因,通过调节? 的激活抑制肺 血管平滑肌细胞的增殖,为肺动脉高压的预防和治疗提供理论依据和新的途 径。 研究方法 只周龄大鼠编号,计算机随机分为个组,其中,分流组只, 手术后阻断组只,假手术对照组只,正常对照组只。将组和 组共只大鼠通过套管连接法建立左侧颈总动脉一颈外静脉分流,其中阻 山东大学硕士学位论文 断实验组只大鼠于术前开始腹腔注射,剂量为??, 术后持续注射周,组大鼠除了不进行颈总动脉一颈外静脉吻合外,其余手术 程 序与实验组完全相同。连续饲养周后,采用心导管术测量肺动脉收缩压,,计 算/;测压后开胸 取肺动脉、肺组织和心脏,计算右心室与左心室室间隔 / ,/的重量之比,估计右心室肥厚程度。肺组织 切片染色光镜下观察肺血管形态学改变,测量并计算中等血管中膜厚度所占 管 径百分比胍%;分离大鼠肺动脉内皮细胞,提取核蛋白,制备引物,通过 凝胶迁移率实验酬测定各组内皮细胞 与特定基因识别序列相结合的 活性。 研究结果 ?颈总动脉一颈外静脉分流导致肺循环血流量增加,/平均值为.? .;组肺动脉收缩压明显高于组.,组与组相 比差异无统计学意义.,组与组相比无明显差异。?与对照组 和组相比,组肺动脉管腔狭窄或闭塞,内膜增厚,部分内膜脱落,平滑肌 细胞排列紊乱、过度增生和肥大;组内膜肿胀,部分脱落,中膜无明显肥厚; 组与组相比无明显差异。组%及/与组相比无差异,组 及/明显高于对照组和组.,组%及/ 与对照组和组相比差异不明显.。?组? 活性明显高于 组.,组? 活性低于组.,而组与组相比无明 显差异。 研究结论 高肺血流所致的大鼠肺血管收缩和结构重建与? 的活性增强有关, 阻断剂可以通过阻断高血流所致的? 信号通路从而干预肺血管重建。 关键词:左向右分流型先天性心脏病;肺动脉高压;切应力;血管内皮细胞; . 血管平滑肌细胞;肺血管重建;? 山东大学硕士学位论文%% ., ,, ,? . , ,,,. , ,, ., ., , . . . . ,, . 山东大学硕士学位论文 , ? 一心., , 、 .一园 、 .一心 . 一国 , , . , , .., , , / , .’, , 一 , , 一?心 . .,一心, 一出, ?. , .., . 一 . 山东大学硕士学位论文一心曲 一出, 曲一心 . , , .,?. ; , . /; ; .%.,, ?,/ .:..,. ,山东大学硕士学位论文 ’ .. .窑 , , ; ; 血 ; , ,; .,% / 曲燃 口.;,% .? 一心 / 口.,口..?. . 一心 : ; ; ; ; ; ;一出. 山东大学硕士学位论文 符号说明 缩写 英文全称 中文名称 先天性心脏病 肺动脉高压切应力 融 血管平滑肌细胞 血管内皮细胞肺血流量 一 核因子一出 .仅 肿瘤坏死因子. 白介素. 核定位信号 心抑制蛋白伍吡咯烷二硫基甲酸盐凝胶迁移率实验 肺动脉收缩压左向右分流比率 / / 右心室与左心室室间隔 /、, ?%中膜厚度占管径百分比 磷酸盐缓冲盐水四溴乙烷 血管内皮生长因子内皮素 . 内皮素. 血管紧张素 ? 血小板源性生长因子前列环素 心钠素 山东大学硕士学位论文肾上腺髓质素 一氧化氮 一氧化氮合酶 一氧化碳 山东大学硕士学位论文 刖 罱 左向右分流型先天性心脏病 ,导致肺动脉高 压的发病机制是目前国内外备受关注的临床问题,目前较一致的观点是, 肺动脉高压的形成过程始于肺动脉血管内皮和平滑肌细胞的损伤。左向右分流型 先天性心脏病由于肺血流量增加,肺动脉内皮结构和功能发生改变,引起肺血管 重建,而? 的激活是血管内皮细胞受损的始动因素,也是血管平滑肌细胞 增殖、游走的必经环节之一。 因大量血流向肺循环冲击,使血管壁内皮细胞受到强大的牵张刺激和高 切应力的损伤。内皮损伤破坏了内皮的屏障功能及内皮细胞和平滑肌细胞之间 的肌一内皮连接,也破坏了血管内皮和肺循环所产生的血管活性物质之间的平衡 和内皮细胞对平滑肌细胞的调节,从而促使肺血管平滑肌细胞增殖、肥大、排列 紊乱,引起肺血管结构重建。业已证实,? 激活通路也存在于血管内皮、 平滑肌细胞和心肌细胞中乜。?【转录因子代表着一簇来自 / 二聚体复合物,转录子复合物调节着一组广谱基因,这组基因的功能存在于许多 种关键生物进程口。几个体内、体外的研究均已显示许多基因的转录调节在 血管 内膜的形成中起重要作用,是血管针对于血流动力学的影响而发生的反应。 家族成员在控制血管基因表达中起重要作用卅。研究在活体内模拟或近 似的反映一个使血管内皮细胞暴露于机械力的环境,激活的 作为证据, 证明了血管内皮细胞的改变受血流动力学的影响刊。研究证实,血管内皮细胞 受到外界因子刺激后,首先会激活? ,后者与细胞粘附分子基因结合,使 其表达上调,这些粘附分子的基因都含有? 的结合位点,在白细胞附着、 侵入和迁移于血管中具有重要作用。本研究采用建立高肺血流动物模型的方法, 测定实验组和对照组 的活性,及给予? 阻断剂后肺血管变 化和? 的活性。比较给予? 阻滞剂干预前后肺血管的病理差异,从 而确定? 的激活与肺血管重建的相关性。该研究结果能够有助于我们寻找 高肺血流引起的肺动脉高压的病理生理成因,通过调节? 的激活抑制肺血 管平滑肌细胞的增殖,为肺动脉高压的预防和治疗提供理论依据和新的途径。 山东大学硕士学位论文 材料与方法 动物和试剂、仪器 只周龄雄性大鼠购自山东大学医学院实验动物中心,平 均体重为,计算机随机分为个组,分流组只、手术后阻断 组只,假手术对照组只,正常对照组只。 试剂:.%型胶原酶,动脉内皮生长因子,核蛋白提取试剂盒购自美 国 公司,地高辛标记的 试剂盒购自美国罗氏公司 等。 仪器:监护仪?,离心机一和,光学显 、 微镜 和光源,电热恒温培养箱?一,,凝胶成像成像系统,电泳 振荡器 仪一,超净工作台??,培养箱 ?,石 蜡切片机?,切片漂烘温控仪?等。 建立动物模型 将组和组共只大鼠通过套管连接法建立左侧颈总动脉一颈外静脉分 流参照宋光民所述方法口,其中阻断实验组只大鼠于术前开 始腹腔注射,剂量为?。?,术后持续注射周,组大鼠除了 不进行颈总动脉一颈外静脉吻合外,其余手术程序与实验组完全相同。级连 续饲养周。 方法 .测量血流动力学和计算/ 右 用%水合氯醛./秣醉大鼠,分离大鼠右侧颈外静脉,取. 心导管,留取其前端约 ,将断端与号注射针头连接,针头尾端接三通开关, 后者一端接注射器,便于用肝素盐水冲洗心导管以防止凝血;另一端与压力 传感 器管道连接,转动三通阀门,即可通过监护仪显示获取导管远端传来的压力 变化 信号。穿刺暴露好的颈外静脉,将导管插入并慢慢推进,插入~即可达上腔 静脉,至达右心房,左右可进入右心室,左右可进入肺动脉。根据 监护仪所显示的压力曲线波形的移行变化来判断导管尖端的位置。记录肺动 脉收山东大学硕士学位论文 缩压后撤出导管,并计算/。 .收集肺组织和心脏 开胸后用缓冲液灌注冲洗后迅速剪下肺动脉,放入。.,青霉 素× /,链霉素/中;取肺组织,一部分多聚甲醛固定,一部分液 氮速冻,.冰箱中保存备用。同时剪下心脏。 .分离肺动脉内皮细胞并培养参照徐荣良所述方法改进嘲 .在超净台里用小镊子及眼科剪细心轻柔地尽量清除血管外膜上的脂肪和 结缔组织,用眼科剪轻柔地沿血管纵向剪开,用轻轻冲净血管内膜面血液; .将消毒过的底板平放在无菌大号培养皿中,上面平铺一乳胶膜,将剪开 的血管内膜面向上纵向平铺在乳胶膜上,由于乳胶膜的粘着,血管片很容易 铺平。 将槽孔对准血管片平放上槽孔板,使血管片的边缘压在槽孔之外,盖上盖板。 .戴无菌手套,在底板及槽孔板两端用文件夹夹紧。打开盖板,将预热至 ?的.%胶原酶型用注射器滴入槽孔内至深,盖上盖板,移至 孵箱 内消化消化时间视消化效果适当调整。 .取出消化槽,在超净台里打开盖板,用注射器针头轻轻抽吸冲洗数次后 吸出消化液,注入离心管,再用少量的冲洗数次后吸出一并注入离心管, /离,弃上清液,用培养液洗涤一次,同样离心后弃上清液,然 后用培养液接种于培养皿中。 .石蜡包埋、切片、胍染色、光镜观察肺组织及计量心脏指标参照国内相关 专家文献魄川对左向右分流肺动脉高压大鼠模型进行鉴定 .所取标本经固定一冲洗流水冲洗小时一脱水各级酒精一透明氯仿 一软蜡一硬蜡一包埋一切片染色后光镜观察肺血管形态。 .肺组织切片染色,光镜下观察肺动脉形态。测量直径在 的中等 动脉血管外径 ,,即横断面上外弹力膜之间的平均距离。 血管中膜厚度的测量为从外弹力膜到内弹力膜之间的距离,至少测量条中等 肺 动脉以计算血管中膜厚度所占管径百分比 ,%×/×%。 .将取下的心脏沿右心室与室间隔相连处剪开,用电子天平分别称量右心室 / 及左心室室间隔的重量,计算右心室与左心室室间隔 山东大学硕士学位论文 ,/的重量之比,估计右心室肥厚程度。 .提取内皮细胞核蛋白 步骤一收集细胞:吸弃培养基,用冰/磷酸酶抑制剂冲洗,吸弃冲洗 液,加入冰/磷酸酶抑制剂,用细胞刮棒小心的将细胞从培养瓶中转移至 预冷的锥形瓶里。在下离心细胞悬液,,弃上清,将细胞沉 淀物放于冰上。 步骤二分离胞质:在细胞沉淀中加入 ,抽吸 使细胞悬浮,将此细胞悬液转移至预冷的微量离心管中,冰上孵育分钟,加入 洗涤剂,在涡旋器上以最高设置涡旋,?条件下,微量离心机离心 ,;将上层悬浮液转移至一预冷的微量离心管里,一 储存以备用。将 沉淀物用于核内容物提取。 步骤三收集核物质:用 全溶解缓冲液使沉淀物重新悬浮,涡旋, 将悬液置于冰上,在摇床上以的转速孵育。高速涡旋后,? 条件下 离心,,将上清转移至预冷的微量离心管中一 储存, 上清中含所需的核蛋白。 .制备探针 基因卜 ,上链:’一 ’;下链:’ ’。’,’端都标记生物素地高辛。 .进行凝胶迁移率实验试验,美国罗氏公司地高辛标记的 试剂盒 .步骤 步骤一退火、标记寡核苷酸:在缓冲液中溶解互补的寡核苷酸链, ?孵育,缓慢冷却至?,用灭菌的缓冲液稀释到?/,添 加.或者的双链寡核苷酸和灭菌的双蒸水到最终容积为的反应 瓶中;对照反应添力的对照寡核苷酸和灭菌的双蒸水到反应瓶。将标记 缓冲液、:溶液、溶液、末端转移酶混匀,简短离心; ?孵育分钟然后放在冰上,添 .的终止反应,添力 的双蒸水到最终容积,得到最终浓度为/或者./的标记寡核 苷酸。 步骤二测定标记率:从管卜中力标记的寡核苷酸和标记的对照到尼龙 山东大学硕士学位论文 膜,在紫外光下或者?烘烤通过交联将核酸固定在膜上,把膜转移到含 有冲洗缓冲液的塑料容器中;??震颤孵育;封闭液中孵育 ;抗体溶液中孵育,检测缓冲液中平衡,把膜上 的一面向上放在显影夹里或者杂交袋内,加入.作液;用第二张显影 夹快速覆盖膜均匀的把底物展开,膜上不要产生气泡;孵育 。挤出 多余的液体,封闭显影夹的边缘。下孵育潮湿的膜加强的化学发 光反应,暴露于光或者成像装置。在检测反应最初的几小时内信号增强直到 达 到平台期,在以后的信号强度保持不变更多的暴露能达到所需的信号强 度,通过与标记的对照的寡核苷酸的稀释系列进行比较,检测标记的 量。 步骤三凝胶迁移反应:按说明在冰上配置电泳液,仔细混合后孵 育,然后放到冰上;每个样本加入带有溴酚蓝的的载入缓冲液后,立即 加入即将进行电泳移动的聚丙烯酰胺凝胶上。 步骤四 聚丙烯酰胺凝胶电泳:一天前在.缓冲液中准备%%的原始 聚丙烯酰胺凝胶。试跑胶满意后,加样本于凝胶上,在跑. 的凝胶。 步骤五印记和交联: 一、电印记: 、电泳后从胶中取出玻璃板 、在迁移缓冲液中用分钟时间平衡凝胶大小的一张尼龙膜 、把尼龙膜仔细的放到胶上一在胶和滤纸间避免气泡 、把层的纸在迁移缓冲液中预浸渍 、用玻璃棒在层的纸上滚动消除气泡 、从另外一张玻璃板中撤离一张的纸 、在胶的另一端加入层预浸渍的的纸 、把合成的夹层结构放入电印迹设置的电极之间 、迁移在××.的聚丙烯酰胺中进行 二、核苷酸的交联:。下烘烤膜?分钟:把膜放在预浸渍的 的的纸;交联在的探照灯下进行按照经验分钟。 山东大学硕士学位论文 步骤六化学发光检测:在洗涤缓冲液中冲洗膜约;在封闭液 中孵育;在抗体溶液中孵育;在洗涤液中冲洗两次; 在检测液中均衡;将膜放在显影夹里使有的一面向上,加入 工作液,用第二张显影夹快速覆盖膜均匀的把底物展开,膜上不要产生 气泡;下孵育;挤出多余的液体,封闭显影夹;下孵育湿膜 钟来增强发光反应;成像。 表示。 .所得结果进行计算机图像分析,用光密度值 .统计学处理 数据以均数?标准差?表示,应用 .统计软件进行检验, .为差异具有统计学意义。 山东大学硕士学位论文 结 果 分流手术过程中,组死亡只,组死亡只;观察期,组死亡只, 组死亡只,组死亡只。测压后处死动物时,有只组大鼠分流不通而被排 除。最后,组只,组只,组只,组只。全部分流大鼠/平 均值为.?.,提示分流通畅,肺循环血流量明显增加。 一、四组模型肺动脉形态学比较 与对照组相比,组肺动脉管腔狭窄或闭塞,内膜增厚,部分内膜脱落,平 滑肌细胞排列紊乱、过度增生和肥大;组内膜肿胀,部分脱落,中膜无明显肥 厚;组与相比无明显差异。图 二、肺动脉收缩压 , 组与组比较肺动脉收缩压明显升高,.;组与组相比较肺动脉 收缩压无明显差异,.;组与组相比无差异。 表 三、心脏指标变化 右室/左室室间隔即/:组与组相比明显升高,差异有统计 学意义,.;组与组相比,无明显差异,.;组与组相比较无 差异。 表 四、肺血管指标变化 组大鼠肺血管%与组相比明显升高,差异有统计学意义,.;而 组与组相比无明显差异,.;组与组相比较无差异。表 五、卜 活性比较 组大鼠 较组相比活性明显升高,差异有统计学意义,.; 组大鼠 活性较组降低,差异有统计学意义,.;组与组相比差 异最明显,.;而组与组相比较无差异。 表,图 山东大学硕士学位论文 附图表 图.四组模型肺动脉形态学比较 图圆圈斟 组 组 组 组 图.显示四组大鼠肺动脉内皮? 活性 山东大学硕士学位论文 表.四组的大鼠肺动脉收缩压比较 ? .士. .士. .士.? .士. ,:.注:. 表.四组大鼠的右心室与左心室室间隔的重量之比/? // .士. .士. 砀 .士. .士.注:水. 山东大学硕士学位论文 表.四组大鼠血管中膜厚度所占管径百分比删 ? .士. .士. .士.? .士.注:木. 表.四组大鼠 活性比较 ? . 值 士 . 钍. 士.母幸 士.事注:木. ,木:. , ,. 山东大学硕士学位论文 讨论 左向右分流型先天性心脏病是儿童常见的先天畸形,先心病所致的大量左向 右分流,心脏的血流动力学的异常可使肺循环发生相应的病理生理改变。早期患 儿可因肺血太多,肺顺应性降低,到晚期肺血管则可发生梗阻性病变,产生肺动 脉高压和青紫,最后患儿往往因咯血而死亡。所以左向右大量分流所致的肺血管 改变引起了很多学者的注意?羽。肺循环包括右心室、肺动脉、毛细血管及肺静脉, 其主要功能是进行气体交换,血流动力学有以下四个特点:压力低,约为正 常主动脉压力的/~/;阻力小,正常人肺血管阻力为体循环阻力的 /../;流速快,肺脏接受心脏搏出的全部血液,但其流程远较体循环 为短,故流速快;容量大,肺血管床面积大,可容纳血液,占全血量的 %。由此可见,出生后,左向右分流的存在导致了肺血管床的功能异常和结构 改变,以及肺动脉压的增加。肺动脉高压患者肺动脉的病理改变表现为内皮损伤、 增殖和血管平滑肌细胞的高度收缩。早在年就有研究显示,左向右分流型 患儿肺循环血流量增加和肺动脉压力升高,肺血管内皮细胞在剪切应力作用 下受损,细胞膜电位发生改变,离子通道开放,细胞质内钙浓度发生改变,激活 腺苷酸环化酶,通过第信使作用使环腺苷酸、环鸟苷酸激活蛋白激酶和磷酸化 反应,改变了的基因表达,使合成和释放增加钔。可以推测第二信使在 高血流肺血管重建中起非常重要的作用,本研究旨在揭示高肺血流作用于肺动脉 内皮细胞引发肺血管重建过程中 信号通路的活性变化及阻断剂对 的阻断作用。 本实验用套管连接法建立左侧颈总动脉一颈外静脉分流的方法建立高血流肺 动脉高压的模型,分流后,组大鼠模型肺动脉内皮肿胀,部分内膜脱落,平 滑肌细胞排列紊乱、过度增生和肥大,外膜基质增厚,及/较对照 组明显增高,表明高肺血流大鼠出现了肺血管重建及高肺血流导致了右心室肥厚 与对照组相比.。组的肺血管变化肯定了的阻断肺血管重建的作 用与对照组相比.。在此重建过程中,血管内皮作为一个中央感受器,对 损害性刺激例如低氧、剪切力、炎症和毒素做出反应。完整的血管内皮对维持正 常生理条件下血管平滑肌细胞的表型和血管的正常结构具有重要意义。一些异常 因素,如缺氧、机械剪切力、炎症、某些药物或者毒物等,可使肺血管内皮细胞结 山东大学硕士学位论文 构、功能和代谢发生改变,成为肺动脉高压发生的始动因素钔。研究表明,内皮 细胞作为血液与血管壁的界面,完整的血管内皮对维持正常生理条件下血管 平滑 肌细胞的表型和血管的正常结构具有重要意义。一些异常因素作用于内皮 可导致肺血管内皮细胞结构、功能和代谢的改变,成为肺动脉高压发生的始 动因素引。内皮损伤破坏了内皮的屏障作用及内皮细胞和平滑肌细胞之间的肌一 内皮连接,也破坏了血管内皮和肺循环所产生的血管活性物质之间的平衡和内皮 细胞对平滑肌细胞的调节,从而促使肺血管平滑肌细胞增殖,引起肺血管结构重 构。内皮损伤不仅可引起增殖和凋亡失衡,还可影响凝血过程。本实验在观察肺 血管时也可看到肺小动脉中血栓形成。而且,等研究发现左向右分流, 肺血管在受到较高的血流剪切力的同时,肺组织内血管活性成分及细胞因子等也 可能参与了肺动脉高压的形成过程钉。 年,和首先从淋巴细胞核抽提物中检测到一种能与免疫 球蛋白轻链基因增强子 序列 特异结合的核蛋白因子,称之 乜。 为 是一个多效能的核转录因子,在细胞静息状态下, 与 其抑制因子 相结合,使 以无活性的形式存在于细胞质中。当细胞受 到各种刺激如内毒素、创伤、机械力、高氧等后, 发生快速泛蛋白化及 蛋白酶解,? 即被活化,并很快易位到核,与靶基因的启动子区域 基序 结合,启动基因的转录和蛋白合成’引。业已证实,? 激活通路也存在于 血管内皮、平滑肌细胞和心肌细胞中。 家族成员在控制血管基因表达中起 重要作用‘?删。比较对照组与组的 活性,我们推测高血流切应力作用于 血管内皮,可能会激活 信号通路,而且,及分别在 年的研究也发现,机械力的干扰可能会调节 活性和易位,因此影响到基因 表达的调节?~。近年来国外通过对细胞牵张损伤模型的研究发现,细胞受到过 度牵张可使 活化,启动炎症基因转录,使大量的细胞因子释放乜’矧。体 外研究已经证明,高肺血流引起的切应力增加可诱导血管内皮释放促进平滑肌细 胞增殖的血管活性物质合成和分泌增加,如内皮素凹、血管紧张素 嘲、血管内皮生长因子啪、血小板源性生长因子嘞和新近发现的 血管活性肽?等,而使抑制平滑肌细胞增殖的细胞因子合成和分泌减少,如 前列腺素口?、心钠素口幻、肾上腺髓质素九、一氧化氮 山东大学硕士学位论文 嘲和一氧化碳嘲、硫化氢等。肺血管内皮细胞通过转化和摄取 作用,调节血液中血管活性物质的质和量,从而影响肺血管平滑肌张力。正常生 理情况下,内皮细胞主要产生各种生长抑制因子,以维持血管的正常结构,而在 病理条件下,各种刺激能诱导内皮细胞合成和分泌多种生长因子,促进肺血管结 构重建。既往研究已发现 家族成员特别是激活的/异源二聚体,当 血流动力学改变时,在新内膜形成过程中在血管细胞中表达随明。本实验研究发 现,高血流肺血管重建中肺动脉内皮细胞? 的活性增高,结合以上的研究 我们可以推测,高血流剪切力作用于肺动脉内皮细胞,激活一 信号通路, 启动基因转录,产生血管活性介质,肺动脉收缩和肺血管重建,导致肺动脉高压 的发生。本课题小组会继续进行以后的实验,来证实内皮素、血管紧张素、血管 内皮生长因子、血小板源性生长因子及前列腺素、心钠素、肾上腺素质素、一氧 化氮、一氧化碳在高血流肺血管重建中与? 信号通路的相关性。至于 在高血流肺血管重建中对? 信号通路的阻断作用机制有待于进一步研究。山东大学硕士学位论文 结论 本实验通过建立左侧颈总动脉一颈外静脉分流形成高血流肺血管重建的模 型,模拟患儿左向右分流型先天性心脏病肺动脉高压的形成,研究高肺血流刺激 肺动脉内皮细胞后其? 的活性变化及肺血管形态学变化。研究表明: 、高肺血流引发肺动脉高压的过程中肺血管重建是其形成的重要机制; 、? 阻断剂可以阻滞高血流肺血管重建从而缓解肺动脉高压的 进展; 、? 在高血流肺血管重建的肺动脉内皮细胞中活性增高,阻断 后的内皮细胞中活性降低; 、在高血流肺血管重建过程中,肺动脉内皮细胞是中央感受器,高血流剪 切力可以激活内皮细胞中? 信号通路,导致肺血管重建; 、阻断剂可以阻断? 信号通路从而干预肺血管重建,预防或治 疗肺动脉高压。 本课题小组会继续实验,以探索血管活性介质与? 靶基因产物的相 关性,从而进一步明确高血流肺血管重建过程中? 信号通路的作用方式。 我们研究高血流肺血管重建中内皮细胞? 激活状态以及介导的细胞生物 学作用对肺动脉高压形成的影响及其调控作用,将对了解肺动脉高压的成因 和靶 向性的干预治疗起重要作用。山东大学硕士学位论文 参考文献 ,.:. ,: . . 【】李小鹰主编.心血管疾病分子生物学】.北京:人民军医出版社,: . 【】 , , . : . , :...【】 , , . ,:. . , , 【】 , . ,,:。. . 】 ,。 , , . . ,,:。 【】宋光民,宋惠民,李德才等.套管连接法建立大鼠颈部心脏移植模型】. 中国器 官移植杂志,,:.. 【】徐荣良.酶消化法分离大鼠主动脉内皮细胞的改进方法【】.中国病理生 理杂 志,,:. 】赵翠芬,王丽娟,王志宇等.肾上腺髓质素前体不同活性肽段在肺动脉高压 大 鼠肺内的变化】.中国病理生理杂志,,:?. 】李福海,夏伟,孙若鹏./激酶在高肺血流肺血管结构重构中的表 达及其活性研究【】.中华儿科杂志,,:?. 】李晓惠,杜军保,唐朝枢.硫化氢供体对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺血管 结构血管活性多肽的影响】.中国医学科学院学报,,:.. 【】杨杰,王一彪小儿心脏病学理论与实践【】.北京:人民军医出版社,:山 东大学硕士学位论文 .. .】 ,,:. ... , , , . 】 . ,,:. ,【 】 .:. . ;: .,, 】 : . :卜. . , , , 】 . ,, :孓. , . , 】 , . ,,:.. , . , ,【】 ,,: . .. . 】 , , . ;:。. . , , 】 , : 。. , . . 】 , , , .山东大学硕士学位论文 . ,:? . 】 , . :。. . , , 【】 . ,:. , , 【】 . .,,:?. . , ,】 , . ,,:. , ,】 , . :? .,, : .】 , , 、析 . ,: ., , , 】 , .、析/ .. ,,: 【王新卫,伍伟锋,俸勇强.先天性心脏病患儿介入封堵术前后血浆血管紧张 素和血清一氧化氮水平的变化】.实用儿科临床杂志,,: . 【】 , , , .. ,,:. 】王小军,王文英,李亚蕊.内皮素、心钠素在左向右分流型先天性心脏病肺 动脉高压的相关性研究】.山西医药杂志,,:?. , , . 】 , 山东大学硕士学位论文.,, :.】 , , . .,:. ?栅 】 , , , . / . ,,:. . ,】 ,八 . ,:. . 【】 ,,? ,. ,:.山东大学硕士学位论文 综 述 高血流介导的肺动脉高压与? 的相关性研究进展 左向右分流型先天性心脏病?导致肺动脉高压的发病机制是目前 国内外备受关注临床问题。比较一致的观点是,肺动脉高压的形成过程始于肺动 脉血管内皮和平滑肌细胞的损伤。左向右分流型先天性心脏病由于肺血流量增 加,肺动脉内皮结构和功能发生改变,并引起肺血管重建,而 的激活是 血管内皮细胞受损的始动因素,也是血管平滑肌细胞增殖、游走的必经环节之一。 一、肺动脉高压的形成 、高血流机械力对血管壁的影响 左向右分流型先天性心脏病因大量血流向肺循环冲击,使血管壁内皮细胞受 到强大的牵张刺激和高切应力的损伤。内皮损伤破坏了内皮的屏障作用及内皮 细胞和平滑肌细胞之间的肌一内皮连接,也破坏了血管内皮和肺循环所产生的血 管活性物质之间的平衡和内皮细胞对平滑肌细胞的调节,从而促使肺血管平滑肌 细胞增殖,引起肺血管结构重构。内皮损伤不仅可引起增殖和凋亡失衡,还可影响 凝血过程。而这种损伤直接影响的程度取决于牵张刺激和切应力的大小、作用时 间和作用方向。先天性心脏病病人高血流速度及高切应力是发生肺动脉高压的重 要原因,如果得到及时纠正,如在婴儿早期得以行缺损修补术,那么肺动脉高压 会逐渐消失口。研究表明,内皮细胞作为血液与血管壁的界面,完整的血管内皮 对维持正常生理条件下血管平滑肌细胞的表型和血管的正常结构具有重 要意义,一些异常因素作用于内皮可导致肺血管内皮细胞结构、功能和代谢的改 变,成为肺动脉高压发生的始动因素嘲。 、病理改变 等研究,患者肺动脉的病理改变包括内皮损伤、增殖和血管 平滑肌细胞的高度收缩。众多研究发现,血流动力学改变可引起内膜增生和肥 厚畸’’。内皮细胞间质转变出现在肺动脉高压血管壁的重建中陋。在 动物模型中发现,野百合碱和体循环向肺循环分流引起的高切应力的综合作用可 导致明显的平滑肌细胞内膜增厚叫,并且检测到内膜细胞表达平滑肌细胞标记物 和纤维结合素们。肺血管平滑肌细胞的增生和肥大是肺血管结构重塑的主要病理山东大学硕士学位论文 特征,已证实血管中膜增厚的程度与左向右分流先心病肺动脉压力和外周阻力的 升高密切相关?。 肺血管收缩在肺动脉高压形成和肺血管重建中起重要作用幻。研究显示,先 心病肺动脉高压的患儿,随着肺血流的增加,会早期、有选择性的损害内皮依赖 性的肺血管扩张,使肺血管系统一氧化氮合酶的基因表达下降嘲,而在 维持肺血管张力方面起重要作用铂。 、血管活性物质及细胞因子等的影响 血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及血小板和单核一巨噬细胞能够 产生多种血管活性介质,正常情况下这些介质之间处于一种动态平衡,以维持肺 血管的正常生理结构和功能。在一些外来刺激下如高肺血流、低氧、毒物等, 这些介质的产生和分泌失衡,导致血管收缩、血管重构以及血栓形成,这是肺动 脉高压发生的重要机制。体外研究已经证明,高肺血流引起的切应力增加可诱导 血管内皮释放促进平滑肌细胞增殖的血管活性物质合成和分泌增加,如内皮素 、血管紧张素、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子 和血管活性肽?等,而使抑制平滑肌细胞增殖的细胞因子合成和分 泌减少,如前列环素:、心钠素、肾上腺髓质素、一氧化氮 和一氧化碳、硫化氢等。肺血管内皮细胞通过转化和摄取作 用,调节血液中血管活性物质的质和量,从而影响肺血管平滑肌张力。正常生理 情况下,内皮细胞主要产生各种生长抑制因子,以维持血管的正常结构,而在病 理条件下,各种刺激能诱导内皮细胞合成和分泌多种生长因子,促进肺血管结构 重建鄹。研究证实司,血管扩张剂例如、前列环素的低表达和血管收缩剂 如一的过度表达,不仅能影响肺血管紧张度,促使血管收缩,而且能促进 血管重建。研究发现,在血小板源性生长因子或转化生长因子 一砌刺激下内皮细胞能分化转移进平滑肌细胞。 等研究发现左向右分流,肺血管在受到较高的血流切应力的同时, 肺组织内血管活性成分及细胞因子等也可能参与了的形成过程钔。另外,对血 管壁的损害和刺激也可以降低抗重建介质的表达,例如一氧化氮合酶圆、前 列环素合酶口妇和肿瘤抑制基因啪,造成血管壁的病理性重建。 内皮素是一种强有力的血管活性的异构肽。既是一种内源性缩血山东大学硕士学位论文 管物质,又是一种平滑肌增殖剂,可促使肺动脉平滑肌细胞合成增加,促进 细胞增殖,导致肺血管壁增厚,肺血管阻力增加。等观察发现,时内皮细 胞合成明显增加啪,推测在肺动脉高压时血管内切应力增加,可刺激 前肽原斟的表达,促进的合成和释放。等发现肺动脉高压时? 升高与内皮细胞产生增多及清除减少有关,增加的一不仅能收缩肺血管,使肺 动脉压力及肺血管阻力升高,还可促进增生肥大,导致血管的异常改建嘞】。 在体和离体研究均证实?对肺动脉和静脉均有强烈的收缩作用。肺动脉平滑肌 细胞具有丰富的受体。呈时间剂量依赖性增加肺动脉压。有研究表明? 除收缩血管外,还可以通过刺激成纤维细胞趋化和繁殖参与肺动脉高压形成。 瞵发现老鼠肺动脉高压模型血浆一升高,且内皮素受体拮抗剂能有效 地阻止肺动脉高压的发展。 是一个有力的血管舒张剂,能直接抑制血小板活性和血管平滑肌细胞增 殖。血管内皮被许多血管活性因子和生理刺激如低氧、炎症、剪切 力和氧化刺激等调节。研究证实肺动脉高压患者的 及蛋白水平均较低, 且与肺动脉病变的严重程度密切相关,说明肺动脉高压患者,由于内皮功能受损, 存在一定程度的缺陷踟。等发现抑制原代培养的血管平滑肌细 胞增生,受损伤的血管处或局部给供体,升高局部水平,血管平滑肌增生速 度减慢。血管内皮生长因子在血管重构中起着保护作用,其机理可能是 通过介导生成增加,扩张肺血管,同时刺激肺内皮细胞保护血管壁的功能,延 缓和减轻肺血管重构的时间和程度。吸入治疗肺动脉高压已取得显著疗效啪, 而且研究已证实,是血管内皮 的抑制因子暖棚,也可作为治疗有效的证 据之一。虽然如此,和在中失调的确切机制还没被完全阐明。 左向右分流型动物模型表明,在由于肺血流量增多所致的肺动脉高压的 肺血管重建过程中,起重要作用嘲。也会引起内皮细胞和平滑肌细胞增 殖或者减少血管细胞凋亡跚。在的迅速进展期,也就是血管内皮细胞增生、 分裂活跃期,血清含量增高明显,其原因是先心病大量分流引起肺血管的血 流量及压力增加,造成肺内皮细胞剪切损伤,使细胞变形、影响细胞骨架,导致 细胞膜电位发生改变、离子通道开放,细胞浆内钙改变,激活腺苷酸环化酶,使 第二信使、传导信号,激活蛋白激酶和磷酸化反应,从而改变基因山东大学硕士学位论文 表达,使合成和释放增加。出现艾森曼格综合征后,血清含量明显下降, 其原因可能与此时肺血管重建已基本完成,肺细小血管内皮细胞及平滑肌细胞增 生减缓有关。 研究发现,引起肺血管反应的活性物质还有前列环素、血管活性肠肽、电压 门控性钾通道等多种血管活性介质,其对肺血管系统的影响见表。 二、 信号通路及其在血管重建中的作用 、 的构成及激活途径 是具有多种生物学作用的核转录因子,是诱导基因表达的结合蛋 白。年,和首先从淋巴细胞核抽提物中检测到一种能与免疫 球蛋白轻链基因增强子 序列 特异结合的核蛋白因子,称之 为? 。这个家族以同源或异源二聚体的形式存在包括个成员:/, ? ?, 。最广泛表达的复合物就是经典的卜 ,由的 亚基和的亚基构成/。这种二聚体潜在于各种类型的细胞中,与 结合以失活 状态存在于细胞质中, 复合物的生成一般受细胞外各种 刺激的影响。当细胞受到刺激, 蛋白会迅速的被复合物磷酸化,接着被 蛋白酶小体所降解,使卜 从抑制蛋白 解离出。有活性的 转入细胞 核,与特异的位点所谓的 位点相结合,激活特异的靶基因的表达。迄 今为止,已证实为 调控的靶基因产物有细胞因子、酶、粘附分子和受体四 大类型。包括血管细胞粘附分子.、胞间粘附分子.、内皮白细胞粘附分子.、 组织因子、诱生型一氧化氮合酶、诱生型环氧合酶、巨细胞菌落刺激因子、 单核 细胞趋化蛋白.、血管紧张素原等,从而引起细胞粘附、增殖、分化、炎症反 应 和凋亡口’别。? 主要参与胞质胞核的信号转导,但不同细胞中 诱发 基因表达的强度和速度是不同的,主要取决于核苷酸序列与? 的亲和力。 能够激活? 的刺激有多种,包括细菌、病毒、原虫、生理性刺激如 出血、高氧症、高渗休克、局部缺血、剪切力、物理性刺激如辐射、氧化 应激如臭氧、过氧化氢、环境毒素香烟、石棉、重金属、、治疗性药 物如、顺铂、阿霉素、足叶乙苷、弗哌啶醇、他莫昔芬、生理介质如补 体、、白三烯、、血小板激活因子、生长因子胰岛素、血小板源性生长 山东大学硕士学位论文 因子、碱性的成纤维细胞来源的生长因子、?和感染性细胞因子如 卜、、、、、、、、,当 受到这些刺激因素的作用,在蛋白激酶和蛋白磷酸酶的参与下, 发生磷酸化 和遍在蛋白化,从卜 聚体上解离,暴露蛋白的核定位信号, 被 激活,并移位进入细胞核,与链上特异部位结合,启动基因转录。因此, 通过对各种刺激的应答而激活多种前炎性基因,起到应激反应的中心调节子 作 用。 、? 信号网络的调控 等嘲经过一系列的显性负性结构和功能测定法发现, 信号途径 一共有个正性调整基因和个负性调整基因,这些调整基因被映射到信号级 联放大系统。大多数正性调整基因作用在激酶的复合体 ,许多负 性调整基因位于 亚基的下游区,在这个系统内形成了 一个附加的负性控制层面。调控基因在水平不均匀的表达分布在各种组织中, 使信号网络结构具有弹性,存在于一种组织的正性和负性调控基因的数量高度相 关,提示在组织水平正性和负性调控是平衡的。等哺’研究最终发现,对于 有强大系统特征的 网络来说,调整基因的相对位置是与沙漏结构或称为 “蝶形领结结构图高度一致的。调整基因的组织分布和负性调整基因的 下游位置在系统内起着控制层面的作用,使系统对不同的刺激做出有差别的反 应。在功能性基因的筛查中鉴定出的这个正性调制子和个负性调制子提供 了对? 网络系统宽度的更好的理解。正性调制子来自于一个功能分类的多 样化排列,反映出刺激范围的宽度和? 网络的交叉耦合,而负性调制子相 对较单一,更集中于下游过程。调制子的这种相对位置产生的信号网络图谱显示 大多数阳性调制子作用于的上游和复合物,而少数在,这与以前 的研究在/分支中,大多数串扰相互作用集中在和以下区域 铂相一致。此研究结果更加证实了先前的观察:三个、和 呈现在信号网络的一点,是大多数信号途径的聚合点汹一。作为“时漏或 称为“蝶形领结’’结构的中轴是以许多壮实系统为特征的?’柏川。 等的研究发现在? 网络途径中,调制子的相对位置和他们在组织 中的分布,被用来鉴另中的多系统控制,最后产生反应的特殊性和多样性。 山东大学硕士学位论文 阴性调制子抑制? 信号通路的位置相当于 蛋白。等研究发 现不同的 蛋白负性调节? 信号的功能不同。 转录表达的产物包 括使? 进入细胞核内的细胞因子,这种正反馈机制会引发更为严重的后果 删。但负反馈机制可以确保一个启动信号的瞬时反应,阻止过度的、不受控 制的 炎症反应。等阻研究首次发现血小板内皮细胞粘附分子 也牵涉在负反馈调节机制中。研究已证实,是血管内皮 的抑制因子溉蚓。 近来研究发现,许多种信号途径和亚系统在不同的结点与卜 途径交叉耦 合, 并调制.【信号。例如. 四,嘲,‘, 蛆,【“嬲。交叉耦合的广泛存在, 加上卜网络的分支结构,最终形成一个复杂的、相互联系的系统。过去对卜 网络一样受体? ,分支的研究提示交叉耦合的广度 使卜 网络具有对不同的刺激产生有差异的反应的能力呻。近几年研究的 ? 信号途径的上游及下游通路,如图。 、? 是高血流肺血管重建中的重要转录因子 业已证实,? 激活通路也存在于血管内皮、平滑肌细胞和心肌细胞中。 ?转录因子代表着一簇来自?/家族的二聚体复合物,转录子复合物调 节着一组广谱基因,这组基因的功能存在于许多种关键生物进程嘲。研究显示, 许多基因的转录调节在血管内膜增殖的形成过程中起重要作用,此作用是血管受 血流动力学的影响而发生的反应。 家族成员在控制血管基因表达中起重要 作用‘蹦幻。研究在活体内模拟或近似的反映一个使血管内皮细胞暴露于机械力的 环境,激活的 作为证据,证明了血管内皮细胞的改变受血流动力学的影响 ‘蹦刳。研究证实,血管内皮细胞受到外界因子刺激后,首先会激活? ,后 者与细胞粘附分子基因结合,使其表达上调,这些粘附分子的基因都含有? 的结合位点,在白细胞附着、侵入和迁移于血管中具有重要作用,? 的激
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